CN1094978C - 将秋水仙素类化合物生物转化成相应的3－糖基衍生物的方法 - Google Patents

Abstract

用巨大芽孢杆菌菌株将秋水仙素类化合物转化成相应的3-O-糖基衍生物。

Description

将秋水仙素类化合物生物转化成相应的3-糖基衍生物的方法

本发明涉及用选定的微生物菌株将秋水仙素类化合物生物转化成相应的3-O-糖基衍生物的方法。本发明的方法可以从秋水仙素、硫代秋水仙素或其衍生物以高产率和高纯度制得在仅在芳环A的C-3上糖基化的秋水仙素类化合物。

在苯环的C-3位糖基化的秋水仙素类化合物由于其非常有效或可用于制备新的药物而具有非常显著的药理学重要性。

具体地讲，硫代秋水仙碱苷(3-O-葡糖基硫代秋水仙素)是药物领域中的一种非常重要的活性成分，主要用于治疗肌肉-骨骼系统的疾病，并用作制备新的抗肿瘤、免疫抑制、抗牛皮癣和抗炎药物的原料。

以前通过化学反应或生物转化的方法对制备3-糖基秋水仙素类化合物进行了大量尝试。

化学路线由一系列复杂、非特异性的反应组成，反应结果生成糖基化衍生物的混合物，其中的一些衍生物是无活性的。因此，转化生成在芳环的C-3位特异性糖基化的有效产物的收率非常低。

生物学途径实际上涉及通过培养积雪草(Centella Asiatica)将硫代秋水仙素生物转化成在芳环的C-2和C-3单糖基化的衍生物；因此，这种生物转化的选择性不高，并且收率和产量均很低(Solet，J.M.等，植物化学33，4，817-820，1993)。

将秋水仙素类化合物进行生物转化的其它尝试可以仅使连接在芳环(C-2和C-3位)上的甲氧基脱甲基化，但是，这些方法的产率和产量通常很低，并且区域选择性很差。

因此，Hufford C.D.等(药物科学杂志，68，10，1239-1242，1979)使用灰色链霉菌和/或壮观链霉菌，Bellet.P.等(GB-923421，1959)使用链霉菌的不同菌株和其它种的细菌和真菌，试图将秋水仙素及其衍生物转化成相应的3-脱甲基化的衍生物。这些已知方法的结果证实了以上关于微生物酶所涉及的例如在生物碱分子的C-2、C-3或C-10位的非立体选择性的描述。此外，所述催化系统的产量水平非常低，这是由于转化收率低，可使用的底物浓度下降以及环庚三烯酚酮的经常降解。

最近，Poulev等(J.Ferment.Bioeng.79，1，33-38，1995)实现了细菌微生物的特异性生物转化，但收率和产量仍然很低。

来自与上述微生物(链霉菌、芽孢杆菌)相似的微生物的酶活性已应用于生物转化其它化合物，例如美登苷(maytansinoids)(美国专利，4361650；Izawa，M.等，抗生素杂志，34，12，1587-1590，1981)。在这种情况下，催化反应也是完全由脱甲基化反应组成，并且转化率和产量很低。

来自巨大芽孢杆菌的α-淀粉酶的糖基转移酶活性已有记载(Brum，P.J.等，淀粉43，8，319-323，1991)；该转移酶反应(仅限于葡萄糖或葡糖苷)的受体特异性非常高。由同种微生物产生的环糊精-葡糖基转移酶可催化rubusoside(13-O-β-D-葡糖基-斯替维醇β-D-葡糖基酯)的α-1，4-转葡糖基作用。另外，在该生物转化中，转移酶反应的受体是底物糖部分(Darise，M.等，Agric.Biol.Chem.，48，10，2483-2488，1984)。以前将环糊精-糖基转移酶用于从淀粉中制备环糊精G6、G7和G8(Kitahata，S.，Okada，S.，农业生物化学38，12，2413-2417，1974)。

这些实例证明了由巨大芽孢杆菌表达之糖基转移酶活性的高度底物特异性，其只与糖受体有关，因此不涉及任何有不同复杂分子结构之二级代谢产物如秋水仙素类的反应。事实上，没有已知将所述微生物用于将秋水仙素类酶促转化成3-糖基衍生物的实例。

