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CN109486969A - 一种定向筛选产生正丙醇菌株的方法 - Google Patents

一种定向筛选产生正丙醇菌株的方法 Download PDF

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CN109486969A CN201811259131.6A CN201811259131A CN109486969A CN 109486969 A CN109486969 A CN 109486969A CN 201811259131 A CN201811259131 A CN 201811259131A CN 109486969 A CN109486969 A CN 109486969A
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bacterial strain
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卢建军
杨靖
张巧玲
林琳
王和玉
王莉
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Kweichow Moutai Co Ltd
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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种定向筛选正丙醇菌株的方法。本发明公开了一种定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其以正丙醇为目标产物，利用正丙醇代谢途径中的催化酶以及用于表达所述催化酶的生物信息、同时结合高通量测序鉴定的结果确定了候选菌株，并针对候选菌株进行培养，从而筛选出目标菌株，可有效减轻工作量，针对性强，筛选效率较高。

Description

一种定向筛选产生正丙醇菌株的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种定向筛选正丙醇菌株的方法。
背景技术
高级醇是我国传统酒精食品的芳香组分之一，能够反映酒体酯类香气，其含量过低或过高均会影响酒体丰满度与饮后舒适度。正丙醇是一种重要的高级醇，其含量已成为我国酒精类食品检测的一项重要指标。在白酒的发酵过程中，发酵体系中的微生物对正丙醇的含量具有重要的影响，因此，为了了解影响正丙醇含量的微生物，需要对酒醅中在代谢的过程中产生正丙醇的微生物进行筛选。
现有的筛选方法是的大范围的筛选酒醅样品中的菌株，并获得其纯菌株，最后利用发酵试验来验证筛选出的菌株是都是否具有代谢正丙醇的能力，但该方法存在筛选范围广，筛选目标性差，工作量大，筛选结果不可预知等缺点。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种用于定向筛选产生正丙醇菌株的方法。为了实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案为：
本发明公开了一种定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其包括如下步骤：
(1)基于正丙醇的代谢途径利用数据库确定合成途径中的催化酶；
(2)基于数据库收集用于表达(1)中所述催化酶的生物信息；
(3)通过高通量测序技术对酒醅样品中的菌株进行测序鉴定；
(4)将步骤(3)中的测定结果和步骤(2)中的生物信息进行比对，根据比对结果确定候选菌株；
(5)基于(4)得到的所述候选菌株的种属，采用候选菌株筛选培养基进行纯化培养，得到目标菌株的单菌落；
(6)对(5)中分离得到的所述目标菌株的单菌落进行测序鉴定；
(6)针对(6)所得到的目标菌株纯培养，进行相应的液态培养基发酵验证其产正丙醇能力。
KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库。把从已经完整测序的基因组中得到的基因目录与更高级别的细胞、物种和生态系统水平的系统功能关联起来是KEGG 数据库的特色之一。人工创建了一个知识库，这个知识库是基于使用一种可计算的形式捕捉和组织实验得到的知识而形成的系统功能知识库。它是一个生物系统的计算机模拟。与其他数据库相比，KEGG的一个显著特点就是具有强大的图形功能，它利用图形而不是繁缛的文字来介绍众多的代谢途径以及各途径之间的关系，这样可以使研究者能够对其所要研究的代谢途径有一个直观全面的了解。各个数据库中包含了大量的有用信息。基因组信息存储在 GENES数据库里，包括完整和部分测序的基因组序列；更高级的功能信息存储在PATHWAY 数据库里，包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，还包括同系保守的子通路等信息；KEGG的另一个数据库LIGAND，包含关于化学物质、酶分子、酶反应等信息。
