CN109517908A

CN109517908A - 一种引发溶血性输血反应的ab型变异型的snp位点

Info

Publication number: CN109517908A
Application number: CN201910062490.0A
Authority: CN
Inventors: 刘丽; 逄淑涛; 韩斌; 冯智慧
Original assignee: Qingdao Blood Center
Current assignee: Qingdao Blood Center
Priority date: 2019-01-23
Filing date: 2019-01-23
Publication date: 2019-03-26

Abstract

本发明的目的是提供一种用于检测引发急性或者迟发性溶血性输血反应的AB型变异型的SNP位点。为ABO血型基因编码区域由起始密码子起的第803位碱基，为G＞C的突变。本发明提供了ABO血型AwB型基因检测的新用途，从而提供了一种有效的避免急性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO血型AwB型基因突变位点的快速检测。

Description

一种引发溶血性输血反应的AB型变异型的SNP位点

技术领域

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测引发急性或者迟发性溶血性输血反应的AB型变异型(AwB)的SNP位点。

背景技术

正常的ABO血型分为A型、B型、AB型与O型四种血型，但是在ABO血型基因发生变异的情况下如SNP、缺失、插入、重复等，造成ABO血型红细胞表面抗原与血浆中的抗体发生变化，例如本发明中发现的这例ABO血型系统中AwB型血型，红细胞上A抗原比正常A型人要弱，但是血浆中存在抗-A1细胞的抗体，一旦输注AB型人血液，极易发生输血性溶血反应。

溶血性输血反应(Hemolytic Transfusion Reaction；HTR)分为急性与迟发性溶血性输血反应，ABO系统不相合的输血一般为急性溶血性输血反应，危害极大。一般在输血后24h内发生，多于输血后立即发生，是最严重的输血副反应，一旦发生需立即抢救，否则致死率很高。

无论是在国内或是国外，ABO血型的错误输注是引起急性溶血性输血反应最为常见的因素。AwB型人的血清中可能会产生抗-A或抗-B抗体。如果输入AwB型血液就造成急性或迟发性免疫性溶血反应。针对此种情况，必须强调预防的重要性。AwB血型在新生儿溶血病诊断及产前检查中也具有重要意义，AwB型孕妇孕育了非同型或非O型胎儿时，如果血清中存在IgG抗-A和或抗-B，会导致胎儿发生新生儿溶血病，严重者会引起新生儿死亡。

刘建岭等报道家系中一对双胞胎均为B(A)血型，生后诊断为着色性干皮病，是否与B(A)血型相关尚无理论依据可寻。采用家系调查的方法，观察弱抗原在家系中传递情况，有时便可推测弱抗原的性质，对鉴定亚型有一定帮助。

随着PCR扩增技术在血型研究领域的引入和发展，来自世界各地的学者们希望从分子水平上获得科学准确的解析，纷纷对ABO亚型表现型的个体进行基因分型和测序分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测引发急性或者迟发性溶血性输血反应的AB型变异型(AwB)的SNP位点，从而弥补现有技术的不足。

申请人对一个呈常染色体9q34.1-9q34.2显性遗传的AwB型血型基因的家系成员进行了测序，找到了该家系成员AB型变异型基因存在遗传上的致病突变的位点，该位点的突变造成了A抗原数量和质量的改变，并且通过免疫刺激产生抗-A1抗体，一旦发生错误血型的输注(输注AB型血)，很有可能发生致命的危害。

本发明提供一种用于检测引发急性或者迟发性溶血性输血反应的AB型变异型(AwB)的SNP位点，为ABO血型基因编码区域由起始密码子起的第803位碱基，为G＞C的突变；

本发明还提供上述SNP位点的用途，是用于制备检测AB型变异型的制品；

所述的制品，优选为PCR扩增检测试剂盒；

本发明再一个方面提供一种检测ABO血型系统AB型变异型的PCR扩增检测试剂盒；所述的PCR扩增检测试剂盒至少包含有检测上述SNP位点的分子标记；

作为实施例的优选，所述的分子标记为PCR扩增用的引物对或探针或单倍型测序引物；

其中用于检测上述SNP位点的直接扩增及测序引物信息如下：

ABO-E7F:5'-TTCCTGGAGACGGCGGAGAA-3'SEQ ID NO:1

ABO-E7R:5'-GTGGTCGCGGAACTCCATGT-3'SEQ ID NO:2

用于检测上述SNP位点单倍型测序引物信息如下：

ABO-E6m：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'SEQ ID NO:3；

ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'SEQ ID NO:4。

本发明提供了ABO血型AwB型基因检测的新用途，从而提供了一种有效的避免急性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO血型AwB型基因突变位点的快速检测。

附图说明

ABO血型AwB型变异型基因先证者基因突变位点测序图。图1：正常A型参考序列，参比序列来源于BGMUT(国际血型基因突变库)；

图2：先证者直接测序图；

图3：先证者克隆测序图，先证者ABO基因编码区域由起始密码子起第803位碱基发生了突变(nt803G＞C)。

具体实施方式

申请人在一个ABO血型AwB型基因家系中发现致病性SNP位点，并证实该基因的突变是导致AB型血型发生变异导致红细胞A抗原比正常A型人红细胞A抗原要弱，并且血浆中产生同种抗-A1抗体。一旦输入AB型血液，很可能引发急性溶血性输血反应，为了做到及时检测和预防，从而促成了本发明。

