CN109536426B - 一株嗜冷菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
一株嗜冷菌及其应用，本发明涉及一株嗜冷菌及其应用。本发明一株嗜冷菌为Psychrobacter cryohalolentis F5‑6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16653。本发明菌株可去除4～10℃低温地下水中的硝酸盐，在C/N比为0.5时，温度8℃，pH值7.2，180rpm下，硝酸盐还原速率可达83.73mg/L·h，本发明应用于环境微生物技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一株嗜冷菌及其应用。
背景技术
根据《2017中国生态环境状况公报》，我国共计7245个地下水监测点中，水质呈较差级别的监测点3947个，占54.5％，水质呈极差级别的监测点1068个，其中硝酸盐氮(NO3 --N)是主要污染指标之一。而我国、尤其是北方地区，有50％以上以地下水为饮用水源。饮用水中的硝酸盐含量过高容易引起高铁血红蛋白症，甚至会诱发癌症，对人体造成危害。因此，有效去除地下水中的硝酸盐对于保障居民供水安全至关重用。我国从2007年7月起实施的生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)也将硝酸盐氮的最高允许浓度限制在10mg/L。
离子交换、反渗透等物理方法处理地下水中的硝酸盐成本较高、产生的再生液和浓缩水必须妥善处理。化学方法处理地下水中硝酸盐需要额外投加还原剂，易产生二次污染。生物处理法具有成本低、不添加新的化学药剂、不易产生二次污染等优点而备受广泛关注。但是地下水水温偏低，尤其是北方地区，地下水温一般为6～10℃。通常情况下，当温度低于15℃时，微生物的生物活性和代谢速率降低，低于10℃时，有些微生物的代谢活动会终止，6～10℃的低温严重影响了微生物对地下水中硝酸盐的去除效率。尽管在1996年，就发现了嗜冷菌Psychrobacter cryohalolentis，但目前在嗜冷菌属中未发现有可进行硝酸盐还原的菌株，或可用于去除低温地下水中硝酸盐的菌株。
发明内容
本发明提供了一株嗜冷菌及其应用。
本发明一株嗜冷菌为Psychrobacter cryohalolentis F5-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16653。
本发明嗜冷菌Psychrobacter cryohalolentis F5-6用于去除水中污染物。
本发明嗜冷菌为Psychrobacter cryohalolentis F5-6的筛选方法为：取受硝酸盐污染(硝酸盐浓度140mg/L)的低温地下水(水温4℃)100ml，在2～10℃、150rpm/min下富集12～20d，期间不断补充NaNO3和C2H5OH，待菌液的OD600值达到0.5以上后，梯度稀释并接种于固体培养基上，在2～10℃下培养5～7d，选取典型的单一菌落进行纯化培养。将最终获得的纯培养菌株进行硝酸盐还原试验，选取30min内对硝酸盐还原率达到50％以上的菌株。
提取嗜冷菌基因组DNA后进行16S rDNA序列扩增，将获得片段用于测序，与嗜冷菌模式菌株Psychrobacter cryohalolentis K5T的相似性为99.71％，鉴定为嗜冷菌Psychrobacter cryohalolentis，最终命名为Psychrobacter cryohalolentis F5-6。
本发明Psychrobacter cryohalolentis F5-6可去除4～10℃低温地下水中的硝酸盐，在C/N比为0.5时，温度8℃，pH值7.2，180rpm(溶解氧约为9.0mg/L)下，硝酸盐还原速率可达83.73mg/L·h。
本发明的Psychrobacter cryohalolentis F5-6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16653。
附图说明
图1为本发明Psychrobacter cryohalolentis F5-6的革兰氏染色结果示意图；
图2为本发明Psychrobacter cryohalolentis F5-6的菌落示意图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一株嗜冷菌为Psychrobacter cryohalolentis F5-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16653。
本实施方式嗜冷菌为Psychrobacter cryohalolentis F5-6的筛选方法为：取受硝酸盐污染(硝酸盐浓度140mg/L)的低温地下水(水温4℃)100ml，在2～10℃、150rpm/min下富集12～20d，期间不断补充NaNO3和C2H5OH，待菌液的OD600值达到0.5以上后，梯度稀释并接种于固体培养基上，在2～610℃下培养5～7d，选取典型的单一菌落进行纯化培养。将最终获得的纯培养菌株进行硝酸盐还原试验，选取30min内对硝酸盐还原率达到50％以上的菌株。
提取嗜冷菌基因组DNA后进行16S rDNA序列扩增，将获得片段用于测序，与嗜冷菌模式菌株Psychrobacter cryohalolentis K5T的相似性为99.71％，鉴定为嗜冷菌Psychrobacter cryohalolentis，最终命名为Psychrobacter cryohalolentis F5-6。
本实施方式Psychrobacter cryohalolentis F5-6可去除4～10℃低温地下水中的硝酸盐，在C/N比为0.5时，温度8℃，pH值7.2，180rpm(溶解氧约为9.0mg/L)下，硝酸盐还原速率可达83.73mg/L·h。
具体实施方式二：本实施方式嗜冷菌在筛选过程中使用的培养基配方为：NaNO30.1～0.5g/L，MnSO40.01～0.05g/L，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.01～0.10g/L，CaCl20.01～0.05g/L，C2H5OH 0.1～2.0mL/L，Na2HPO40.3～0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，NaCl0.3～0.9g/L，pH值7.0～7.4。其他与具体实施方式一相同。
