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CN109476756A - 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途 - Google Patents

一种多特异性Fab融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了特异性结合CD3和EpCAM的多特异性Fab融合蛋白(MSFP)，本发明还提供了所述MSFP在制备药物组合物中的用途、治疗癌症的方法和包含MSFP的试剂盒。还提供了抗EpCAM抗体或其抗原结合片段。

Description

一种多特异性Fab融合蛋白及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年3月15日提交的中国专利申请号201610147227.8的优先权，所述申请全部内容通过引用以其整体并入本文。
序列表文本文件
以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：720622000841SEQLIST.txt；记录日期：2017年3月13日，大小48KB)。
技术领域
本发明涉及特异性结合CD3和EpCAM的多特异性Fab融合蛋白(MSFP)，本发明还提供了包含所述Fab融合蛋白的药物组合物、使用所述MSFP治疗癌症的方法和包含所述MSFP的试剂盒。
背景技术
某些抗原在肿瘤组织中过度表达、突变或选择性突变。因而，靶向癌细胞表面特异性抗原的抗体可用作癌症治疗药。上皮细胞粘附因子(EpCAM，CD326)是一种分子量为40KD的跨膜糖蛋白，也被称为17-1A、ESA、AUA1、EGP40等，具有314个氨基酸。EpCAM在多种上皮细胞和主要类型的人类恶性肿瘤中特异表达。例如，EpCAM在结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌以及卵巢癌中均高表达。因而，EpCAM已成为癌症治疗中的热点靶点，包括疫苗、鼠源或人源单克隆抗体，以及与细菌毒素或化疗药缀合的抗体，如EpCAM特异性的抗体ING-1、阿德木单抗(Adecatumumab)、依决洛单抗(edrecolomab)等。
CD3(其包含3条不同多肽链(ε、δ和γ链))是由T细胞表达的抗原。3条CD3多肽链与T细胞受体(TCR)和ζ链结合以形成TCR复合物，其具有活化T细胞中信号转导级联的功能。目前，多种治疗策略靶向TCR信号转导，以使用抗人CD3单克隆抗体治疗疾病。CD3特异的抗体OKT3是第一个批准用于人类治疗用途的单克隆抗体，在临床上作为免疫调节剂用于治疗同种异体移植物排斥。
在过去二十年中，在双特异性抗体领域的努力已逐渐获得临床上的成功。在2009年，Cantomaxomab(抗-CD3，抗-EpCAM三功能性抗体)在欧盟被批准用于治疗有症状的恶性腹水。然而，虽然已显示双特异性抗体在有效杀伤癌细胞方面具有潜力，但是严重的副作用(包括全身免疫激活、免疫原性(抗药物抗体作用)和这些分子的普遍较差的可生产性)已极大地限制了此类药物的广泛应用。CD19xCD3双特异性scFv-scFv(单链可变区片段)融合蛋白(博纳吐单抗(Blinatumomab))的另一个缺点是，由于其半衰期短且不兼容皮下施用，这种药物需要每日静脉内(i.v.)施用；然而，在临床试验过程中仍发生了神经学反应，如定向障碍、错乱、言语障碍、震颤或抽搐(Science321:974-977，2008)。为了更好地控制这些不希望发生的副作用，在更长时间段中以连续输注静脉内施用双特异性单链抗体(BiTE)。US20120244161公开了EpCAM×CD3双特异性scFv-scFv融合蛋白(MT110)的I期临床试验，其中应用了低剂量(1-12μg/kg/24小时)静脉连续输注长时间段，并且在MT110输注或剂量增加前施用糖皮质激素。此外，scFv-scFv融合蛋白有聚集的倾向。
目前的双特异性抗体形式的缺点对于这些药物以良好的有效性和安全性广泛应用于治疗癌症患者仍然是巨大的挑战。因此，本领域存在迫切需要开发具有改善的功效、稳定性、安全性和可生产性的新的双特异性抗体或治疗方案。
发明简述
本发明提供了一种特异性结合CD3和EpCAM的多特异性Fab融合蛋白(如双特异性Fab蛋白(BSFP))，以及使用所述多特异性Fab融合蛋白(MSFP)治疗癌症的方法。
在本发明的一个方面，提供了一种治疗个体(如人类个体)中的癌症的方法，所述方法包含对个体施用有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域，其中所述结合域与所述Fab片段N端连接，其中所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述结合域是scFv。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中所述第一scFv与所述Fab片段VH的N端融合，所述第二scFv与所述Fab片段VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和所述第二scFv具有相同的序列。
根据任意一种前文所述方法，在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率(如少于约1、2、3、4、6、9、或12个月一次中的任何，如单次施用)施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴约0.1μg/kg至约100μg/kg(如约0.3μg/kg至约5μg/kg，或约5μg/kg至约20μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以不引起细胞因子风暴的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴不高于约30μg/kg(如不高于约20μg/kg、10μg/kg或1μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述个体是人类个体。
根据任意一种前文所述方法，在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以第一剂量施用于个体第一时间段，并且随后，所述多特异性Fab融合蛋白以第二剂量施用于个体第二时间段，并且其中所述第二剂量超过所述第一剂量。在一些实施方式中，所述第二时间段超过所述第一时间段。在一些实施方式中，所述第一时间段为至少约7天。在一些实施方式中，所述第二时间段为至少约2周。在一些实施方式中，所述第一剂量不超过约1μg/kg。在一些实施方式中，所述第二剂量为约0.1μg/kg至约10μg/kg。
根据任意一种前文所述方法，在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素。在一些实施方式中，所述糖皮质激素是地塞米松。在一些实施方式中，所述糖皮质激素在所述多特异性Fab融合蛋白的第一剂量之前施用。在一些实施方式中，所述糖皮质激素以约0.1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用。
根据任意一种上述的方法，在一些实施方式中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的N端，如CD3ε的氨基酸1-27内的表位。在一些实施方式中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方式中，所述Fab片段的VL包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述Fab片段的VH包含与选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段的VL包含与选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含人免疫球蛋白的重链恒定区1(CH1)，所述重链恒定区1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含人λ轻链恒定区，所述人λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段的CH1和CL通过一个或更多二硫键连接。在一些实施方式中，所述Fab片段包含第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
根据任意一种上述的方法，在一些实施方式中，所述癌症是EpCAM阳性实体癌。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性癌是癌瘤(carcinoma)或腺癌(adenocarcinoma)。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性癌选自下组：小肠癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胆管癌、和头颈癌。在一些实施方式中，所述癌症是结肠直肠腺癌。在一些实施方式中，所述癌症是肺腺癌。
根据任意一种上述的方法，在一些实施方式中，所述结合域(如scFv)包含N-VH-VL-C融合多肽。在一些实施方式中，所述scFv的VH包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方式中，所述scFv的VL包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述scFv的VH包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述scFv的VL包含与SEQ IDNO:20的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述scFv包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
根据任意一种上述的方法，在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
本发明还提供了一种抗EpCAM抗体。在一些实施方式中，提供了抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，(2)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和(3)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1；(2)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2；和(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述重链可变结构域序列包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述轻链可变结构域序列包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
根据任意一种上述的抗EpCAM抗体，在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体包含人IgG的Fc序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体是多特异性抗体，如双特异性抗体。
根据任意一种上述的抗EpCAM抗原结合片段，在一些实施方式中，所述抗原结合片段是单链Fv(scFv)。在一些实施方式中，所述scFv包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了一种多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述多特异性Fab融合蛋白包含任意一种前文所述的抗EpCAM抗原结合片段。在一些实施方式中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白包含特异性结合CD3的Fab片段、抗EpCAM抗原结合片段的第一拷贝、和抗EpCAM抗原结合片段的第二拷贝；其中，所述抗EpCAM抗原结合片段的第一拷贝与所述Fab片段的VH的N端融合；并且，其中所述抗EpCAM抗原结合片段的第二拷贝与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的N端，如CD3ε的氨基酸1-27内的表位。在一些实施方式中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3。在一些实施方式中，所述Fab片段的VL包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述Fab片段的VH包含与选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段的VL包含与选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含人免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含人λ轻链恒定区，所述人λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段的CH1和CL通过一个或更多二硫键连接。在一些实施方式中，所述Fab片段包含第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包含任意一种上述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或多特异性Fab融合蛋白和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的癌症的方法，所述方法包含对个体施用有效量的所述组合物。
本发明还进一步提供了编码上述的多特异性Fab融合蛋白(MSFP)、抗EpCAM抗体或其抗原结合片段的分离的核酸分子、包含所述分离的核酸分子的表达载体、包含所述表达载体的分离的宿主细胞，以及生产所述的MSFP、抗EpCAM抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养所述分离的宿主细胞和从细胞培养物中回收所述的MSFP、抗EpCAM抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了包含任意一种上述的多特异性Fab融合蛋白或抗EpCAM抗体或其抗原结合片段的用途、组合物(如药物组合物)、试剂盒以及制品。
本发明还提供了任意一种上述的多特异性Fab融合蛋白或任意一种上述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
根据随后的详细描述和所附的权利要求书，本发明中的这些和其它方面和优点是明显的。应理解，本发明所述的多种实施方式中的一个、一些或所有性质可与本发明的其他实施方式组合。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开专利申请的公开内容由此通过提述以其整体并入本文。
附图说明
图1描绘了一种例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白的结构。
图2A描绘了一种纯化的例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(下文称为ITAB1002)在非还原条件下的SDS-PAGE凝胶。非还原SDS-PAGE显示，纯化蛋白的分子量为约100kD，与EpCAM×CD3Fab融合蛋白的理论分子量相似。
图2B描绘了纯化的ITAB1002在还原条件下SDS-PAGE凝胶。还原SDS-PAGE显示，纯化蛋白的表观分子量为约45kD-约66kD。
图3A描绘了纯化的ITAB1002在非还原条件下的CE-SDS分析结果。非还原CE-SDS分析在迁移时间约为21.59分钟处显示单一的蛋白峰。
图3B描绘了纯化的ITAB1002在还原条件下的CE-SDS分析结果。还原CE-SDS分析在迁移时间约为18.37分钟、18.84分钟处显示两个单一的蛋白峰，分别对应于Fab融合蛋白的轻链和重链。
图4A描绘了ITAB1002对表达细胞表面抗原CD3的人PBMC的结合亲和力。
图4B描绘了ITAB1002对表达细胞表面抗原CD3的食蟹猴PBMC的结合亲和力。
图5描绘了ITAB1002对表达细胞表面抗原EpCAM的SW480细胞和CyEpCAM-CHO细胞的结合亲和力。
