CN109536456B

CN109536456B - 识别pcv2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测pcv2病毒样颗粒中的应用

Info

Publication number: CN109536456B
Application number: CN201811261025.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡雪辉; 孙明霞; 涂亚斌; 王淑杰
Original assignee: Harbin Weike Biotechnology Development Co; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Weike Biotechnology Development Co; Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: CN109536456A

Abstract

本发明公开了一种识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒中的应用。其中，能够特异性识别猪圆环病毒2型病毒样颗粒的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.15793的杂交瘤细胞株分泌产生。通过间接免疫荧光实验鉴定所得到的单克隆抗体3H9的特异性，结果表明该单克隆抗体可以特异性识别PCV2病毒粒子，并且能够与PCV2 VLPs反应，而不与线性cap蛋白包被的ELISA板反应。因此，本发明建立了一种可以同时定性和定量分析PCV2 VLPs的简便方法，解决了PCV2 VLP粒子结构检测仪器昂贵，操作困难以及定量方法不能区分非特异性蛋白和破碎亚基的问题。

Description

识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测 PCV2病毒样颗粒中的应用

技术领域

本发明涉及一株识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，还涉及该单克隆抗体在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)中的应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

在疫苗研发，生产的各个环节，如菌种鉴定培养、分离纯化、产品检测等各个环节均需要对疫苗有效成分进行定性和定量分析检测。在菌种培养发酵，蛋白纯化，疫苗配制过程对疫苗有效成分VLPs进行定量检测分析，快速准确地对疫苗进行分析表征，对于建立和优化分离纯化工艺，提高产品质量、降低生产成本，以及确保疫苗安全有效都具有重要的意义。与其他生物分子相比，VLP疫苗往往分子量更大 (分子量高达数百万甚至数千万)、结构更加复杂(多个亚基组装)、稳定性差，因此，选择合适的分析方法显得尤其重要，建立准确可靠的分析方法的难度也更大。

目前，对VLPs进行定性分析，鉴定VLPs结构及组装的完整性和正确性有多种方法，但是均需要特殊的仪器完成，在生产过程中操作比较困难。主要方法有如下几种：

圆二色光谱(CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法和主要研究手段之一，是研究蛋白质构象的一种比较快速、简单、较准确的方法。它可以在接近其生理状态的溶液状态下测定，对构象变化灵敏，已广泛应用于蛋白质的构象研究中。蛋白形成聚集体VLPs之后，构象通常会发生变化，其α-螺旋的比例下降，β- 折叠的比例增加。因此，在VLP疫苗的研究中，CD主要用于疫苗的二级结构分析、疫苗样品和标准品等的比对以及疫苗结构变化的表征分析。

透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)技术作为快速检测病毒的常用手段之一，在病毒检测中发挥着异常重要的作用。TEM的分辨率最小可以达到0.1nm，可以看到在光学显微镜下无法看清的亚显微结构或超微结构，它是迄今为止能够直接观察病毒和VLP疫苗颗粒具体形态的主要方法。

冷冻电镜及X光晶体衍射可以得到高分辨率的病毒粒子或VLP结构，分辨率远敢于透射电镜，是一种更精细的直接观察病毒和VLP颗粒具体形态的方法。

超速离心技术是VLP疫苗的检测中不可或缺的一种方法，主要包括差速离心法和密度梯度离心法。同时，超速离心也是一种小规模纯化VLP疫苗的有效方法，可以浓缩和纯化VLP疫苗，供后续分析和其它性能表征。分析型的超速离心技术还可以直接测定VLP疫苗的浮力密度和和沉降系数。

高效液相体积排阻色谱(High Performance Liquid Size ExclusionChromatography, HPSEC)主要用于VLP疫苗分子量、纯度和含量的测定。HPSEC通过标准VLP疫苗样品在分析柱上的保留体积，可以大致判断纯化样品的分子量。一般VLP疫苗的分子量与其亚基的分子量相差较大，通过HPSEC很容易的将完整的VLP与亚基分开，进而可以对纯化样品中疫苗颗粒的完整性进行快速的检测。同时HPSEC灵敏度高，能够达到微克级的检测，用不同浓度的标准样品建立浓度-峰面积(或峰高) 的标准曲线，可以实现对微量疫苗样品的快速、准确定量。