若是固体培养基，则上述配方中加入1.8g/L的琼脂。
具体实施方式三：本实施方式嗜冷菌Psychrobacter cryohalolentis F5-6用于去除水中污染物。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：水为低温地下水。其他与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三或四不同的是：所述低温地下水的温度为4～10℃。其他与具体实施方式三或四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三至五之一不同的是：所述污染物为硝酸盐。其他与具体实施方式三至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式嗜冷菌为Psychrobacter cryohalolentis F5-6的筛选方法为：取受硝酸盐污染(硝酸盐浓度140mg/L)的低温地下水(水温4℃)100ml，在2～10℃、150rpm/min下富集12～20d，期间不断补充NaNO3和C2H5OH，待菌液的OD600值达到0.5以上后，梯度稀释并接种于固体培养基上，在2～10℃下培养5～7d，选取典型的单一菌落进行纯化培养。将最终获得的纯培养菌株进行硝酸盐还原试验，选取30min内对硝酸盐还原率达到50％以上的菌株。
上述过程所使用的培养基为：NaNO30.1～0.5g/L，MnSO40.01～0.05g/L，(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 0.01～0.10g/L，CaCl20.01～0.05g/L，C2H5OH 0.1～2.0mL/L，Na2HPO40.3～0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，NaCl 0.3～0.9g/L，pH值7.0～7.4，(固体培养基中加入1.8g/L的琼脂)。
菌株Psychrobacter cryohalolentis F5-6呈革兰氏阴性(如图1)，不运动，不产生芽孢，不形成色素，菌落圆形，光滑，凸起，(如图2)。Psychrobacter cryohalolentis F5-6可在-10～30℃、pH 6～8条件下生长；20℃、pH值7.2为最适生长条件，为严格好氧型嗜冷菌；氧化酶阳性，碱性磷酸酶阳性，酯酶(C4)阳性，磷酸酯酶(C8)阳性，脂肪酶(C14)阳性；可进行硝酸盐的还原；可以乙酸钠、乙醇、柠檬酸钠、乳酸钠或苯甲酸钠为单一碳源进行生长，可利用α-D-葡萄糖，可以在7％的NaCl溶液中生长；不能水解酪蛋白。
具体实施方式六：本实施方式Psychrobacter cryohalolentis F5-6的鉴定：
提取Psychrobacter cryohalolentis F5-6基因组DNA后进行16S rDNA序列扩增，用于扩增的PCR反应引物为通用引物：正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；反向引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。PCR反应体系如下：20～50ng模板DNA，0.2μL Taq酶，2.5μL 10×Buffer(含Mg2+)，1μL dNTP(各2.5mmol/L)，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，加入无菌去离子水至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性4min，之后94℃变性45s，55℃扩增45s，72℃延伸1min，经过30次循环后，72℃延伸10min，之后4℃终止反应，将获得片段用于测序，基因序列如SEQ ID NO：1所示，GenBank注册号为MH817852，与嗜冷菌模式菌株Psychrobactercryohalolentis K5T的相似性为99.71％，鉴定为嗜冷菌Psychrobacter cryohalolentis，最终命名为Psychrobacter cryohalolentis F5-6。对本实施方式的Psychrobactercryohalolentis F5-6在低温条件下反硝化功能进行验证：
试验1：配制浓度分别为10.0、20.0、40.0、60.0、100.0、150.0、200.0mg/L的硝酸盐溶液,为了模拟地下水水质特征，向硝酸盐溶液中添加了7～10mg/L的MnSO4和5～8mg/L的FeSO4，得到降解溶液，然后将嗜冷菌Psychrobacter cryohalolentis F5-6菌株培养至107～109个/ml，取50ml在6000g离心10min获得菌体沉淀，用无菌去离子水对菌体沉淀清洗2～3次，将菌体转入50ml降解溶液，用乙酸钠作为碳源，C/N比为0.5，在pH为7.0～7.2、温度为8℃的低温条件下，降解30min后测定硝酸盐还原速率。
本试验发现随着硝酸浓度提高，硝酸盐还原速率越高，当硝酸盐浓度达到200.0mg/L时，硝酸盐还原速率最高，为191.24mg/L/h。当初始硝酸盐浓度在20.0～100.0mg/L时，硝酸盐还原速率为35.82～85.67mg/L/h。
试验2：配制浓度为100.0mg/L的硝酸盐溶液，为了模拟地下水水质特征，向溶液中添加了7～10mg/L的MnSO4和5～8mg/L的FeSO4，得到降解溶液，然后将嗜冷菌Psychrobactercryohalolentis F5-6菌株培养至107～109个/ml，取50ml在6000g离心10min获得菌体沉淀，用无菌去离子水对菌体沉淀清洗2～3次，将菌体转入50ml降解溶液，用乙酸钠作为碳源，C/N比为分别调节至0.5、1、2、4、8、10、15、20，在4～10℃，pH值6～8，80～180rpm(溶解氧大于2～10mg/L)条件下，对硝酸盐还原30min后，后测定硝酸盐还原速率。
结果表明在C/N比为0.5时，温度8℃，pH值7.2，180rpm(溶解氧约为9.0mg/L)下，硝酸盐还原速率最高，为83.73mg/L·h。
试验3：从受农业化肥污染较严重的区域取地下水2份，测定水质状况，结果如表1所示，如表所示，地下水中C/N比低于0.05。
表1地下水样的水质