现在已经发现，存在高浓度秋水仙素和硫代秋水仙素的条件下能够生长的巨大芽孢杆菌菌株具有非常高的生物转化活性，可将秋水仙素类底物转变成仅在芳环C-3上糖基化的秋水仙素。所述转化在很短的时间内发生，而且产率之高令人惊奇。

因此，本发明涉及制备式(I)3-O-糖基秋水仙素化合物的方法

其中R₁是O-糖苷基，R₂是氢或C₁-C₇酰基，R₃是C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆硫代烷基，该方法包括用巨大芽孢杆菌生物转化其中R₁是OH或甲氧基的化合物。

巨大芽孢杆菌是革兰氏阳性孢子产生的细菌，细胞直径大于1.0μm；在许多培养基中需氧生长；过氧化氢酶阳性；水解明胶。

正如通过生长检测和显微镜分析所证实的，用于本发明的巨大芽孢杆菌菌株能够令人满意地生长并在高浓度秋水仙素和/或硫代秋水仙素(高于3g/l)时也能存活。

已经证明同属种如蜡状芽孢杆菌在底物浓度为1.5g/l时很难生长(对照吸收值的15-25％)，在浓度为3g/l时更显著，有显著的自溶作用。相反，在上述浓度时，与蜡状芽孢杆菌相比，所选的巨大芽孢杆菌培养物可达到达很高的生长水平(2倍或3倍)。

生物转化的高选择性和效率是令人惊奇的并且是超乎寻常的，产率水平为80-100％，通常约90-95％。

此外，所述生物转化中所用的微生物能够持久地保持催化活性，甚至在重复培养步骤中也是如此，因此，可在补料分批培养和连续培养过程中提供特异性的生物转化。因此，该方法的生产力和重现水平均很高。

除显著的生产率外，显著的反应区域选择性确保了所得产物的高质量和纯度，因此，可以100％的纯度提供产物，只需简单的续加工。

另外的重要优点是减少了产物的纯化和回收步骤，该方法更经济和简单，使用更安全。

筛选可用于本发明方法的细菌菌株的操作过程包括：

A)从天然来源或收集的菌株开始，选择在高浓度秋水仙素底物存在下能够生长的巨大芽孢杆菌。

B)利用特异性底物(以逐渐增加的浓度施用)上的生物转化试验，筛选来自A)的分离株以证实将秋水仙素转化成相应的3-O-糖基衍生物的转化活性。

C)B)中所选菌株的微生物学特征。

D)利用B)细菌种群的靶特异性筛选，逐渐提高生物转化产率。

E)研究并优化标准发酵参数以便使生物转化达到最佳。

F)研究并优化用于高生产力培养物的转化方法以确保得到工业规模生产所用的稳定的均匀的接种物。

G)以发酵罐、分批、补料分批和连续加工逐渐扩大该方法的规模。

H)用于产物后续加工和回收的后处理和优化方法。

具体地说，通过在含有机氮(胨、酵母提取物、肉提取物、天冬酰胺等)、碳源(甘油、淀粉、麦芽糖、葡萄糖等)的不同琼脂培养基上，在pH为5-8，优选6-7下，从菌株保藏中心或各种来源的土壤样品得到的收集培养物筛选可用于本发明的微生物。培养温度为20-45℃，优选28-40℃。

在其中已预先加入了浓度为0.1-3g/l秋水仙素或硫代秋水仙素(以便抑制大部分微生物的生长)的不同琼脂化底物上，通过梯度稀释和平行铺板技术评估在存在毒性浓度的待转化秋水仙素底物的条件下，培养物生长的能力。

无菌取出能够在所述条件下生长的菌落，并放在不同琼脂化培养基上以确定其纯化和生长的均一性。

用于转化培养物的培养基是典型微生物底物，其含有有机氮(胨、酵母提取物、胰胨、肉提取物等)、碳源(甘油、麦芽糖、葡萄糖等)的不同琼脂培养基上，在pH为5-8，优选6-7下，可以从菌株保藏中心或各种来源的土壤样品中得到的收集培养物筛选可用于本发明的微生物。培养温度为20-45℃，优选28-40℃。