建立可靠的和可重复的定量分析方法也是疫苗研发生产的关键技术之一，为了保证分析方法可靠，必须对定量方法充分验证。主要考虑一下几点：特异性，保证样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物；标准曲线和定量范围，应提供标准曲线的线性方程和相关系数；定量下限；精密度，用质控样品的批内和批间变异系数(CV)来考察方法的精确度；准确度，在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度。

对亚单位疫苗的抗原定量，常规方法有电泳(PAGE)，酶联免疫吸附(ELISA)，对于纯化的样品成分可以用基于蛋白特性定量的BCA或紫外分光光度法进行浓度测定。此外还有上述定性分析提到的高效液相体积排阻色谱方法。

酶联免疫吸附(ELISA)目前蛋白检测中最为常用的一种方法，广泛用于抗原或抗体的定性和定量分析。ELISA法具有灵敏度高、特异性强、检测迅速、操作简单易于自动化，可以批量测定，便于放大应用等优点。ELISA在VLP疫苗体外活性测定中也具有重要的应用，在测定时，把受检标本和酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。通过洗涤除去多余抗原，最后结合在固相载体上的酶的量与样本中受检物质的量成一定的比例。加入有色的酶的作用底物后，即可根据颜色反应的深浅对受检物质定性或定量分析。由于酶的高催化效率，可极大地放大反应效果，从而使测定方法具有很高的敏感度。

电泳(page)可以对VLP纯度进行分析及半定量分析。一般VLP疫苗分子大，难以用非还原电泳进行表征；还原电泳在样品处理时加入了还原剂(DTT或巯基乙醇)，可将VLP疫苗打开，完全还原成单体的形式。SDS-PAGE电泳与荧光标记二抗的Western Blot结合，可以实现对病毒亚基的定量分析。

然而，对于VLPs的定性分析，鉴定VLPs结构及组装的完整性和正确性的方法均需要特殊的仪器完成，在生产过程中操作比较困难。圆二色光谱方法检测的是蛋白的二级结构，需要很高的样品纯度，测量用的圆二色谱仪价格在百万元左右，不适用于疫苗生产企业；透射电镜、冷冻电镜和X光衍射同样存在仪器的问题，且样品制备困难，需要染色、固定、干燥、高真空下电子轰击，或者晶体结构形成，操作难度较大，目前仅应用于研究阶段；超速离心技术需要通过测定的浮力密度和沉降系数来评价VLP质量，但是这些指标的测定在不同操作者甚至同一操作者不同次操作会有一定差异，因此主要应用于VLP的纯化，浓缩；HPSEC用于VLP疫苗的定性和定量分析，但是需要对分子形状做出预先假设，步骤繁琐而且误差较大。还需要采用一组已知分子量的单分散相标准品在同样条件下作一系列色谱图和校正曲线，依次作为数据处理的基准，增加了分子量测定的难度，延长了实验时间，降低了分析结果的可靠性，测得的分子量的误差有可能很大。另外，在HPSEC过程中，样品与介质间的非特异性相互作用也可以降低分析结果的准确性。

定量分析方法的缺点主要有：电泳对照已知浓度的标准品可以实现对样品的半定量，但是往往只能检测VLP疫苗的纯度和亚基的分子量，无法表征VLP疫苗的整体分子量和结构的完整性与变化情况；用BCA方法测定蛋白含量，但BCA定量为非特异性蛋白化学反应定量，同样不能特异性鉴别VLPs结构完整性及其纯度，且操作复杂。由于VLPs蛋白在浓度较大时会形成可逆性沉降，产生沉淀。用BCA 方法测定VLP蛋白含量，存在稀释倍数越大最终得到的蛋白浓度值越高的情况；紫外分光光度值测定同样不能特异性鉴别VLPs结构完整性及纯度，且每种蛋白的吸光值差异很大，需要进行换算。