图6A描绘了ITAB1002和OKT3在不同条件下激活CD4+人PBMC的能力。
图6B描绘了ITAB1002和OKT3在不同条件下激活CD8+人PBMC的能力。
图6C描绘了ITAB1002在不同条件下刺激CD4+人PBMC增殖的能力。
图6D描绘了ITAB1002在不同条件下刺激CD8+人PBMC增殖的能力。
图7描绘了ITAB1002介导的人或食蟹猴PBMC对SW480肿瘤细胞的细胞毒性。
图8描绘了ITAB1002介导的人PBMC对几种代表性的癌细胞系的细胞毒性。
图9A描绘了不同剂量的ITAB1002对小鼠中与人PBMC共接种的皮下SW480异种移植物的生长抑制作用。
图9B显示了来自不同治疗组中的小鼠在实验结束时的肿瘤照片。
图10A描绘了在用人PBMC免疫系统重建的免疫缺陷小鼠中，不同剂量的ITAB1002对SW480异种移植物的生长抑制作用。
图10B显示了来自不同治疗组中的小鼠在实验结束时的肿瘤照片。
图10C显示了实验结束时小鼠的白细胞样品中人CD3+细胞的百分比。
图11描绘了在用人PBMC免疫系统重建的免疫缺陷小鼠中，不同剂量的ITAB1002对NCI-H1975异种移植物的生长抑制作用。
图12A描绘了在以不同剂量静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血液中CD4+T细胞数随时间的变化(X轴：H＝小时；D＝天)。
图12B描绘了在以不同剂量静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血液中CD8+T细胞数随时间的变化(X轴：H＝小时；D＝天)。
图13A描绘了在以不同剂量静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血清中IL-2浓度随时间的变化。
图13B描绘了在以不同剂量静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血清中IL-4浓度随时间的变化。
图13C描绘了在以不同剂量静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血清中IL-5浓度随时间的变化。
图13D描绘了在以不同剂量静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血清中IL-6浓度随时间的变化。
图13E描绘了在以不同剂量静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血清中TNF浓度随时间的变化。
图13F描绘了在以不同剂量静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血清中IFN-γ浓度随时间的变化。
图14描绘了在以不同剂量单次静脉内施用ITAB1002后，食蟹猴血清中ITAB1002浓度随时间的变化。。
图15比较了ITAB1002与ITAB1012介导的人PBMC对SW480肿瘤细胞的细胞毒性。
图16描绘了在地塞米松(DXM)存在或缺失的情况下，MSFP介导的对SW480细胞杀伤活性。
图17描绘了在地塞米松(DXM)存在或缺失的情况下，MSFP介导的人T细胞的IL-6释放。
图18A显示了只用ITAB1002治疗的猴子中丙氨酸氨基转移酶(ALT)血清水平。
图18B显示了用ITAB1002及地塞米松(DXM)预处理治疗的猴子中丙氨酸氨基转移酶(ALT)血清水平。
图19A显示了只用ITAB1002治疗的猴子中总胆红素(TBil)血清水平。
图19B显示了用ITAB1002及地塞米松(DXM)预处理治疗的猴子中总胆红素(TBil)血清水平。
图20A显示了只用ITAB1002治疗的猴子中碱性磷酸酶(ALP)血清水平。
图20B显示了用ITAB1002及地塞米松(DXM)预处理治疗的猴子中碱性磷酸酶(ALP)血清水平。
图21A显示了只用ITAB1002治疗的猴子的IL-6水平。
图21B显示了用ITAB1002及地塞米松(DXM)预处理治疗的猴子中IL-6水平。
发明详述
本发明提供了通过施用一种多特异性Fab融合蛋白(MSFP)治疗癌症的方法，所述MSFP包含特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)。在一些实施方式中，所述MSFP包含抗CD3Fab片段，所述Fab片段的重链和轻链多肽的N端各自与抗EpCAM的scFv融合。本领域目前的抗癌双特异性抗体遭受较差的可生产性、聚集、短的半衰期、严重的副作用、长的输注时间，与之不同，本文所述的多特异性Fab融合蛋白具有改进的稳定性和安全性概貌，这使得用较低的剂量和减少的施用频率的治疗方法成为可能，避免不希望发生的副作用如引起细胞因子风暴。减少的施用频率和缩短的输注时间便于患者的治疗，有利于改善患者的生存质量。例如，令人惊奇地发现本文所述的MSFP可以约0.01μg/kg到约250μg/kg、如约0.01μg/kg到5μg/kg、约0.1μg/kg到30μg/kg、或约2.5μg/kg到100μg/kg的剂量施用。还提供了新的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段。
本发明所述的MSFP相较于本领域中已知的其他多特异性Fab融合蛋白具有以下优点：所述MSFP具有较高的稳定性，和增强的杀伤癌细胞的功效。本发明的MSFP的延长的半衰期使得更低的施用频率和更短的输注时间成为可能，为患者提供更多的便利。本发明的MSFP与灵长类如食蟹猴的交叉反应性促进了毒理学研究。本发明的MSFP具有较少的副作用，包括减少的神经作用，在食蟹猴中良好的安全性和耐受性。
因此，在一个方面，本发明提供了治疗个体中的癌症的方法，包含对个体施用有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合CD3的Fab片段，和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，并且其中所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg到约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg、约0.1μg/kg至约30μg/kg、或约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。
在另一方面，本发明提供了一种抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：(1)包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1，(2)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和(3)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，(2)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
还提供了用于本发明所述方法的试剂盒和制品。
I.术语
除非特定的相反指示，否则本发明的实施将采用病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和本领域技术内的重组DNA技术的常规方法，出于说明的目的其中有许多方法在以下描述。此类技术在以下的文献中详细解释。参见，例如Current Protocols in MolecularBiology or Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology,第3版,Wiley&Sons,1995；Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版,2001)；Maniatis等Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:A PracticalApproach,第I和II卷(D.Glover编)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins编,1985)；Transcription andTranslation(B.Hames&S.Higgins编,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney编,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)和其它类似的参考文献。
如本发明所用，术语“治疗”是指经设计以改变受治疗个体或细胞在临床病理学过程中的自然进程的临床干预。理想的治疗效果包括减少疾病进展的几率，改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善的预后。例如，若与肿瘤相关的一个或多个症状被减轻或消除(包括但不限于减少癌细胞的增殖或破坏癌细胞、减少疾病导致的症状、增加罹患疾病的那些(患者)的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量和/或延长个体的存活时间)，则认为该个体被成功地“治疗”。
如本发明所用，术语“有效量”是指能够有效受试者的疾病或病症的药剂或药物的含量。在癌症的例子中，药剂的有效量可减少癌细胞的数量；减小肿瘤的体积；抑制(即在一定程度上减缓且优选阻止)癌细胞浸润外周器官；抑制(即在一定程度上减缓且优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或一定程度上减轻与癌症相关的一个或多个症状。如在临床的语境中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可以或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物一起联用的情况下实现。因此，“有效量”可在施用一种或多种治疗剂的语境中被考虑，而且可考虑以有效量给予单一药剂，如果(与一种或多种其他药剂联用时)可实现或实现了合意的结果的话。
如本发明所用，术语“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于，人，牛，马，猫，犬，啮齿动物，或灵长类。在一些实施方式中，个体是人。
术语“抗体”在最宽泛的意义上使用，并具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段只要它们呈现合意的生物活性或功能即可。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。
术语“天然抗体”、“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”可互换使用，指基本上完整形式的抗体，而非如下定义的抗体片段。该术语具体地指具有包含Fc区的重链的抗体。天然抗体通常为约150kD大小的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)构成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链相连，同时，在不同免疫球蛋白亚型的重链中二硫键的数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链间二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH)然后是多个恒定域。每条轻链在一端具有可变域(VL)且在其另一端具有恒定域；轻链恒定域与重链的第一个恒定域相对齐，并且轻链可变域和重链的可变域相对齐。据信，特定氨基酸残基形成轻链和重链可变域之间的接口。
术语“恒定区”是指相对于免疫球蛋白其他部分(包含抗原结合位点的可变区)而言，具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定区包含重链的CH1、CH2和CH3域(通称CH)和轻链的CHL(或CL)。
所述“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链的氨基末端域。重链的可变域可称为“VH”。轻链的可变域可称为“VL”。这些域一般为抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间在序列上差异广泛并用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，可变性并非均匀分布遍及抗体的可变域。它集中于轻链和重链可变域二者中称作高变区(HVR，也称为CDR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各包含四个FR区，它们大多采取β片层构型，通过形成环状连接(且在有些情况中形成β片层结构的部分)的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区紧密接近的保持在一起，并与来自另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Immunological Interest，第5版，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。
所述来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，基于它们恒定域的氨基酸序列可分为两个清晰的独特类型，称为“κ”和“λ”。
本发明使用的术语“同种型”或“亚类”意指由它们恒定区的化学或抗原特征所定义的免疫球蛋白任何亚类。
取决于重链的恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可分为不同的类别。免疫球蛋白有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。还可进一步分为许多亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定域可分别称为：α，γ，ε，γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是已知的，并通常描述于，例如，Abbas等,Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可为一个较大融合分子的一部分，通过抗体与一个或多个其他蛋白或肽的共价或非共价键连接而形成。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。在一些实施方式中，所述抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段(各有一个单一的抗原结合位点)，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理抗体产生F(ab’)2片段，它具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一些实施方式中，双链Fv由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。在单链Fv(scFv)中，一个重链可变域和一个轻链可变域可通过柔性肽接头共价连接，从而重链和轻链可以类似于双链Fv的“二聚体”结构结合。在此构型中，每个可变域的三个HVR相互作用以在VH-VL二聚体的表面限定抗原结合位点。共同地，六个HVR赋予抗体以抗原结合特异性。然而，甚至单个可变域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点更低的亲和力结合。
Fab片段具有两个多肽链，包含重链及轻链可变域，并且还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定域(CH1)。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端添加了少数残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段不同。Fab’-SH是本文中对其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab’)2抗体片段最初作为成对Fab’片段产生，其在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学缀合也是已知的。