通过与世界上其它一些大型生物信息学数据库的连接，KEGG可以为研究者提供更为丰富的生物学信息(LinkDB)。KEGG提供了Java的图形工具来访问基因组图谱，比较基因组图谱和操作表达图谱，以及其它序列比较、图形比较和通路计算的工具，可以免费获取。
因此，作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，利用KEGG数据库确定正丙醇的合成途径。
优选地，步骤(1)中的代谢途径为丙酸代谢通路。
优选地，步骤(2)中，利用NCBI数据库确定用于表达所述催化酶的生物信息。
优选地，所述催化酶为丙酸代谢通路中催化丙醛产生正丙醇的酶，为1,3-丙二醇脱氢酶
优选地，所述生物信息包括能够表达关键催化酶蛋白的微生物种属。
优选地，步骤(3)中，所述高通量测序技术为焦磷酸测序技术。
优选地，本发明中，步骤(3)中，所述酒醅样品选自酱香型白酒造沙酒醅，但又不限于此。
优选地，所述目标菌株为乳杆菌属。
优选地，所述的目标菌株为面包乳杆菌、桥乳杆菌、布氏乳杆菌和戊糖乳杆菌。
更为优选地，为面包乳杆菌。
作为一种实施方式，所述的步骤(5)中，所述候选菌株筛选培养基为MRS培养基。
优选地，步骤(6)中的所述鉴定方法为16SrDNA测序鉴定技术。
作为一种优选的实施方式，步骤(7)中，所述液态培养基的组分包括：胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温80 1ml，余量为蒸馏水，pH为6.2-6.6。
还有一方面，本发明还提供了一种利用上述筛选出来的菌株产正丙醇的应用。
优选地，所述产正丙醇的菌株选自乳杆菌属。
更为优选地，所述产正丙醇的菌株选自面包乳杆菌、桥乳杆菌、布氏乳杆菌和戊糖乳杆菌。
最为优选地，所述产正丙醇的菌株为面包乳杆菌。
即本发明通过研究发现，面包乳杆菌可以产生正丙醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明以正丙醇为目标产物，利用正丙醇代谢途径中的催化酶以及用于表达所述催化酶的生物信息、同时结合高通量测序鉴定的结果确定了候选菌株，并针对候选菌株进行培养，从而筛选出目标菌株，可有效减轻工作量，针对性强，筛选效率较高。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
附图说明
图1为4种乳杆菌发酵液的TIC图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。实施例作为非限制性的例子，并非对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
酱香型白酒造沙酒醅指的是酱香型白酒酿造过程包括下沙轮次、造沙轮次以及一至七轮次，本发明实施例中的造沙酒醅为酱香型白酒酿造过程中造沙轮次的酒醅。
实施例1：筛选酱香型白酒造沙酒醅发酵过程中产生正丙醇目标菌株
本发明中，主要针对酱香型白酒造沙酒醅发酵过程中产生正丙醇的菌株进行定向筛选，具体包括如下步骤：
(1)根据正丙醇的代谢途径利用KEGG数据库确定正丙醇代谢途径中的关键催化酶，结果表明：所述代谢途径为丙酸代谢通路；所述关键催化酶为丙酸代谢通路中催化丙醛产生正丙醇的酶，为1,3-丙二醇脱氢酶。
(2)根据(1)确定的催化酶，利用NCBI数据库检索用于表达所述催化酶的生物信息，所述生物信息主要包括能够表达关键催化酶的微生物种属，并结合上述生物信息确定能够表达所述催化酶的微生物主要集中在190个属，其中185个属为细菌，1个属为真菌，4个属为古菌。
(3)利用454焦磷酸测序平台对酒醅样品中的微生物进行高通量测序鉴定，分析其测序结果，结果表明：酒醅样品中的微生物以乳酸菌为主，且Lactobacillus(乳杆菌属)占比可达75％左右。
(4)将步骤(3)中的鉴定结果与步骤(2)中的生物信息进行比对，并确定以Lactobacillus (乳杆菌属)为目标菌株。
实施例2：目标菌株的分离与鉴定
(1)制备分离培养基(MRS培养基)
称取胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温80 1mL、琼脂18g于容器中，加入蒸馏水溶解并定容至1L，此时pH6.2-6.4，然后在121℃的温度下灭菌15min；
(2)将酱香型白酒造沙酒醅样品悬液用无菌水进行梯度稀释，将稀释104-107倍的悬液涂布于乳酸菌分离培养基表面，37℃，厌氧培养3-5d；挑选适当稀释梯度，对该梯度平板中的所有单菌落分别进行纯化与保存，并将分离纯化后的单菌落进行16SrDNA测序，以鉴定其种属，共计得到12种乳杆菌属微生物。
实施例3：目标菌株产正丙醇的发酵验证
(1)制备液态培养基
称取胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温80 1mL于容器中，加入蒸馏水溶解并定容至 1L，此时pH6.2-6.4，然后在121℃的温度下灭菌15min；