因此，目前迫切需要建立一种可以同时定性和定量分析VLPs的简便方法，解决VLP粒子结构检测仪器昂贵，操作困难以及定量方法不能区分非特异性蛋白和破碎的亚基的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株能够特异性识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明的目的之二在于提供一种用于定性以及定量检测PCV2病毒样颗粒的双夹心ELISA检测试剂盒；

本发明的目的之三在于提供一种用于定性以及定量检测PCV2病毒样颗粒的双夹心ELISA检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明采用大肠杆菌表达并组装的PCV2病毒样颗粒免疫小鼠脾细胞与sp2/0 细胞融合后亚克隆筛选得到一株可以特异性识别PCV2 VLPs的单克隆抗体，该单克隆抗体可以特异性识别PCV2 VLPs构象表位，区分形成完整颗粒结构的VLPs与普通表达的cap蛋白单体及其他非特异性蛋白。应用该单克隆抗体我们构建了一种双抗夹心ELISA试剂盒用于PCV2 VLPs亚单位疫苗的定性和定量分析，对正确组装的VLPs进行质量控制和对蛋白含量快速准确、特异性的定量分析。实验证明，采用本发明所述双夹心ELISA试剂盒检测PCV2VLPs准确可靠，可重复，其中所含的单克隆抗体仅与组装正确的VLP发生特异性抗原抗体反应，可以确保特异性，保证样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物；其次，定量分析方法标准曲线稳定，相关系数R2＞0.98；质控样品的批内和批间变异系数 CV＜5％，具有良好的精确度；检测范围在0.293-75ug/ml，具有良好的线性关系，最低检测下限为146.48ng/ml。

在上述研究的基础上，首先，本发明提出了一株能够稳定分泌特异性识别PCV2VLPs单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为3H9，分类命名为分泌抗PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.15793，保藏时间为2018年6月6日。

其次，本发明还提出了由所述的杂交瘤细胞分泌产生的能够特异性识别PCV2VLPs的单克隆抗体。以及所述的单克隆抗体在检测PCV2病毒样颗粒中的用途。

再次，本发明还提出了一种用于定性及定量检测PCV2病毒样颗粒的双夹心 ELISA检测试剂盒，其中含有本发明所述的单克隆抗体、兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体以及HRP标记的羊抗兔多克隆抗体。

其中，优选的，所述试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭液、稀释液、显色液、洗涤液、终止液、HRP偶联物稳定/稀释剂以及PCV2 VLPs标准品。

其中，优选的，用于猪圆环病毒2型病毒样颗粒检测时，按照以下步骤进行：

(1)本发明所述的单克隆抗体(3H9)用包被液按照1:12800稀释，每孔100 微升加入到ELISA板，4℃包被过夜；

(2)对包被好的ELISA板用洗涤液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；加入200微升/孔封闭液到ELISA板，37℃封闭2小时；

(3)用PBS调整PCV2 VLPs标准品浓度为600μg/ml，2倍比稀释后得到梯度稀释后的PCV2 VLPs标准品；

(4)取各稀释度的PCV2 VLPs标准品和待检测样品各100微升，分别加入封闭好的ELISA板，37℃孵育1小时；

(5)孵育完毕后ELISA板用PBST溶液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；

(6)兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体按照1:3200稀释，每孔100微升加入ELISA 板，37℃孵育1小时；

(7)用PBST溶液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；HRP标记的羊抗兔多克隆抗体用HRP偶联物稳定/稀释剂按照1:10000稀释，每孔100微升加入 ELISA板，37℃孵育1小时；