“单链Fv”，或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域以单一多肽链存在。通常，scFv多肽进一步包含在VH与VL域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的合意结构。关于scFv的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,Springer Berlin Heidelberg,1994.269-315。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应器功能由Fc区中的序列决定，该区也是被在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
如本发明所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，例如，群体中包含的个体抗体是相同的，除了可能的可以少量存在的突变(例如天然存在的突变)之外。因此，修饰语“单克隆”指示所述抗体的特征在于不是离散的抗体的混合物。在一些实施方式中，此种单克隆抗体通常包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中所述靶物-结合多肽序列是通过包括从多个多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列的过程获得的。例如，所述选择过程可为从多个克隆(如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、或重组DNA克隆的汇集物)中选择唯一的克隆。应理解的是，所选择的靶物结合序列可被进一步改变，例如，以改进对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、改进其在细胞培养中的产量、降低其体内免疫原性、创造多特异性抗体等，而且包含改变的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包括定向针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物中的各单克隆抗体定向针对抗原上的单个决定簇。除了它们特异性之外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”指示抗体是从基本上同质的抗体群体获得的特征，不应理解为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，待依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制成，包括例如杂交瘤方法(例如Kohler和Milstein.,Nature,256:495-97(1975)；Hongo等,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling等,MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))；重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，以及用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等,Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)；和Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
所述单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们呈现合意的生物学活性(参见例如，美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫短尾猴(macaque monkey)而生成的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方式中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR的残基用非人物种(供体抗体)如具有合意的特异性、亲和力和/或能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的HVR残基替换。在一些实施方式中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。可进行这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个中的基本上全部可变域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。更多细节参见例如Jones等,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见例如Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利号6,982,321和7,087,409。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义具体排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中所述的方法(Cole等,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,77(1985)；Boerner等,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001))。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失去能力的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，关于经由人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
如本文所用，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变结构域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3在这六个HVR中显示最大的多样性，而且H3被特别地认为在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu等,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu,于Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在的骆驼科(camelid)抗体在缺乏轻链时是有功能且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。HVR也称为“CDR”或“互补决定区”。
免疫球蛋白可变区的结构和位置可通过参考Kabat,E.A.等,Sequences ofProteins of Immunological Interest.第4版.US Department of Health and HumanServices.1987及其更新(目前可在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上获得)来确定。
“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些可变结构域残基。
如本文所用，术语“结合”，“特异性结合”或“对…特异性的”指可测量且可再现的相互作用，如靶物和抗体之间的结合，其确定在存在分子(包括生物学分子)的异质群体的情况中靶物的存在。例如，结合或特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更大的亲和力(affinity)、亲合力(avidity)，更容易，和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体。在一个实施方式中，抗体结合无关靶物的程度比抗体结合靶物的程度小约10％，例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在一些实施方式中，特异性结合靶物的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在一些实施方式中，抗体特异性结合蛋白质上在来自不同物种的蛋白质间保守的表位。在另一个实施方式中，特异性结合可包括但不需要排他结合。
如本文所用，关于肽，多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为候选序列中的氨基酸残基与特定肽链或多肽序列的氨基酸残基相同的百分比，通过对齐序列并在必要时引入缺口以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比的对齐比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST，BLAST-2，ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
氨基酸取代可包括但不限于用另一种氨基酸取代多肽中的一个氨基酸。例示性取代显示在表A中。可将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并筛选所需活性的产物，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表A
氨基酸可根据常见的侧链性质分组为：(1)疏水性氨基酸：正亮氨酸(Norleucine)，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2)中性亲水氨基酸：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；(3)酸性氨基酸：Asp，Glu；(4)碱性氨基酸：His，Lys，Arg；(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；(6)芳香族氨基酸：Trp，Tyr，Phe。非保守替换将需要将这些类别中的一个组的成员替换为另一组类别的氨基酸。
如本文所用，“Fab融合蛋白”指具有共价连接至一个或更多结合域的Fab片段的蛋白，其中所述结合域相对于所述Fab片段具有不同的特性。所述特性可以是生物学特性，如体外或体内活性。所述特性也可以是简单的化学或物理特性，如结合靶物分子，催化反应，等等。所述Fab片段和所述一个或更多结合域可通过肽键直接连接或者经由肽接头连接，但是彼此之间符合读框。
术语“多特异性”与抗体(例如Fab融合蛋白)联用时指抗体(例如Fab融合蛋白)具有多表位特异性(例如能够特异性结合一个生物分子上的两个、三个、或更多不同表位，或能够特异性结合不同生物分子上的两个、三个、或更多不同表位)。
术语“双特异性”与抗体(例如Fab融合蛋白)联用时指抗体(例如Fab融合蛋白)能够特异性结合一个生物分子上的两个不同表位，或能够特异性结合两个不同生物分子上表位。除有其它说明，双特异性抗体或Fab融合蛋白名称中列出的由双特异性抗体结合的抗原的顺序是任意的，即，术语“抗CD3/EpCAM”、“抗-EpCAM/CD3”、“EpCAM×CD3”和“CD3×EpCAM”可互换使用，指特异性结合CD3和EpCAM的双特异性抗体(如双特异性Fab融合蛋白)。
术语“多特异性Fab融合蛋白”和“MSFP”在本文中可互换使用，指具有多表位特异性的Fab融合蛋白。
如本文所用，多肽的“C端”是指该多肽的最后一个氨基酸残基，其贡献其氨基与其邻接氨基酸残基的羧基形成肽键。本文所用的多肽的“N端”是指该多肽的第一个氨基酸，其贡献其羧基与其邻接氨基酸残基的氨基形成肽键。
如本文所用，术语“载体”指能增殖与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体，以及整合入其中已导入载体的宿主细胞的基因组的载体。某些载体能指导与其可操作地连接的核酸的表达，这些载体在本文中称为“表达载体”。
术语“细胞”包含原代受试者细胞及其后代。
术语“细胞因子风暴”，也称为“细胞因子级联”或“高细胞因子血症”，是一种通常由细胞因子和免疫细胞之间正反馈环组成的潜在致命免疫反应，伴有多种细胞因子水平的高度升高(例如INF-γ、IL-10、IL-6、CCL2等)。
应理解，本发明中所描述的实施方式包括“由…组成”和/或“基本上由…组成”的实施方式。
涉及“约”一个值或参数包含(和描述)指向该值或参数本身的变化。例如有关“约X”的描述包含“X”的描述。
如本发明所用，涉及“不/非”一个值或参数通常指和描述为“除了”一个值和参数“之外”。例如，所述方法不用于治疗X类型癌症意指所述方法用于治疗除了X类型外的癌症。
术语“约X-Y”与“约X至约Y”具有相同意义。
如本发明和所附权利要求中所用，除非上下文明确另外指明的，单数形式“一个/一种”、“或”、和“所述/该”包含复数指称。
II.治疗癌症的方法
本发明的一个方面，提供了一种治疗个体(如人)中的癌症的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述多特异性Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中所述结合域(如scFv)与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg到约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg、约0.1μg/kg至约30μg/kg、约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法不引起细胞因子风暴。
在一些实施方式中，提供了一种杀伤个体中(如人)癌细胞的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述多特异性Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域(如scFv)与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg、约0.1μg/kg至约30μg/kg、约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，由所述MSFP介导的肿瘤细胞死亡率为至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多中的任意一个。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法不引起细胞因子风暴。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种抑制个体中(如人)癌细胞增殖的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述多特异性Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域(如scFv)与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg、约0.1μg/kg至约30μg/kg、约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法不引起细胞因子风暴。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种诱导个体(如人)中外周T细胞再分布的方法，其包括对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述多特异性Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域(如scFv)与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg、约0.1μg/kg至约30μg/kg、约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法不引起细胞因子风暴。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，所述MSFP是特异性结合CD3和EpCAM的双特异性Fab融合蛋白。
在一些实施方式中，所述MSFP是特异性结合多于两个(如3个或更多)表位。在一些实施方式中，所述MSFP是还包含特异性结合细胞表面蛋白(例如不是EpCAM)的结合域(如scFv)的三特异性Fab融合蛋白。在一些实施方式中，所述MSFP包含多特异性(如双特异性)结合域。