然后在存在秋水仙素类化合物的条件下，检测所选微生物在浸没培养中生长的能力和将秋水仙素类化合物转化成相应的3-糖基衍生物的能力。

所述检测在含20ml液体培养基的100ml烧瓶中完成，所述液体培养基含有不同的培养基制剂，含有一种或多种有机氮(酵母提取物、胨、胰胨、酪蛋白水解产物、肉提取物、玉米浆等)，一种或多种碳源(葡萄糖、甘油、淀粉、蔗糖等)，无机磷和氮源以及各种离子(K⁺、Na⁺、Mg⁺⁺、Ca⁺⁺、Fe⁺⁺、Mn⁺⁺等)的无机盐。

根据需要可利用常规诱变技术(用UV射线照射等)对培养样品进行诱变处理以诱导具有特异性生物转化活性的突变体，所述生物转化活性可用上述方法评估。

通过TLC或HPLC色谱可分析每一生物转化试验中的培养样品以评估生成3-糖基衍生物的能力。

在烧瓶中，以300ml规模，用与筛选步骤相同的培养肉汤，利用生物转化试验证实所选微生物将秋水仙素类底物转化成相应3-糖基衍生物的能力。

在不同的培养肉汤中，以300ml规模，将有阳性反应的微生物用于优化生物转化的试验。研究得到的主要培养和发酵参数是：有机氮源、碳源、无机盐、温度、搅拌通气、pH、培养时间、接种率、次培养步骤、加入待转化底物的时间。能够影响本发明生物转化的所选的细菌微生物可以在固体和液体培养基中生长，所述培养基含有一种或多种有机氮源，优选酵母提取物、肉提取物、胨、胰胨、酪蛋白水解产物、玉米浆等。用于生长和生物转化的碳源是葡萄糖、果糖、糖、甘油、麦芽提取物等，优选葡萄糖、果糖和甘油。所述培养基还含有无机磷源和K⁺、Na⁺、Mg⁺⁺、NH₄ ⁺等盐。

所选的微生物可以在温度为20-45℃，优选28-40℃，pH5-8，优选6-7之间生长。在相同的条件下，所选的微生物能够将秋水仙素类化合物转化成相应的3-糖基衍生物。所述转化在旋转振荡器上的烧瓶内同时以150-250rpm搅拌，于浸没培养中发生。

由于生物转化所涉及的与微生物生长有关的具体动力学，因此达到生物转化的最佳条件与达到最佳生长的条件相同。因此，用于促进微生物良好生长的培养基如以上所述有机和无机组分为基础的那些，对于所涉及底物的生物转化也有良好活性。在开始发酵步骤中将后者加到培养中。

本发明的生物转化基于酶转化，并在指数生长期开始且继续生长；在头24-30小时内3-糖基衍生物的转化达到最大水平(很高：高达95-100％)。生物转化的区域选择性是绝对的：不存在2-糖基衍生物。所得产物都是细胞外产物。

可将本发明的生物转化扩大到发酵罐水平，保持培养条件不变，特别是就培养基、温度和进行时间而言。为了得到良好的生长，足够的搅拌通气水平是非常重要的，具体地说，需要通气水平为1-2升空气/升培养物/分钟(vvm)，优选1.5-2vvm。

通过离心并回收上清液，或者微过滤及渗透回收而将生物基质与液体馏份分离后，从培养肉汤中提取生物转化得到的产物。从产物的最佳回收而言，用醇处理培养物。

利用在吸收树脂上分离及用醇，优选甲醇洗脱的层析技术，完成生物转化产物的纯化和回收。然后用亲脂有机溶剂，优选用二氯甲烷进一步钝化含产物的氢甲醇溶液。用醇和有机溶剂混合物进一步处理后，通过结晶从所得醇溶液中得到纯的产物。

本发明生物转化方法对于含环庚三烯酚酮基团的底物是特异性的，并可用于许多秋水仙素类化合物如秋水仙素、硫代秋水仙素、3-脱甲基秋水仙素、3-脱甲基硫代秋水仙素、N-脱乙酰基硫代秋水仙素和其它各种取代的秋水仙素。