(8)抗体孵育完毕后ELISA板用洗涤液洗涤4次，每次5分钟；

(9)每孔加入显色液100微升，37℃反应10分钟，每孔加入50微升2M硫酸终止反应；

(10)将酶标仪设定检测波长为450nm，在10分钟内对ELISA板进行读数，测定吸光值；将标准品浓度对数值为横坐标(X轴)，相应OD值为纵坐标(Y轴)，绘制标准曲线图，将待测样品的吸光值代入方程，计算蛋白质含量。

其中，优选的，所述的包被液为50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH9.6；所述的封闭液为含1w/v％BSA的0.01M PBS溶液，pH 7.6；所述的稀释液为0.02M PBS 缓冲液，pH7.0；所述的洗涤液为含有0.5v/v％Tween20的0.1mol/L PBS溶液，pH 7.6，使用时稀释10倍；所述的显色液为TMB显色液；所述的终止液为2M硫酸。

其中，优选的，标准曲线图的R2值应不低于0.9800。

该方法可以应用于PCV2 VLP疫苗的研发，生产和质检环节，对提高产品质量，降低生产成本，确保疫苗安全有效具有重要的意义。

附图说明

图1为目的蛋白的SDS-PAGE结果；

其中：1、2、3不同批次转化菌株，M为蛋白Marker；

图2为western blot(WB)鉴定cap蛋白的抗原性结果；

图3为表达目的蛋白小量纯化SDS-PAGE图；

其中：1-5分别为1000，500，250，125,62.5mg/ml BSA蛋白，6-10分别为倍比稀释的纯化蛋白，M为蛋白Marker；

图4为扫描电镜观察病毒样颗粒；

图5为3H9抗体纯化SDS-PAGE图；

图6为间接免疫荧光实验；

其中：A：3H9；B：阴性血清；

图7为两株抗体与线性化cap蛋白western blot(WB)反应；

图8为蛋白定量标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1特异性识别猪圆环病毒2型病毒样颗粒的单克隆抗体的制备

1、PCV2 VLPs的制备

(1)克隆PCV2 cap蛋白基因连接到PET-28a表达载体中，酶切鉴定克隆正确插入后，测序鉴定重组质粒序列正确。将重组质粒转化表达菌BL21进行诱导表达，收集菌体经高压均质机破菌，硫酸铵沉淀后复溶，SDS-PAGE电泳结果显示，在 27KD大小有明显的条带，符合cap蛋白分子量(图1)。

(2)将表达蛋白进行westernblot鉴定，菌体蛋白经SDS-PAGE并转印到PEDV 膜上，经his标签抗体鉴定，结果显示有27KD大小目的条带，表明cap蛋白得到正确表达(图2)。

(3)蛋白纯化及鉴定：将收集的表达菌按照上述方法破碎，细胞上清经反复硫酸铵沉淀纯化，得到较高纯度的蛋白(图3)。

(4)PCV2 VLPs的组装：cap蛋白在适当的缓冲体系里面体外即可以自组装成 PCV2VLPs，缓冲液组成为：0.1M NaH2PO4,0.1M Na2HPO4,20mM imidazole,10 mM Tris base,300mM NaCl,50mM KCl,2mM MgCl2,0.1M ammonium citrate,and 5％glycerol,pH 8.0。扫描电镜能够观察到形态均一、圆形空心、大小与PCV2病毒大小相似的病毒样粒子，见图4。

2、单克隆抗体的制备

用纯化后的PCV2 VLPs按照100ug/只小鼠进行三次免疫，测定抗体效价可以达到1:12800加强免疫4天后，取小鼠脾脏与对数期生长的SP2/0细胞进行融合，用建立的间接ELISA方法进行筛选，得到一株可以高效、稳定分泌表达抗PCV2 VLPs单克隆抗体的杂交瘤细胞。对该杂交瘤细胞进行4次亚克隆，并进行连续传代，得到可以稳定表达抗PCV2 VLPs的细胞系3H9。该细胞株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.15793，保藏时间为2018 年6月6日。