在一些实施方式中，所述MSFP包含特异性结合EpCAM的单结合域。在一些实施方式中，所述单结合域包含单个多肽链。在一些实施方式中，所述结合域是scFv。在一些实施方式中，所述单结合域与所述Fab片段的重链多肽的N端融合。在一些实施方式中，所述单结合域与所述Fab片段的轻链多肽的N端融合。
在一些实施方式中，所述MSFP包含两个特异性结合EpCAM的结合域。在一些实施方式中，所述的两个结合域靶向EpCAM中的相同表位。在一些实施方式中，所述的两个结合域具有相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述的两个结合域具有不同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述的两个结合域靶向EpCAM中的不同表位。在一些实施方式中，所述的两个结合域各自包含单多肽链。在一些实施方式中，所述两个结合域各自是scFv。在一些实施方式中，一个结合域与所述Fab片段的重链多肽的N端融合，且另一个结合域与所述Fab片段的轻链多肽的N端融合。
因此，在一些实施方式中，提供了一种治疗个体(如人)中的癌症的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3的Fab片段，(2)特异性结合EpCAM的第一结合域(如scFv)，(3)特异性结合EpCAM的第二结合域(如scFv)；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合；其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述第一结合域(如scFv)和第二结合域(如scFv)具有相同序列。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种杀伤个体中(如人)中的癌细胞的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3的Fab片段，(2)特异性结合EpCAM的第一结合域(如scFv)，(3)特异性结合EpCAM的第二结合域(如scFv)；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合；其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述第一结合域(如scFv)和第二结合域(如scFv)具有相同序列。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种抑制个体中(如人)中的癌细胞增殖的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3的Fab片段，(2)特异性结合EpCAM的第一结合域(如scFv)，(3)特异性结合EpCAM的第二结合域(如scFv)；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合；其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述第一结合域(如scFv)和第二结合域(如scFv)具有相同序列。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种诱导个体(如人)中的外周T细胞再分布的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3的Fab片段，(2)特异性结合EpCAM的第一结合域(如scFv)，(3)特异性结合EpCAM的第二结合域(如scFv)；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合；其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述第一结合域(如scFv)和第二结合域(如scFv)具有相同序列。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
所述Fab片段可衍生自本领域已知的任何合适的抗CD3抗体。在一些实施方式中，所述Fab片段特异性结合CDε的N端。在一些实施方式中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的氨基酸1-27内的表位。在一些实施方式中，所述Fab片段衍生自SP34。在一些实施方式中，所述Fab片段包含SP34重链可变区的任意一个、两个或三个HVR(或CDR)，如包含SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的HVR。在一些实施方式中，所述Fab片段包含SP34的轻链可变区的任意一个、两个、或三个HVR(或CDR)，如包含SEQ ID NO:4-6的氨基酸序列的HVR。在一些实施方式中，所述Fab片段包含SP34的VH，如包含选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列的VH。在一些实施方式中，所述Fab片段包含SP34的VL，如包含选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列的VL。在一些实施方式中，所述Fab片段包含人免疫球蛋白的重链恒定区1(CH1)，如包含SEQID NO:9的氨基酸序列的CH1。在一些实施方式中，所述Fab片段的CH1和CL通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方式中，所述Fab片段包含第一多肽，所述第一多肽包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
因此，在一些实施方式中，提供了一种治疗个体(如人)中的癌症的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，其中，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中所述结合域与所述Fab片段的N端融合，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，(2)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，(2)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和(3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链多肽和/或轻链多肽，其中所述重链多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述轻链多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体(如人)中的癌症的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3的Fab片段，其中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ IDNO:6氨基酸序列的HVR-L3；(2)特异性结合EpCAM的第一结合域(如scFv)；和(3)特异性结合EpCAM的第二结合域(如scFv)；其中，第一结合域(如scFv)与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二结合域(如scFv)与所述Fab片段的VL的N端融合，其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述第一结合域(如scFv)和第二结合域(如scFv)具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链多肽和/或轻链多肽，所述重链多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述轻链多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，所述特异性结合EpCAM的结合域(在本文中也称为EpCAM结合域)是一种抗EpCAM抗体的抗原结合片段。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域是抗EpCAM抗体的单链抗原结合片段。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域是scFv。在一些实施方式中，所述scFv包含N-VH-VL-C融合多肽。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域衍生自本发明的EpCAM抗体，其包含重链可变区的任意一个、两个或三个HVR，所述HVR包含SEQ ID NO:13-15的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域包含轻链可变区的任意一个、两个或三个HVR，其中所述HVR包含SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域是包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的scFv。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
因此，在一些实施方式中，提供了一种治疗个体(如人)中的癌症的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3(如CD3ε的N端1-27位氨基酸)的Fab片段；(2)特异性结合EpCAM的第一scFv；和(3)特异性结合EpCAM的第二scFv；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合，其中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述第一scFv和所述第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述方法具有一个或更多以下生物活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞增殖；和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体(如人)中的癌症的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3的Fab片段，其中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6氨基酸序列的HVR-L3；(2)特异性结合EpCAM的第一scFv；和(3)特异性结合EpCAM的第二scFv；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合，其中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链多肽和/或轻链多肽，所述重链多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述轻链多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一scFv和所述第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAMscFv包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述方法具有一个或更多以下生物活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞增殖；和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
所述EpCAM结合域可通过接头与所述Fab片段的重链多肽的N端和/或轻链多肽的N端融合，如柔性肽接头，如包含甘氨酸和丝氨酸的肽接头。在一些实施方式中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白包含第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
因此，在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的癌症的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一个或更多以下生物活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞增殖；和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
本发明提供的方法可以辅助设置来实施。在一些实施方式中，所述方法是一个新辅助设置，即，所述方法可在主要/确定性的治疗之前进行实施。在一些实施方式中，所述方法用于治疗先前已被治疗的个体。任何本发明所提供的治疗方法可用于治疗先前未被治疗的个体。在一些实施方式中，所述方法被用作第一线治疗。在一些实施方式中，所述方法被用作第二线治疗。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
本发明提供的方法可用于癌症治疗的多个方面。在一些实施方式中，提供了一种抑制个体中细胞增殖(例如肿瘤生长)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，至少约10％(包含例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任意一个)的细胞增殖被抑制。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种抑制个体中肿瘤转移的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，至少约10％(包含例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任意一个)的转移被抑制。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，且其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种减少(如根除)个体中已存在的肿瘤转移(如转移至淋巴结)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，至少约10％(包含例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％,或100％中的任意一个)的转移被减少。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种减少个体中已存在的肿瘤转移(如转移至淋巴结)的发病率或负担的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种减小个体中肿瘤体积的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述肿瘤体积减小至少约10％(包含例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任意一个)。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ IDNO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种延长个体中癌症的疾病进展时间的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法使疾病进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任意一个。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种延长患癌个体生存期的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法使个体生存期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任意一个。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种缓解患癌个体一个或更多症状的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。、在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