巨大芽孢杆菌不会对不含环庚三烯酚酮的其它天然化合物产生糖基化。

可用其它糖如果糖或半乳糖代替葡萄糖，而不会导致糖基转移酶活性的丧失。

下列实施例更详细地公开了本发明。

实施例1

将从农业土壤中分离的等份巨大芽孢杆菌培养物重悬于20ml无菌盐水中，然后经1∶10000000稀释倍数的梯度稀释。将不同稀释度的悬浮液铺在LB-琼脂培养基上，并在LB-琼脂上分别加有终浓度为2g/l的秋水仙素或硫代秋水仙素(见表)。黑暗中，将培养物在28℃培养3天。通过铺在非选择性培养基上来分离并纯化在加有秋水仙素类化合物的选择培养基上生长的菌落；将所述样品按上述培养，但时间较短(24小时)。随后，将培养物转移到检测试管内的相同琼脂培养基中并按上述培养24小时。

用如上所述筛选的等份培养物接种含20ml ST培养基的100ml锥形瓶，培养基中加有终浓度为0.4mg/ml的秋水仙素或硫代秋水仙素。于28℃在旋转振荡器上以200rpm将所述培养物培养过夜。

通过硅胶上的TLC，用丙酮∶乙酸乙酯∶水5∶4∶1洗脱系统，每隔3-4小时分析培养肉汤来检测秋水仙素底物的转化。

培养4天后，将证明有3-糖基衍生物催化活性的培养物样品通过上述梯度稀释重覆到平板上，用于制备试管中新接种物。按与上述相同的条件重复烧瓶中的生物转化检测，但秋水仙素和硫代秋水仙素的终浓度明显较高(1mg/ml)。按实施例3所述，用冷冻低温试管(cryotube)，将活性最大的培养物(底物转化等于或高于80％)用于制备接种物。

                  表

              培养基组成1)LB-琼脂(灭菌：121℃×20’)-pH7胰胨                         10g/l酵母提取物                   5g/l氯化钠                       10g/l琼脂(Agar Agar)              15g/l2)ST肉汤(灭菌：121℃×20’)-pH7葡萄糖                        20g/l甘油                          10g/l胨                            15g/l酵母提取物                    5g/l氯化钠                        3g/l氯化铵                        3g/l磷酸氢二钾                    8g/l磷酸二氢钾                    3g/l七水硫酸镁                    0.5g/l

实施例2

重复实施例1中所述的过程，从巨大芽孢杆菌培养物开始，所述培养物来自下列收集菌株(德国微生物保藏中心，Braunschweig，德国)：DSM90、509、322、333、1667、1670、1671。

DSM    90

DSM    509

DSM    322

DSM    333

DSM    1667

DSM    1670

DSM    1671

在液体培养基中将实施例1所选的并加有硫代秋水仙素(1mg/ml)的培养物培养4天：TLC分析检测是否发生了底物向硫代秋水仙碱苷的转化，转化率为50％(菌株DSM1671)至70％(菌株DSM90)，至80％并更高(菌株DSM333、DSM509、DSM1667、DSM1670)。

实施例3

用上述实施例中筛选的试管中的等份培养样品接种含20ml ST肉汤的100ml锥形瓶。

30℃，在旋转振荡器上以200rpm将肉汤培养物培养过夜。培养后，向培养物中加入终浓度为20％的甘油无菌溶液。然后将培养物分散到2ml低温试管中并随即浸没在液氮中。

数天后，37℃迅速融解10％的培养物。将每个低温试管用于接种含20mlST肉汤的100ml锥形瓶。随后以200rpm将试管在28℃培养过夜(预培养)。培养后，将各2ml的预培养物无菌转移到20ml新鲜ST培养基中，此时加入终浓度为1g/l的秋水仙素或硫代秋水仙素。按实施例1所述的条件完成生物转化并进行检测。分析表明以上述量(80％和更高)发生了底物向3-糖基衍生物的转化，因此证明了冷冻培养物的催化稳定性。

肉汤培养物的平行对照，融解后立即铺在LB琼脂上，证明了冷冻培养物的生存力、均一性和纯度。

实施例4

将低温试管中的等份培养物融解后，用于接种含50mlST培养基的300ml锥形瓶(预培养)。30℃，250rpm培养过夜后，将5ml预培养物转移到50ml加有终浓度为1g/l秋水仙素的相同培养基中。按与上述相同的条件，将培养物培养2天。每隔4小时取样以评估生长水平(测量600nm的吸收值)、秋水仙碱苷产生(YLC和HPLC)、无菌(在LB琼脂上)并进行显微镜形态学检查。