将3H9杂交瘤细胞注射到小鼠体内，大量制备腹水，并经过protein G柱子进行纯化，得到了高纯度的单克隆抗体(图5)。对抗体效价进行检测，其效价达到 1:6400；蛋白浓度为1291ug/ml。

3、单克隆抗体的特异性鉴定

通过间接免疫荧光实验鉴定所得到的单克隆抗体3H9的特异性，间接免疫荧光实验结果表明该单克隆抗体可以特异性识别PCV2病毒粒子(图6)，并且该单克隆抗体特异性与PCV2 VLPs反应，而不与线性cap蛋白包被的ELISA板反应，而对照抗体2G8(与3H9同批次筛选得到)可以识别VLPs和线性化cap(表1)；WB实验表明，其表位为构象表位，不能识别经过SDS-PAGE变性的cap蛋白(图7)。以上结果证明该单克隆抗体3H9可以特异性与PCV2-VLPs反应，而不能与普通线性表达的cap蛋白反应。

表1抗体与cap蛋白及VLPs蛋白间接ELISA

	cap	VLPs
			3H9	0.403	3.15
3H9	0.199	3.202
			3H9	0.628	3.09
3H9	0.458	3.179
			HIS	3.54	0.808
2G8	3.331	3.793
			BSA	0.72	0.492

实施例2双抗夹心ELISA定量试剂盒制备

1、用3H9单克隆抗体作为包被抗体，兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体以及HRP 标记的羊抗兔多克隆抗体作为检测抗体，建立双夹心ELISA检测方法，对VLPs蛋白浓度进行分析。

2、双抗夹心ELISA定量试剂盒的操作流程

(1)3H9单克隆抗体用包被液(50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH9.6)按照 1:12800稀释，每孔100微升加入到ELISA板。4℃包被过夜；

(2)对包被好的ELISA板用PBST溶液(含有0.5v/v％Tween20的0.1mol/L PBS 溶液，pH 7.6，使用时稀释10倍，下同)洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟。加入200微升封闭液(含1w/v％BSA的PBS溶液0.01M，pH 7.6)到ELISA板， 37℃封闭2小时；

(3)用BCA方法检测PCV2 VLPs蛋白含量，用PBS调整PCV2 VLPs浓度为 600μg/ml。将PCV2 VLPs进行分装，冻存备用。2倍比稀释后作为PCV2 VLPs标准品。

(4)取各稀释度标准品和待检测样品各100微升，分别加入封闭好的ELISA 板。37℃孵育1小时。

(5)孵育完毕后ELISA板用PBST溶液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟。

(6)兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体按照1:3200稀释，每孔100微升加入ELISA 板，37℃孵育1小时。

(7)用PBST溶液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟。HRP标记的羊抗兔多克隆抗体按照1:10000用HRP偶联物稳定/稀释剂稀释，每孔100微升加入 ELISA板，37℃孵育1小时。

(8)抗体孵育完毕后ELISA板用PBST溶液洗涤4次，每次5分钟。

(9)加入TMB底物每孔100微升，37℃反应10分钟，每孔加入50微升2M 硫酸终止反应。

(10)将酶标仪设定检测波长为450nm，在10分钟内对ELISA板进行读数，测定吸光值。将标准品浓度对数值为横坐标(X轴)，相应OD值为纵坐标(Y轴)，绘制标准曲线图(R2值应不低于0.9800)。将待测样品的吸光值代入方程，计算蛋白质含量。

3、结果

检测结果证明，该试剂盒可以特异性检测VLPs，最低检测下限为146.48ng/ml，敏感性强；抗原浓度在0.293-75ug/ml具有良好的线性关系，经多次测定线性关系曲线差异不大，y＝0.2233x-1.0056,相关系数R2＞0.99(图8)。