本发明所述的方法适合治疗各种癌症，包含实体瘤和液体瘤。所述方法适用于所有阶段的癌症，包含早期癌症、非转移性癌症、原发性癌、晚期癌症，局部晚期癌症、转移性癌症、或缓解期癌症。所述的方法可在第一疗法、第二疗法、第三疗法、或与其它本领域已知的癌症治疗方案联合治疗，例如化疗、手术、辐射、基因疗法、免疫疗法、骨髓移植、干细胞移植、靶向治疗、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等，作为辅助设置或新辅助设置。在一些实施方式中，所述癌症在现有疗法下难以治疗。
可被本发明所述方法治疗的癌症种类包括，但不限于，肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌症(例如、AIDS相关淋巴瘤)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤(例如小脑的和大脑的)、基底细胞癌、胆管癌(例如、肝外的)、膀胱癌、骨癌、(骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑肿瘤(如胶质瘤、脑干胶质瘤、小脑或大脑星形细胞瘤(如毛细胞型星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性(恶性)星形细胞瘤)、恶性胶质瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞、脑膜瘤、颅咽管瘤、血管母细胞瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、和成胶质细胞瘤)、乳腺癌、支气管腺癌/类癌、类癌瘤(例如、胃肠道类癌肿瘤)、未知原发性癌、中枢神经系统淋巴瘤、子宫颈癌癌、结肠癌、结肠直肠癌、慢性骨髓增生性疾病、子宫内膜癌(例如、子宫癌)、室管膜瘤、食道癌、尤文氏家族肿瘤、眼癌(例如、眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃部的(胃)癌、胃肠类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤、(例如、颅外、性腺外、卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、肝细胞(肝)癌(例如、肝癌(hepatic carcinoma)和肝细胞瘤(heptoma))、下咽癌、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、喉癌、喉癌、白血病、唇和口腔癌、口腔癌、肝癌、肺癌(例如、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞状细胞癌)；淋巴肿瘤(例如、淋巴瘤)、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口癌、多发性内分泌肿瘤综合征、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓及外骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、卵巢癌(例如、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能的肿瘤)、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、腹膜的癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、胸膜胚母细胞瘤、淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(小神经胶质细胞瘤)、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管癌(移行细胞癌)、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌(例如、非黑素瘤(例如、鳞状细胞癌)、黑素瘤、默克尔细胞癌)、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、阴道癌、外阴癌、维尔姆斯瘤、和移植后淋巴增生症(PTLD)、与斑痣病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的)、和梅格斯综合征。
在一些实施方式中，所述方法适用于治疗在癌细胞表面上过表达EpCAM的癌症，如EpCAM阳性实体癌。在一些实施方式中，个体中所述癌细胞表达的EpCAM相较于正常细胞为2、5、10、20、50、100、200、500、1000或更多倍中的任意一个。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性实体癌是癌瘤或腺癌。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性实体癌选自下组：小肠癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胆管癌、和头颈癌。
因此，在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的EpCAM阳性实体癌(例如癌瘤或腺癌)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性实体癌选自下组：小肠癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胆管癌、和头颈癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的EpCAM阳性实体癌(如癌瘤或腺癌)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3的Fab片段，(2)特异性结合EpCAM的第一结合域(如scFv)，(3)特异性结合EpCAM的第二结合域(如scFv)；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合；其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述第一结合域(如scFv)和第二结合域(如scFv)具有相同序列。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性实体癌选自下组：小肠癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胆管癌、和头颈癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的EpCAM阳性实体癌(例如癌瘤或腺癌)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，其中，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中所述结合域与所述Fab片段的N端融合，所述Fab片段包含重链可变区和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，(2)包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和(3)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，(2)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和(3)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3；其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链多肽和/或轻链多肽，其中所述重链多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述轻链多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性实体癌选自下组：小肠癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胆管癌、和头颈癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的EpCAM阳性实体癌(如癌瘤或腺癌)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3(如CD3ε的N端1-27位氨基酸)的Fab片段；(2)特异性结合EpCAM的第一scFv；和(3)特异性结合EpCAM的第二scFv；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合，其中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述第一scFv和所述第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述方法具有一个或更多以下生物活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞增殖；和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性实体癌选自下组：小肠癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胆管癌、和头颈癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的EpCAM阳性实体癌(如癌瘤或腺癌)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：(1)特异性结合CD3的Fab片段，其中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3；(2)特异性结合EpCAM的第一scFv；和(3)特异性结合EpCAM的第二scFv；其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合，其中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3；其中，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链多肽和/或轻链多肽，所述重链多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述轻链多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述第一scFv和所述第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述方法具有一个或更多以下生物活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞增殖；和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性实体癌选自下组：小肠癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胆管癌、和头颈癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的EpCAM阳性实体癌(如癌瘤或腺癌)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一个或更多以下生物活性：(1)杀伤癌细胞；(2)抑制癌细胞增殖；和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述EpCAM阳性实体癌选自下组：小肠癌、结肠直肠癌、肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、肾癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胆管癌、和头颈癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的小肠癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的结肠直肠癌(如结肠直肠腺癌)的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述结肠直肠癌是腺癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质肿瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤、或鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的肺癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌的例子包括，但不限于，大细胞癌、腺癌、神经内分泌肺肿瘤、和鳞状细胞癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的宫颈癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的肝癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述肝癌是肝细胞癌、肝细胞癌的纤维板层变异体、或混合的肝细胞胆管癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的胃癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述胃癌是腺癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、类癌肿瘤、鳞状细胞癌、小细胞癌、或平滑肌肉瘤。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的胰腺癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述胰腺癌是浆液性囊性肿瘤、粘液性囊性肿瘤、导管内乳头状粘液瘤、胰腺癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、印戒细胞癌(signet ring cellcarcinoma)、未分化癌、具有巨细胞的未分化癌、实体假乳头状瘤、壶腹癌、或胰腺神经内分泌肿瘤。在一些实施方式中，所述胰腺癌是胰腺腺癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的皮肤癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述皮肤癌为黑素瘤。在一些实施方式中，所述黑素瘤是浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、结节性黑素瘤、粘膜黑素瘤、息肉样黑素瘤、促结缔组织增生性黑素瘤、无黑色素的黑素瘤、软组织黑素瘤、或肢端雀斑样痣黑素瘤。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的肾癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述癌症为肾细胞癌。在一些实施方式中，所述肾细胞癌是腺癌。在一些实施方式中，所述肾细胞癌是透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌(又称嗜染肾细胞癌)、嫌色肾细胞癌、集合管肾细胞癌、颗粒肾细胞癌、混合颗粒肾细胞癌、肾血管平滑肌脂肪瘤、或梭形肾细胞癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的膀胱癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述膀胱癌为低级膀胱癌。在一些实施方式中，所述膀胱癌为高级膀胱癌。