从实施例2中分离得到的12种乳杆菌属中选取4种纯培养占比较高的乳杆菌各1株，具体为面包乳杆菌、桥乳杆菌、布氏乳杆菌、戊糖乳杆菌，其在造沙轮次酒醅可培养乳杆菌中的占比分别为10.03％、15.47％、14.33％、9.17％，并分别编号为L1、L2、L3以及L4，再将上述4 种乳杆菌接种于上述液体培养基中，发酵液中4种乳杆菌初始接种浓度为106个/mL，在37℃的条件下厌氧培养7d。收集4株菌的培养基。
(2)测定正丙醇的含量
利用静态顶空气相色谱质谱联用方法测定(1)中4种培养基中正丙醇的含量，其具体步骤如下所示：
A首先吸取发酵液样品5mL和2gNaCl加入20mL顶空进样瓶中，加入加入3μL叔戊醇乙醇溶液(19920ppm)作为内标，压盖，置于顶空自动进样器进样盘中；对所述样品瓶进行加热孵育，孵育室温度70℃，孵育时间10min，振摇频率高，定量环温度100℃，传输线温度130℃，进样体积3mL，GC循环时间22min；加热孵育完成后，进行静态顶空气体进样。
B气相色谱(GC)条件：色谱柱为毛细管气相色谱柱30m×0.25mm×0.25μm(Agilent)，进样口温度230℃，分流比30:1，载气为He，流速为0.8mL/min。柱温采用程序升温：40℃用于 1min，然后以1℃/min到45℃用于0min，然后以35℃/min到220℃用于7min，运行时间：18min。
C质谱条件(MS)：电子轰击离子源(EI)，电子能量70eV，离子源温度230℃，接口温度250℃。扫描质量范围33～350amu。采集模式：SCAN和SIM，溶剂延迟：2min。SIM参数：组1为1- 丙醇，绘图离子为59。
在气相色谱-质谱联用分析步骤，通过气相色谱仪分离后，进入质谱仪进行定性定量分析，得到发酵液中正丙醇的含量，具体结果如图1所示。
从图1中可以看出，在4种乳杆菌的发酵验证中，L1中有正丙醇的检出，其检出量为59.98mg/L，其余三株面包乳杆菌无正丙醇检出。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)基于正丙醇的代谢途径利用数据库确定合成途径中的催化酶；
(2)基于数据库收集用于表达(1)中所述催化酶的生物信息；
(3)通过高通量测序技术对酒醅样品中的菌株进行测序鉴定；
(4)将步骤(3)中的测定结果和步骤(2)中的生物信息进行比对，根据比对结果确定候选菌株；
(5)基于(4)中得到的所述候选菌株，采用候选菌株筛选培养基进行纯化培养，得到目标菌株的单菌落；
(6)对(5)中分离得到的所述目标菌株的单菌落进行测序鉴定；
(7)针对(6)所得到目标菌株纯培养，进行相应的液态培养基发酵验证其产正丙醇能力。
步骤(3)中，所述高通量测序技术为焦磷酸测序技术。
2.如权利要求1所述的定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的数据库为KEGG数据库；
步骤(2)中，所述的数据库为NCBI数据库。
3.如权利要求1或2所述的定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：步骤(1)中的代谢途径为丙酸代谢途径；
所述催化酶为1,3-丙二醇脱氢酶。
4.如权利要求1所述的定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：所述生物信息包括能够表达关键催化酶的微生物种属。
5.如权利要求1所述的定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的酒醅样品选自酱香型白酒造沙酒醅。
6.如权利要求1所述的定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：所述候选菌株为乳杆菌属；
优选地，为面包乳杆菌、桥乳杆菌、布氏乳杆菌和戊糖乳杆菌；
更为优选地，为面包乳杆菌。
7.如权利要求1所述的定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：步骤(5)中，所述筛选培养基为MRS培养基。
8.如权利要求1所述的定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：步骤(6)中，所述测序鉴定方法为16SrDNA测序鉴定技术。
9.如权利要求1所述的定向筛选产生正丙醇菌株的方法，其特征在于：步骤(7)中，
所述液体培养基的组分包括：胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，吐温80 1ml，余量为蒸馏水，pH为6.2-6.6。
10.权利要求1-9任一所述的菌株在生产正丙醇中的应用；
优选地，所述的菌株为乳杆菌属；
更为优选地，所述的乳杆菌选自面包乳杆菌、桥乳杆菌、布氏乳杆菌和戊糖乳杆菌；最为优选地，所述的乳杆菌为面包乳杆菌。
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