4、符合度试验

我们选取含有90、50、4ug/ml PCV2 VLPs的高，中，低三个浓度的样品进行符合率检测。样品浓度由BCA试剂盒定量后经标准曲线定量计算，其浓度平均值分别为：变异系数分别为：86.28；49.523；4.23，变异均＜5％，说明本发明的试剂盒具有较好的准确性。同时，对纯化蛋白经过SDS-PAGE灰度定量分析，以已知浓度的BSA蛋白作为标准品，结果表明灰度分析测得的浓度785.4673mg/ml，本发明双夹心ELISA方法计算出的蛋白含量为815.1mg/ml，符合度很高。

5、试剂盒的组装

酶标板：96孔品牌捷克

包被抗体试剂：3H9单克隆抗体

包被液：50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH9.6

封闭液：含1w/v％BSA的PBS溶液0.01M，pH 7.6

检测抗体试剂：兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体以及HRP标记的羊抗兔多克隆抗体

稀释液：0.02M PBS缓冲液，pH7.0；

10×洗涤液：含有0.5v/v％Tween20的0.1mol/L PBS溶液(PBST溶液)，pH 7.6，使用时稀释10倍；

显色液：TMB显色液；

终止液：2M硫酸；

蛋白稳定剂溶液：湖州英创HRP偶联物稳定/稀释剂I货号HRP-SD-001

PCV2 VLPs标准品：600μg/ml。

Claims

1.一株能够稳定分泌特异性识别猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为3H9，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.15793，保藏时间为2018年6月6日。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生的能够特异性识别猪圆环病毒2型病毒样颗粒的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的所述的单克隆抗体在检测猪圆环病毒2型病毒样颗粒中的用途。

4.一种用于定性及定量检测PCV2病毒样颗粒的双夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体、兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体以及HRP标记的羊抗兔多克隆抗体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭液、稀释液、显色液、洗涤液、终止液、HRP偶联物稳定/稀释剂以及PCV2 VLPs标准品。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，用于猪圆环病毒2型病毒样颗粒检测时，按照以下步骤进行：

（1）权利要求2所述的单克隆抗体用包被液按照1:12800稀释，每孔100微升加入到ELISA板，4℃包被过夜；

（2）对包被好的ELISA板用洗涤液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；加入200微升/孔封闭液到ELISA板，37℃封闭2小时；

（3）用PBS调整PCV2 VLPs标准品浓度为600μg/ml，2倍比稀释后得到梯度的PCV2 VLPs标准品；

（4）取各稀释度的PCV2 VLPs标准品和待检测样品各100微升，分别加入封闭好的ELISA板，37℃孵育1小时；

（5）孵育完毕后ELISA板用PBST溶液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；

（6）兔抗PCV2 VLPs多克隆抗体按照1:3200稀释，每孔100微升加入ELISA板，37℃孵育1小时；

（7）用PBST溶液洗涤4次，每孔200微升，每次5分钟；HRP标记的羊抗兔多克隆抗体用HRP偶联物稳定/稀释剂按照1:10000稀释，每孔100微升加入ELISA板，37℃孵育1小时；

（8）抗体孵育完毕后ELISA板用洗涤液洗涤4次，每次5分钟；

（9）每孔加入显色液100微升，37℃反应10分钟，每孔加入50微升2M硫酸终止反应；

（10）将酶标仪设定检测波长为450nm，在10分钟内对ELISA板进行读数，测定吸光值；将标准品浓度对数值为横坐标（X轴），相应OD值为纵坐标（Y轴），绘制标准曲线图，将待测样品的吸光值代入方程，计算蛋白质含量。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的包被液为50mM的碳酸盐包被缓冲液，pH9.6；所述的封闭液为含10g/L BSA的0.01M PBS溶液，pH 7.6；所述的稀释液为0.02MPBS缓冲液，pH7.0；所述的洗涤液为含有体积百分比浓度为0.5%Tween20的0.1mol/L PBS溶液，pH 7.6，使用时稀释10倍；所述的显色液为TMB显色液；所述的终止液为2M硫酸。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，标准曲线图的R2值应不低于0.9800。