在一些实施方式中，所述膀胱癌是肌肉浸润性的(例如，T2、T3或T4)。在一些实施方式中，所述膀胱癌是非浸润性的(例如，Ta、T1Cis、伴有Ta和/或T1的Cis)。在一些实施方式中，所述膀胱癌是移行细胞癌或尿道上皮癌(如转移性尿道上皮癌)、包括但不限于，乳头状瘤和扁平癌。在一些实施方式中，所述胱癌是鳞状细胞癌、非鳞状细胞癌、腺癌、或小细胞癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的甲状腺癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述甲状腺癌是乳头状癌、滤泡癌、赫氏(Hurthle)细胞癌、甲状腺髓样癌、未分化癌、甲状腺淋巴瘤、甲状腺肉瘤、或甲状旁腺癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的前列腺癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述前列腺癌是腺癌。在一些实施方式中，所述前列腺癌是肉瘤、神经内分泌肿瘤、小细胞癌、导管癌或淋巴瘤。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的卵巢癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法不引起细胞因子风暴。在一些实施方式中，所述卵巢癌是卵巢上皮癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的子宫内膜癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述子宫内膜癌是腺癌、癌肉瘤、鳞状细胞癌、未分化癌、小细胞癌、或移行细胞癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的乳腺癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述乳腺癌是早期乳腺癌、非转移性乳腺癌、晚期乳腺癌、IV期乳腺癌、局部晚期乳腺癌、转移性乳腺癌、缓解期乳腺癌、在辅助设置中的乳腺癌、或在新辅助设置中的乳腺癌。在一些实施方式中，所述乳腺癌是纤维腺癌、或导管内乳头状瘤。在一些实施方式中，所述乳腺癌是HER2阳性或HER2阴性。在一些实施方式中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的胆管癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含一个重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或一个轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述胆管癌是肝内胆管癌、肺门周围胆管癌、远端胆管癌。在一些实施方式中，所述胆管癌症是胆管癌(cholangiocarcinoma)、肉瘤、淋巴瘤、或小细胞癌。
在一些实施方式中，提供了一种治疗个体中的头颈癌的方法，其包含对个体施用一种有效量的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域(如scFv)，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg至约250μg/kg(如约0.01μg/kg至约5μg/kg，约0.1μg/kg至约30μg/kg，约2.5μg/kg至约100μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述方法具有一种或多种以下生物活性：(1)杀伤癌细胞，(2)抑制癌细胞增殖，和(3)诱导外周T细胞再分布。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合，其中，第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。在一些实施方式中，所述第一scFv和第二scFv具有相同序列。在一些实施方式中，所述Fab片段结合CD3ε的N端(如N端1-27位氨基酸)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述第一scFv和/或第二scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)；其中所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用糖皮质激素(如地塞米松)。在一些实施方式中，所述头颈癌是头颈部鳞状细胞癌。在一些实施例中，所述头颈癌是下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隐匿原发性转移性鳞状颈癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻窦和鼻腔癌、或唾液腺癌。
施用所述多特异性Fab融合蛋白(MSFP)的例示性途径包括，但不限于，口服、静脉内、腔内、肿瘤内、动脉内、肌内、皮下、肠胃外、经粘膜、经皮、眼、局部、腹膜内、颅内、胸膜内、和经表皮路线、或者被输送到淋巴腺、体间隙、已知含有癌细胞的器官或组织中。在一些实施方式中，所述MSFP通过静脉内施用。在一些实施方式中，所述MSFP通过输注施用。在一些实施方式中，所述MSFP通过皮下施用。在一些实施方式中，所述MSFP通过注射施用。
在一些实施方式中，所述MSFP通过静脉内输注施用。在一些实施方式中，所述MSFP输注给个体的时间不多于约24小时、20小时、15小时、10小时、8小时、6小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少。在一些实施方式中，所述MSFP输注给个体的时间为约30分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约18小时、约18小时至约24小时、约30分钟至约2小时、约2小时至约5小时、约5小时至约10小时、约10小时至约20小时、约30分钟至约10小时、或约30分钟至约20小时中的任意一个。所述MSFP可以任何合适速度给个体输注。在一些实施方式中，所述MSFP可以多于0.01μg/kg/hr、0.02μg/kg/hr、0.05μg/kg/hr、0.1μg/kg/hr、0.2μg/kg/hr、0.5μg/kg/hr、0.6μg/kg/hr、0.7μg/kg/hr、0.8μg/kg/hr、0.9μg/kg/hr、1μg/kg/hr、1.5μg/kg/hr、2μg/kg/hr、3μg/kg/hr、4μg/kg/hr、5μg/kg/hr、10μg/kg/hr、15μg/kg/hr、20μg/kg/hr、25μg/kg/hr、50μg/kg/hr、75μg/kg/hr、100μg/kg/hr或更多中的任意一个的速度输注。
施用给个体的MSFP的施用方案将随具体的MSFP组合物、施用方法、和被治疗的具体癌症类型和阶段而不同。在一些实施方式中，所述MSFP的有效量低于引起毒理效应的水平(例如，超过临床上可接受的毒性水平的效果)，或当所述组合物施用给个体后，潜在副作用可被控制或忍受的水平。
在一些实施方式中，所述MSFP的有效量低于导致中枢神经系统副作用的水平，例如，在抗体治疗中观察到的副作用是输注相关的副作用，如细胞因子释放综合征(“CRS”)，一种被称为“细胞因子风暴”的严重状态。当一个“细胞因子风暴”被诱导时，健康个体的免疫系统被激活并释放大量的促炎细胞因子，如IFN-γ、CCL2、IL-10、IL-6等。它是一种通常由细胞因子和免疫细胞之间正反馈环组成的潜在致命免疫反应，伴有多种细胞因子水平的高度升高。与CRS相关的其它不良副作用是疲劳、呕吐、心动过速、高血压、背部疼痛、还有中枢神经系统反应(CNS反应)，如癫痫、脑病变、脑水肿、无菌性脑膜炎以及头痛。在一些实施方式中，所述MSFP的施用剂量不诱导细胞因子释放综合征，如细胞因子风暴。在一些实施方式中，所述MSFP的施用剂量不诱导选自下组的一种或多种细胞因子的显著释放：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF和INF-γ。在一些实施方式中，细胞因子的显著释放是细胞因子的持续释放，其持续进程的时间为至少约1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时或更多的任意一种。在一些实施方式中，细胞因子的显著释放是细胞因子的血清或血液浓度水平为至少约1、5、10、20、50、100、200、500、1000pg/mL或更多中的任意一个。不受任何理论的束缚，本文所述MSFP需要结合靶癌细胞上的EpCAM以招募和激活T细胞。这种要求可大大地减少不希望的细胞因子风暴以及在不存在所期望的靶癌细胞的情况下减少不希望的T细胞激活。
在一些实施方式中，所述MSFP以不多于约0.01μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、或1mg/kg中的任意一个的剂量施用。在一些实施方式中，所述MSFP的施用剂量在以下任意一个范围内，所述范围的上限为0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg,30μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、或1mg/kg中的任意一个，所述范围的独立选择的下限为0.01μg/kg、0.05μg/kg、0.1μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg,30μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、或900μg/kg中的任意一个，并且所述下限小于所述上限。在一些实施方式中，所述MSFP以约0.01μg/kg至约0.05μg/kg、约0.05μg/kg至约0.1μg/kg、约0.1μg/kg至约0.5μg/kg、约0.5μg/kg至约1μg/kg、约0.01μg/kg至约0.1μg/kg、约0.1μg/kg至约1μg/kg、约1μg/kg至约5μg/kg、约5μg/kg至约10μg/kg、约10μg/kg至约15μg/kg、约15μg/kg至约20μg/kg、约20μg/kg至约25μg/kg、约25μg/kg至约30μg/kg、约5μg/kg至约15μg/kg、约10μg/kg至约30μg/kg、约30μg/kg至约50μg/kg、约50μg/kg至约100μg/kg、约0.01μg/kg至约1μg/kg、约0.01μg/kg至约5μg/kg、约0.01μg/kg至约30μg/kg、约0.01μg/kg至约250μg/kg、约0.1μg/kg至约10μg/kg、约0.1μg/kg至约30μg/kg、约0.1μg/kg至约250μg/kg、约1μg/kg至约10μg/kg、约1μg/kg至约20μg/kg、约1μg/kg至约30μg/kg、约1μg/kg至约250μg/kg、约100μg/kg至约250μg/kg、约5μg/kg至约250μg/kg、约250μg/kg至约500μg/kg、约500μg/kg至约1000μg/kg、或约0.01μg/kg至约1000μg/kg中的任意一个的剂量施用。本发明所述剂量可指对食蟹猴适合的剂量及其人等效剂量或对个体的特定物种的等效剂量。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴为约0.1μg/kg至约100μg/kg(如约0.3μg/kg至约5μg/kg，或约5μg/kg至约20μg/kg)的剂量施用。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴为不高于约30μg/kg(如不多于约20、15、或10μg/kg)的剂量施用。
在一些实施方式中，所述MSFP以约0.01μg/kg至约10μg/kg，如约0.3、0.5、0.6、1、1.2、2、2.4、3.6、或4μg/kg中的任意一个的剂量施用。
所述MSFP的有效量可以单次剂量或多次剂量施用。对于包含以多次剂量施用所述MSFP的治疗方法，例示性的施用频率包括，但不限于，每天，每天不间断，每周，每周不间断，三周中的两周每周，四周中的三周每周，每三周一次，每两周一次，每月一次，每6个月一次或每年一次等。在一些实施方式中，所述MSFP的施用频率为约每2周一次、每3周一次、每4周一次、每6周一次、或每8周一次。在一些实施方式中，所述MSFP的施用频率为至少约每周1次、2次、3次、4次、5次、6次、或7次(即每天)。在一些实施方式中，每次施用的间隔小于约3年、2年、12个月、11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天、或1天中的任意一个。在一些实施方式中，每次施用的间隔大于约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、2年、或3年中的任意一个。在一些实施方式中，在施用期中没有间断。
在一些实施方式中，所述MSFP以第一剂量施用于个体第一时间段，并且连续地所述MSFP以第二剂量施用于个体第二时间段，其中所述第二剂量超过所述第一剂量。所述第一时间段和所述第二时间段可以为任意合适的长度，包括例如约1、2、3、4、5、6周或更多中的任意一个。在一些实施方式中，所述第二时间段超过第一时间段。在一些实施方式中，所述第一时间段为至少约7天。在一些实施方式中，所述第二时间段为至少约2周、3周、4周、5周、6周或更多中的任意一个。所述第一剂量和所述第二剂量可为上文描述中任意合适的剂量。在一些实施方式中，所述第一剂量不超过约2、1.5、1、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1μg/kg或更少中的任意一个。在一些实施方式中，所述第二剂量为约0.1μg/kg至约10μg/kg，如约0.3μg/kg至约5μg/kg。在一些实施方式中，所述第二剂量为约0.3、0.6、1.2、2.4、或3.6μg/kg中的任意一个。
在一些实施方式中，所述MSFP以低频率施用，例如，频率不多于每月1次、每2月1次、每3月1次、每4月1次、每5月1次、每6月1次、每7月1次、每8月1次、每9月1次、每10月1次、每11月1次、每年1次,每18月1次、每2年1次、每3年1次、或更少中的任意一种。在一些实施方式中，所述MSFP以单次施用施用。在一些实施方式中，所述MSFP每周施用两次。
所述MSFP的施用可被延长至一段时间，例如从1天至约一周、从约一个星期至约一个月、从约一个月至约一年、从约一年至约数年。在一些实施方式中，所述MSFP的施用期为至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、5周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年、或更多中的任意一个。
在一些实施方式中，所述方法还包括对个体施用一种或多种糖皮质激素。糖皮质激素(GC)是一类与糖皮质激素受体(GR)结合的类固醇激素，其存在于几乎所有脊椎动物细胞中，包括人类。无论炎症的原因如何，这类化合物都是有效的抗炎剂。在一些实施方式中，所述糖皮质激素抑制选自下组的一种或多种细胞因子的释放：IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8和IFN-γ。合适的糖皮质激素包括但不限于可的松，氢化可的松，皮质醇，氯普罗醇，泼尼松，泼尼松龙，甲基泼尼松龙，地夫可特，氟氢可的松，氟羟泼尼松龙，地塞米松和倍他米松。在一些实施方式中，所述糖皮质激素选自下组：可的松，氢化可的松，皮质醇，氯普罗醇，泼尼松，泼尼松龙，甲基泼尼松龙，地夫可特，氟氢可的松，氟羟泼尼松龙，地塞米松，倍他米松及其药学上可接受的酯、盐或复合物。在一些实施方式中，所述糖皮质激素是地塞米松。在一些实施方式中，所述糖皮质激素是药学上可接受的地塞米松的酯、盐或复合物。
所述糖皮质激素可以与所述MSFP同时或在施用所述MSFP之前施用于个体。所述糖皮质激素的施用可以在所述MSFP施用前不超过约3小时，2小时，1小时，30分钟或更短时间的任意一个。在一些实施方式中，所述糖皮质激素在所述MSFP的每次剂量的同时或之前施用。在一些实施方式中，所述糖皮质激素在所述MSFP的第一剂量的同时或之前施用。在一些实施方式中，其中所述MSFP以第一剂量施用第一时间段，并且连续地以第二剂量施用所述MSFP第二时间段，所述糖皮质激素在所述第一时间段第一次施用所述MSFP之前(例如约1小时前)施用，并且所述糖皮质激素在第二时间段第一次施用所述MSFP之前(例如约1小时之前)施用。在一些实施方式中，当个体具有升高的肝酶水平(如ALT，TBil和/或ALP)和/或升高的细胞因子水平(如IL-6)时，所述糖皮质激素在施用所述MSFP之前施用。所述糖皮质激素可以任何合适的剂量施用，包括例如至少约0.1、0.5、1、2、3、4、5mg/kg或更多中的任意一种。在一些实施方式中，所述糖皮质激素以至少约1、2、5、10、15、20、25mg或更多中的任意一种的剂量施用。