为了进行HPLC分析，在1ml培养肉汤中加入9ml甲醇并以13000rpm离心2分钟。通过反相HPLC，利用水∶乙腈80∶20洗脱系统分析上清液中秋水仙碱苷的含量。

HPLC分析证明秋水仙素向秋水仙碱苷的转化与生长同步进行。培养约26小时后，完成生物转化。

秋水仙碱苷的终产率为80％-85％。

实施例5

重复实施例4中的方法，以相同的终浓度(1g/l)将硫代秋水仙素加入到培养物中代替秋水仙素。

培养物的生长和生产反应与用秋水仙素得到的相似，硫代秋水仙碱苷的产率为约90％。

实施例6

重复实施例4中的方法，以相同的终浓度(1g/l)将3-脱甲基硫代秋水仙素加入到培养物中代替秋水仙素。

培养物的生长和生产反应与上述得到的相似，硫代秋水仙碱苷的产率为约90％。

实施例7

重复实施例4中的方法，以相同的终浓度(1g/l)将N-甲酰硫代秋水仙素加入到培养物中代替秋水仙素。

培养物的生长和生产反应与上述得到的相似，硫代秋水仙碱苷的产率为约90％。

实施例8

用DSM1670菌株的低温试管培养物接种锥形瓶中的1升ST肉汤。30℃，250rpm将烧瓶培养过夜。将接种物无菌转移到14升发酵罐中，所述发酵罐含有9升无菌ST肉汤，其中加入了终浓度为1g/l的硫代秋水仙素。保持适宜的搅拌-通气水平(搅拌率为900rpm；通气1-1.5vvm)，完成发酵。每隔2小时，从培养肉汤中取样并进行下列分析：

-600nm的光密度(OD)

-在LB琼脂上进行菌株的无菌和纯度分析；

-显微镜形态学(革兰氏菌)

-用TLC和HPLC进行硫代秋水仙素的含量分析。

发酵28小时后，向硫代秋水仙碱苷的转化基本完成。终产率为约90％。实施例9

重复实施例8中所述的方法，但在发酵28小时后，仅回收90％的培养肉汤以提取产物(馏份1)。将剩余的10％无菌加到含9升新鲜无菌ST培养基的发酵罐中，所述ST培养基含有10g硫代秋水仙素。按实施例8所述完成发酵。26小时后，收集9升培养肉汤并提取(馏份2)。将剩余体积的培养肉汤加到9升多含硫代秋水仙素的无菌新鲜ST培养基中。26小时后，彻底收集培养肉汤并提取(馏份3)。在所有3轮中，菌株的生物转化活性均能保持稳定，转化率为约90％，与单批过程得到的相比，基本上相应于总硫代秋水仙碱苷产生的3倍。

实施例10

在0.22μm的陶瓷柱体上，将发酵的终培养液(总体积：约27升)进行交叉流动微过滤以便将细胞与培养液分开。渗透物被吸附在用HP21，Mitsubishi吸附树脂填充的柱上。用水洗涤后，用甲醇洗脱产物。将甲醇洗脱液真空下浓缩至干，然后再溶于甲醇。用二氯甲烷重复提取后，将醇馏份浓缩至干并再溶于乙醇-二氯甲烷1∶1混合物中。用硅胶澄清后，真空下浓缩溶液；然后用乙醇代替二氯甲烷。将所得悬浮液浓缩并放置结晶。再溶于乙醇-氯仿混合物并在硅胶上澄清后，用乙醇第二次结晶。

所得产物用HPLC、C-NMR、H-NMR和质谱分析，证明与硫代秋水仙碱苷标准相同。

Claims (4)

1.制备式(I)3-O-糖基秋水仙素类化合物的方法，

其中R₁是O-糖苷基，R₂是氢或C₁-C₇酰基，R₃是C₁-C₆烷氧基或C₁-C₆硫代烷基，该方法包括用浸没培养，于28-40℃，pH6-7，用葡萄糖、果糖或甘油作为碳源并用巨大芽孢杆菌对其中R₁是OH或甲氧基的化合物进行生物转化。

2.权利要求1的方法，制备式(I)化合物，其中R₁是O-葡萄糖苷基。

3.权利要求2的方法，制备秋水仙碱苷和硫代秋水仙碱苷。

4.权利要求1-3的任一方法，其中所用的培养基含有0.1-3g/l其中R₁是羟基或甲氧基的式I化合物。