是将菌株Psychrobacter cryohalolentis F5-6培养至107～109个/mL，取50mL菌液在6000g离心10min获得菌体沉淀，用无菌去离子水对菌体沉淀清洗2～3次，将菌体收集，分别转入2份水样中(每份水样50mL，并设3次重复)，在8℃的条件下，分别处理30min和8h后测定水中剩余硝酸盐浓度，并计算硝酸盐的去除率，结果如表2所示。结果表明，经8h处理后，Psychrobacter cryohalolentis F5-6可以去除地下水中80％以上的硝酸盐，处理后，硝酸盐可以满足我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)的要求(以地下水为水源时，硝酸盐≤20mg/L)
表2Psychrobacter cryohalolentis F5-6在30min和8h后对地下水中硝酸盐的去除效果
由试验1-3可知，Psychrobacter cryohalolentis F5-6可去除4～10℃低温地下水中的硝酸盐，在温度8℃时，硝酸盐还原速率可达83.73mg/L·h；经8h处理后，Psychrobacter cryohalolentis F5-6可以去除低温地下水中80％以上的硝酸盐。
序列表
<110>黑龙江大学
<120>一株嗜冷菌及其应用
<160> 3
<210> 1
<211> 1408
<212> DNA
<213>嗜冷菌（Psychrobacter cryohalolentis）
<400> 1
ccatgcagtc gagcggaacg atgatagctt gctatcaggc gtcgagcggc ggacgggtga 60
gtaatactta ggaatctacc tagtagtggg ggatagcacg gggaaactcg tattaatacc 120
gcatacgacc tacgggagaa agggggcagt ttactgctct cgctattaga tgagcctaag 180
tcggattagc tagatggtgg ggtaaaggcc taccatggcg acgatctgta gctggtctga 240
gaggatgatc agccacaccg ggactgagac acggcccgga ctcctacggg aggcagcagt 300
ggggaatatt ggacaatggg ggaaaccctg atccagccat gccgcgtgtg tgaagaaggc 360
cttttggttg taaagcactt taagcagtga agaagactct tcggttaata cccggagacg 420
atgacattag ctgcagaata agcaccggct aactctgtgc cagcagccgc ggtaatacag 480
agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaaggga gcgtaggtgg ctcgataagt 540
cagatgtgaa atccccgggc tcaacctggg aactgcatct gatactgttg agctagagta 600
tgtgagagga aggtagaatt ccaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc tggaggaata 660
ccgatggcga aagcagcctt ctggcataat actgacactg aggctcgaaa gcgtgggtag 720
caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtctacta gtcgttgggt 780
cccttgagga cttagtgacg cagctaacgc aataagtaga ccgcctgggg agtacggccg 840
caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 900
attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacata tctagaatcc tgcagagatg 960
cgggagtgcc ttcgggaatt agaatacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt 1020
gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt ccttagttac cagcgggtta 1080
agccgggaac tctaaggata ctgccagtga caaactggag gaaggcgggg acgacgtcaa 1140
gtcatcatgg cccttacgac cagggctaca cacgtgctac aatggtaggt acagagggca 1200
gctacacagc gatgtgatgc gaatctcaaa aagcctatcg tagtccagat tggagtctgc 1260
aactcgactc catgaagtag gaatcgctag taatcgcgga tcagaatgcc gcggtgaata 1320
cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agttgattgc accagaagtg 1380
gatagcttaa ccttcggggg agcgtcac 1408
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR正向引物核苷酸序列。
<400> 2
CAGAGTTTGATCCTGGCT 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR反向引物核苷酸序列。
<400> 3
AGGAGGTGATCCAGCCGCA 19
Claims (2)
1.一株盐晶嗜冷杆菌（Psychrobacter cryohalolentis） F5-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年10月29日，保藏编号为CGMCC No.16653。
2.权利要求1所述的盐晶嗜冷杆菌在去除水中硝酸盐中的应用，所述水为4~10℃的地下水。
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