在一些实施方式中，所述糖皮质激素是地塞米松。在一些实施方式中，所述方法包含对个体在施用所述MSFP的第一剂量之前施用地塞米松。在一些实施方式中，所述糖皮质激素以约0.1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用。
多特异性Fab融合蛋白
本发明所述的方法中使用的多特异性Fab融合蛋白(MSFP)包含抗CD3Fab片段、与所述Fab片段的VH的N端融合的第一EpCAM结合域和/或与所述Fab片段的VL的N端融合的第二EpCAM结合域。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域是一种抗EpCAM scFv。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域通过接头与抗CD3Fab片段的VH或VL连接。一种用于本发明的方法的例示性双特异性Fab融合蛋白示于图1。
Fab片段
在本发明的MSFP中Fab片段能特异性地结合CD3，如人CD3。“CD3”在本领域已知为六条链的多蛋白复合物(参见Abbas和Lichtman,2003；Janeway等,p172和178,1999)。在哺乳动物中，该复合物包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链为包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链的跨膜区是带负电的，这是允许这些链与带正电的T细胞受体链结合的特征。CD3γ链、CD3δ链和CD3ε链的胞内尾各自均包含一个称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的保守基序，而每条CD3ζ链均具有三个。不希望受到理论的限制，认为ITAM对TCR复合物的信号转导能力是很重要的。如本发明所用的CD3可来自不同的动物物种，包括人、灵长类、小鼠、大鼠或其他的哺乳动物。
在一些实施方式中，所述MSFP的Fab片段特异性地结合于个体的CD3链，如CD3γ链、CD3δ链或CD3ε链。在一些实施方式中，所述Fab片段特异性地结合于由两个或更多的个体的CD3链形成的复合物(例如，超过一个CD3ε链的复合物，CD3γ链和CD3ε链的复合物，CD3δ链与CD3ε链的复合物)。在一些实施方式中，所述Fab片段特异性地结合于CD3ε链。在一些实施方式中，所述Fab片段特异性地结合于CD3ε链的N端。在一些实施方式中，所述Fab片段特异性地结合于CD3ε链1-27位氨基酸。
可如本文所述或通过本领域已知的多种方法来产生本公开的Fab片段(参见例如美国专利第6,291,161号；第6,291,158号)。Fab的来源包括来自不同物种的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括人、骆驼科动物抗体(来自骆驼、单峰骆驼或美洲驼；Hamers-Casterman等(1993)Nature,363:446和Nguyen等(1998)J.Mol.Biol.,275:413)、鲨鱼(Roux等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:11804)、鱼(Nguyen等(2002)Immunogenetics,54:39)、啮齿动物、鸟类、或羊。在一些实施方式中，所述Fab片段源自人或人源化抗体。
在一些实施方式中，所述Fab片段能特异性地结合人或非人灵长类(例如食蟹猴)CD3，例示性的与猴CD3具有交叉反应的抗人CD3抗体包括但不限于SP34小鼠单克隆抗体(参见例如Pressano,S.The EMBO J.4:337-344,1985；Alarcon,B.EMBO J.10:903-912,1991；Salmeron A.等,J.Immunol.147:3047-52,1991；Yoshino N.等,Exp.Anim49:97-110,2000；Conrad M L.等,Cytometry 71A:925-33,2007；和Yang等,J.Immunol.137:1097-1100:1986)。具有抗CD3Fab片段、具有与猴CD3交叉反应性的MSFP便于在非人灵长类动物中的毒性研究，这可为人临床试验候选物提供更相关的安全性评估，而不需要在黑猩猩中或使用替代分子进行毒性研究。
在一些实施方式中，所述Fab片段来自与非人灵长类不具有交叉反应性的抗CD3抗体，例示性的抗CD3抗体包括Cris-7单克隆抗体(Reinherz,E.L.等(编),Leukocyte typingII.,Springer Verlag,New York,(1986))、BC3单克隆抗体(Anasetti等(1990)J.Exp.Med.172:1691)、OKT3(Ortho multicenter Transplant Study Group(1985)N.Engl.J.Med.313:337)及其衍生物如OKT3ala-ala(Herold等(2003)J.Clin.Invest.11:409)、维西珠单抗(Visilizumab)(Carpenter等(2002)Blood 99:2712)、和145-2C11单克隆抗体(Hirsch等(1988)J.Immunol.140:3766)。本文涵盖的其它CD3结合分子包括UCHT-1(Beverley,P C和Callard,R.E.(1981)Eur.J.Immunol.11:329–334)和WO2004/106380；WO2010/037838；WO2008/119567；WO2007/042261；WO2010/0150918中描述的CD3结合分子。
在一些实施方式中，所述Fab片段包含免疫球蛋白重链的一个恒定区和一个可变区，以及免疫球蛋白轻链的一个恒定区和可变区。在一些实施方式中，所述重链恒定区和可变区与所述轻链恒定区和可变区杂二聚化，并通过重链与轻链恒定区之间的二硫键共价连接。在一些实施方式中，所述Fab片段具有NH2-VL-CL-S-S-CH1-VH-NH2的基本结构。在一些实施方式中，所述Fab片段的CH1与CL通过一个或多个二硫键连接。在一些实施方式中，所述Fab片段的重链第一个恒定区(CH1)与轻链恒定区(CL)之间二硫键数目为至少1个，例如2、3、4或更多个。在一些实施方式中，改造所述Fab片段(如在CH1或CL区)中的半胱氨酸残基以引入二硫键。
在一些实施方式中，所述MSFP的Fab片段不包含二硫键，例如，重链和轻链可以一种方式改造使得稳定地相互作用而不需要二硫键。在一些实施方式中，所述重链和轻链可被改造以去除半胱氨酸残基，其中重链和轻链仍然稳定的相互作用并具有Fab的功能。在一些实施方式中，进行突变使重链与轻链之间稳定地相互作用，例如，“节入穴(knobs intoholes)”的改造策略可用于Fab的重链和轻链之间的二聚化(参见例如1996ProteinEngineering,9:617-621)。还涵盖用于本发明的是为特定目的而设计的变体Fab片段，例如，CH1和/或CL恒定区的氨基酸变化，和二硫键的去除或纯化标签的添加等。
在一些实施方式中，所述Fab片段内可变区和恒定区的构型可不同于在天然的Fab所发现的。在一些实施方式中，所述可变区和恒定区的方向可为一条链中的VH-CL，和另一条链中的VL-CH1(参见例如，Schaefer等(2011),PNAS,108:11187-92)。
在一些实施方式中，所述MSFP的Fab片段源自单克隆抗体。合适的单克隆抗体可为任何类型，包括IgA、IgM、IgD、IgG、IgE及其亚型(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在一些实施方式中，所述轻链域可源自κ链或λ链。在一些实施方式中，所述Fab片段是重组设计的。
在一些实施方式中，所述Fab片段包含人免疫球蛋白CH1。在一些实施方式中，所述人免疫球蛋白CH1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含人λ轻链恒定区。在一个实施方式中，所述人λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9(人CH1)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
SEQ ID NO:10(人λCL)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE
所述MSFP的Fab片段经由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间形成的抗原结合位点特异地结合于CD3。所述抗原结合位点包含免疫球蛋白重链的至少一个(如1、2或3个)HVR和/或免疫球蛋白轻链的至少一个(例如1、2或3个)HVR。在一些实施方式中，所述MSFP包含特异性结合CD3的全长抗体的VH和VL序列的1、2、3、4、5或所有6个HVR。
在一些实施方式中，所述Fab片段源自SP34。在一些实施方式中，所述Fab片段是美国专利No.8,846,042中描述的CD3Fab片段。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含来自SEQ ID NO:7的1、2或3个HVR(或CDR)；所述轻链可变区(VL)包含来自SEQ ID NO:8的1、2或3个HVR(或CDR)。在一些实施方式中，Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含来自SEQ ID NO:7的3个HVR；所述轻链可变区(VL)包含来自SEQ ID NO:8的3个HVR。在一些实施方式中，Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含选自SED ID No:1-3的1、2或3个HVR；所述轻链可变区(VL)包含选自SED ID No:4-6的1、2或3个HVR。在一些实施方式中，Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:7和39-43的序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含与选自SEQID NO:8和44-47的序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH或VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的所述Fab片段保留结合CD3的能力。在一些实施方式中，一个或两个氨基酸在任意一个或多个HVR中被取代、插入和/或缺失。在一些实施方式中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链多肽和/或轻链多肽，所述重链多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；所述轻链多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1(CD3 HVR-H1)
TYAMN
SEQ ID NO:2(CD3 HVR-H2)
RIRSKYNNYATYYADSVKD
SEQ ID NO:3(CD3 HVR-H3)
HGNFGNSYVSWFAY
SEQ ID NO:4(CD3 HVR-L1)
RSSTGAVTTSNYAN
SEQ ID NO:5(CD3 HVR-L2)
GTNKRAP
SEQ ID NO:6(CD3 HVR-L3)
ALWYSNLWV
SEQ ID NO:7(CD3 VH)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:8(CD3 VL)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:11(CD3重链)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS
SEQ ID NO:12(CD3轻链)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE
SEQ ID NO:39(CD3 VH)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:40(CD3 VH)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:41(CD3 VH)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:42(CD3 VH)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:43(CD3 VH)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:44(CD3 VL)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:45(CD3 VL)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:46(CD3 VL)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:47(CD3 VL)
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWYQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
在一些实施方式中，抗CD3Fab片段的特异性VH和/或VL可用于筛选互补可变区的文库以鉴定具有所需性质(如对CD3增加的亲和力)的VH/VL。此类方法描述于，例如Portolano等,J.Immunol.(1993)150:880-887；Clarkson等,Nature(1991)352:624-628；和Klimka等,British Journal of Cancer(2000)83:252-260；Beiboer等,J.Mol.Biol.(2000)296:833-849；和Rader等,PNAS(1998)95:8910-8915中。
EpCAM结合域
本发明所述的MSFP包含一个或两个特异性结合EpCAM的结合域。上皮细胞粘附分子(EpCAM，CD326)是一种分子量为40kD、由314个氨基酸构成的跨膜糖蛋白，也被成为17-1A、ESA、AUA1、EGP40等。EpCAM涉及细胞信号传导、迁移、增殖和分化。EpCAM在多种上皮细胞和主要类型的人类恶性肿瘤中特异性表达。例如，EpCAM在结肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌以及卵巢癌中高表达，因而，可被用作多种癌症的诊断标记物。EpCAM也是免疫治疗策略的潜在靶物，包括疫苗、鼠源化或人源化单克隆抗体，和与细菌毒素或化疗药物缀合的抗体，如EpCAM特异性的抗体ING-1、阿德木单抗(Adecatumumab)、依决洛单抗(Edrecolomab)等。
MSFP中的结合域(包括EpCAM结合域)不仅提供了额外的结合特异性和增强的性质(例如增加的血清半衰期，或其他免疫激活级联的激活)，而且提供了空间位阻以显著地降低Fab片段与CD3由于融合至VH和/或VL链的N端所致的结合亲和力。这与其它Fab融合蛋白(如TRIBODIESTM，其将额外的结合域融合于Fab片段的C端)成直接对比(参见例如，Journalof Immunology,2000,165:7050-7057)。与其它已知的融合蛋白(例如，WO2008/024188和WO2009/149185描述的那些)不同，结合域不是意欲二聚化。所述MSFP进一步的区别特征是，当MSFP不结合癌细胞上的细胞表面靶物(如EpCAM)时，结合域降低Fab片段与CD3的结合亲和力。
在一些实施方式中，所述MSFP具有与单独的抗CD3Fab相比延长的体内半衰期。在一些实施方式中，所述MSFP的半衰期为单独的抗CD3Fab片段的半衰期的至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍中的任意一个。
结合域，包括EpCAM，可选自抗原结合域，如scFv或scTCR，受体的胞外域，细胞表面分子/受体的配体，或其受体结合域，和肿瘤结合蛋白。在一些实施方式中，抗原结合域选自scFv、VH、VL、域抗体变体(dAb)、骆驼科抗体(VHH)、纤连蛋白3结构域变体、锚蛋白重复变体和衍生自其它蛋白支架的其它抗原特异性结合域。