A变异型位于染色体9q34.1-9q34.2，可转录成大约1065bp的mRNA(NCBI登录号为NM_020469.2)，直接翻译形成355个氨基酸组成的蛋白质。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：从ABO血型AwB型变异型基因先证者基因检测确认AB型变异型(AwB)的突变位点。

1、提取外周血基因组DNA：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取ABO血型AB型变异型基因家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA-Na₂抗凝管内，-80℃冻存备用；DNA提取使用LIFE公司的DNA提取试剂盒，具体操作流程如下：

冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500ul放于离心管，加入等体积的红细胞裂解液(pH8.0)，涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。重复加入红细胞裂解液500ul涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。

沉淀物涡旋混匀5分钟，加入核裂解液50ul，涡旋混匀5分钟，置于56℃金属浴15分钟。从水浴中取出样品，加入蛋白清除液135ul。涡旋充分混匀，至于4℃30分钟。

室温下12000rpm离心5分钟，吸取上清液(约200ul)至一新离心管中。加入冰乙醇500ul，反复震荡离心管，直至白色DNA沉淀物析出。室温12000rpm离心2分钟，弃上清。向DNA沉淀加入75％乙醇，漂洗一次，室温12000rpm离心3分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μLTE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

2、直接测序法寻找先证者AwB型基因的突变位点

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：95℃预变性10分钟；94℃60秒，63℃90秒，72℃60秒，10个循环；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25个循环；72℃延伸10min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(TAKARA Ex-Taq polymerase)

应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述ABO-E7F、ABO-E7R引物的扩增反应。

PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对ABO-E7F:5'-TTCCTGGAGACGGCGGAGAA-3'；ABO-E7R:5'-GTGGTCGGAACTCCATGT-3'在先证者发现ABO基因除第7外显子的803碱基未发生GC杂合外，其余位点符合A102B101特征。多次测序结果表明该突变位点的确存在该突变，并不是因为扩增或测序错误引进的(图2)。

实施例2SNP位点的验证

3、对ABO基因第6,7外显子及第6内含子进行单倍型测序，确定先证者AB变异型基因的突变位点

PCR扩增目的片段引物：ABO-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'；ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3'。

PCR扩增引物也可以选用其它能扩增上述SNP位点的引物对。

PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃50秒，40个循环；72℃延伸5min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(TAKARA LA-Taq polymerase)

应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与发明者设计的克隆测序的引物进行扩增反应。将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用ABO-E6mo：5'-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3'；ABO-E7mo：5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3',确定样本的单倍型序列(图3)。该突变为一新发现的突变。该突变不存在于下面的三个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，血型基因突变库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.fcgi？cmd＝bgmut/systems_info&system＝abo)，表明该突变非常罕见，该突变导致了A基因编码区域由起始密码子起第803位碱基由G＞C，导致了第268位氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸；氨基酸的突变从而引起了此AwB型个体A抗原表位发生缺失抗原减弱，导致这种个体不需要免疫刺激就能够产生血浆中能够产生同种的抗-A1抗体(天然免疫)，当输注正常人的AB型血液时就会发生急性溶血性输血反应，从而危及患者生命。而在近400余例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

在青岛市中心血站输血医学研究所收集的先证者家系成员，提取他们的外周血基因组DNA，应用上述DNA作为模板与ABO-E7F、ABO-E7R引物进行PCR目的片段的扩增，常规Sanger测序法应用上述这对引物对PCR产物进行直接测序，直接测序检测结果显示有A、B血型基因的存在；发现该先证者的两名家系成员的ABO基因除第7外显子的803碱基未发生GC杂合外，其余位点符合A102B101特征。继续对发现SNP突变的两位家系成员进行ABO基因第7外显子的单倍型测序，应用上述提取的一名家系成员(先证者父亲)的基因组DNA作为模板与ABO-E7mo引物进行PCR目的片段的扩增，将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型序列。单倍型测序发现，两位家系成员A基因编码区域第803位碱基由G＞C，导致了第268位氨基酸由甘氨酸变为丙氨酸，与先证者完全一致，而且这一名家系个体血浆中都存在同种抗-A1抗体。

通过上述的分析，证明发明者设计的引物可以用来检测个体ABO血型基因是否发生A基因突变，从而有潜在的发生输血后急性输血型溶血反应的危险。

序列表

<110> 青岛市中心血站

<120> 一种引发溶血性输血反应的AB型变异型的SNP位点

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcctggaga cggcggagaa 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtggtcgcgg aactccatgt 20

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatccat gtgggtggca ccctgcca 28

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggcctaggc ttcagttact c 21

Claims

1.一种用于检测引发急性或者迟发性溶血性输血反应的AB型变异型的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点为ABO血型基因编码区域由起始密码子起的第803位碱基，为G＞C的突变。

2.权利要求1所述的SNP位点在制备检测AB型变异型的制品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为PCR扩增检测试剂盒。

4.一种检测ABO血型系统AB型变异型的PCR扩增检测试剂盒；其特征在于，所述的PCR扩增检测试剂盒包含有检测权利要求1所述的SNP位点的分子标记。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的分子标记为PCR扩增用的引物对、探针或单倍型测序引物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增用的引物对，其序列为SEQID NO:1、SEQ ID NO:2。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的单倍型测序引物的序列为SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4。