在一些实施方式中，所述EpCAM结合域是特异性结合EpCAM的scFv(在本文中也称为抗EpCAM scFv)。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv的VH和VL通过肽接头(如包含甘氨酸和/或丝氨酸的柔性接头)互相连接。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv的VH和VL直接相互连接。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含N-VH-VL-C融合多肽。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含N-VL-VH-C融合多肽。
EpCAM结合域(如scFv)可衍生自任何合适的抗EpCAM抗体。在一些实施方式中，抗EpCAM抗体是人、人源化或嵌合抗体。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域特异性结合人和非人灵长类(如食蟹猴)两者的EpCAM。在一些实施方式中，所述EpCAM结合域能特异性识别人EpCAM，但与非人灵长类没有交叉反应性。例示性的抗EpCAM抗体是本领域中已知的，例如，参见美国专利8,884,602。抗EpCAM结合域可包含免疫球蛋白重链的至少1个(如1、2、或3)HVR和/或免疫球蛋白轻链的至少1个(例如1、2、或3)HVR。在一些实施方式中，抗EpCAM结合域包含特异性结合EpCAM的全长抗体的VH和VL序列的1、2、3、4、5或所有6个HVR。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含来自SEQ ID NO:19的1、2或3个HVR(或CDR)；所述轻链可变区(VL)包含来自SEQ ID NO:20的1、2或3个HVR(或CDR)。在一些实施方式中，所述抗EpCAMscFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含来自SEQ IDNO:19的3个HVR；所述轻链可变区(VL)包含来自SEQ ID NO:20的3个HVR。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含选自SED ID Nos:13-15的1、2或3个HVR；所述轻链可变区(VL)包含选自SED ID Nos:16-18的1、2或3个HVR。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQID NO:14氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:19的序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:20的序列具有至少约是至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM scFv包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13(EpCAM HVR-H1)
NYWMS
SEQ ID NO:14(EpCAMHVR-H2)
NIKQDGSEKFYADSVKG
SEQ ID NO:15(EpCAMHVR-H3)
VGPSWEQDY
SEQ ID NO:16(EpCAM HVR-L1)
TGSSSNIGSYYGVH
SEQ ID NO:17(EpCAM HVR-L2)
SDTNRPS
SEQ ID NO:18(EpCAM HVR-L3)
QSYDKGFGHRV
SEQ ID NO:19(EpCAM VH)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKFYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGPSWEQDYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO:20(EpCAM VL)
GAQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSYYGVHWYQQLPGTAPKLLIYSDTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDKGFGHRVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:21(EpCAM scFv)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKFYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGPSWEQDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSYYGVHWYQQLPGTAPKLLIYSDTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQS YDKGFGHRVFGGGTKLTVL
接头
本发明所述的MSFP可包含位于Fab片段的VH或VL与结合域之间的接头(例如肽接头)。在一些实施方式中，Fab片段的VH与第一结合域之间的接头和Fab片段的VL与第一/第二结合域之间的接头是相同的。在一些实施方式中，Fab片段的VH与第一结合域之间的接头和Fab片段的VL与第一/第二结合域之间的接头是不同的。在一些实施方式中，所述抗EpCAMscFv包含位于scFv的VH和VL之间的接头(如肽接头)，所述接头可与于Fab片段的VH或VL与结合域之间的任何接头相同或不同。
接头可为任何长度的肽接头。在一些实施方式中，所述肽接头是来自长度为1个氨基酸至10个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸、4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或1个氨基酸至20个氨基酸。在一些实施方式中，所述肽接头是长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中的任意一个。在一些实施方式中，所述肽接头是长度为21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸中的任意一个。在一些实施方式中，所述肽接头的N端共价连接于结合域的C端，且肽接头的C端共价连接于Fab片段VH或VL的N端。
在一些实施方式中，接头是柔性接头。例示性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如，(GS)n、(GSGGS)n和(GGGS)n，其中n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此可能够作为组分之间的中性接头。甘氨酸明显比丙氨酸接近更多的phi-psi空间，而且比具有较长侧链的残基受限少得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11 173-142(1992))。例示性柔性接头包括但不限于Gly-Gly,Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:24)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQ ID NO:25)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:26),Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:27)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:28),Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQ ID NO:29)等。在一些实施方式中，抗CD3Fab片段的VH与EpCAM结合域(例如scFv)之间的接头是Gly-Gly。在一些实施方式中，抗CD3Fab片段的VL与EpCAM结合域(例如scFv)之间的接头是Gly-Gly。本领域普通技术人员会认识到MSFP的设计可包括全部或部分柔性的接头，使得所述接头可包含柔性接头部分以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分以提供所需的MSFP结构。
在一些实施方式中，所述Fab和结合域之间的接头是稳定接头(不被蛋白酶特别是MMP切割)。
一些实施方式中，所述接头为可切割的接头。在一些实施方式中，所述Fab的VH或VL与结合域之间的接头包含蛋白酶底物切割序列，例如MMP底物切割序列。底物中PLGLAG(SEQ ID NO:30)的已知肽序列可被大多数MMP切割。可被MMP切割的底物序列已被广泛研究。例如，PLGLAG(SEQ ID NO:30)的序列可被大多数MMP切割。在一些实施方式中，蛋白酶切割位点被MMP-2、MMP-9或其组合识别。
在一些实施方式中，所述MSFP包含第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述MSFP包含第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述MSFP包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。本发明还提供了MSFP及其组合物(如药物组合物)，所述组合物包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKFYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGPSWEQDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSYYGVHWYQQLPGTAPKLLIYSDTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQS YDKGFGHRVFGGGTKLTVLGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYN NYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCPPCS
SEQ ID NO:23
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKFYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGPSWEQDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSYYGVHWYQQLPGTAPKLLIYSDTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQS YDKGFGHRVFGGGTKLTVLGGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKR APGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECPPCS
III.EpCAM抗体
本申请还提供了新型的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，包括多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，其包含衍生自所述抗EpCAM抗体的抗原结合片段。与本领域已知的抗EpCAM抗体和片段相比，本发明所述的抗EpCAM抗体及其抗原结合片段具有增强的稳定性和被表达的能力。此外，本发明中所述抗EpCAM抗体及其抗原结合片段对来自人和非人灵长类(如食蟹猴)两者的EpCAM都具有交叉反应，这有益于从猴中的毒性和功效研究结果外推至人临床研究，用于评价EpCAM抗体或其衍生物(例如MSFP)。
本发明的抗体以≤1μM，例如≤100nM，优选≤10nM，更优选≤1nM的平衡结合常数(Kd)结合EpCAM表位。例如，本发明提供的抗EpCAM抗体显示大约≤1nM-约1pM范围中的Kd。
本发明的抗EpCAM抗体用于完全或部分调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰广泛分布的EpCAM的功能活性。当所述抗EpCAM抗体存在情况下EpCAM功能活性的水平与不存在与本发明所述的抗EpCAM抗体结合情况下的EpCAM功能活性的水平相比降低至少95％，例如降低了96％、97％、98％、99％或100％时，认为EpCAM抗体完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰EpCAM功能活性。当所述抗EpCAM抗体存在情况下EpCAM功能活性的水平与不存在与本发明所述的抗EpCAM抗体结合情况下的EpCAM功能活性的水平相比降低至少50％，例如降低了55％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为抗EpCAM抗体显著地阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰EpCAM功能活性。当所述抗EpCAM抗体存在情况下EpCAM功能活性的水平与不存在与本发明所述的抗EpCAM抗体结合情况下的EpCAM功能活性的水平相比降低小于95％，例如降低了10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，认为抗EpCAM抗体部分地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其他方式干扰EpCAM功能活性。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体基团特异性结合存在细胞表面的EpCAM。在一些实施方式中，所述细胞的表面呈现异常高水平的EpCAM。在一些实施方式中，所述细胞是癌细胞。在一些实施方式中，所述癌细胞是在实体瘤中的。在一些实施方式中，所述癌细胞是转移性癌细胞。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体部分包含特定序列或这些序列的某些变体。在一些实施方式中，在所述变体序列中的氨基酸取代基本上不降低所述抗EpCAM抗体部分结合EpCAM的能力。例如，可进行基本上不降低EpCAM结合亲和力的改变。还涵盖基本上改善EpCAM的结合亲和力或影响其它性质(如特异性、免疫原性、ADCC或CDC、和/或与EpCAM相关变体的交叉反应性)的改变。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段(如scFv)包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含来自SEQ ID NO:19的1、2或3个HVR(CDR)；所述轻链可变区(VL)包含来自SEQ ID NO:20的1、2或3个HVR(CDR)。在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段(如scFv)包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含来自SEQ ID NO:19的3个HVR(CDR)；所述轻链可变区(VL)包含来自SEQ ID NO:20的3个HVR(CDR)。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段(如scFv)包含重链可变区(VH)和或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含含有SED ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含含有SED ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含：(1)SEQ ID NO:13的具有一个或两个氨基酸取代的HVR-H1，(2)SEQ ID NO:14的具有一个或两个氨基酸取代的HVR-H2，和/或(3)SEQ IDNO:15的具有一个或两个氨基酸取代的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：(1)SEQ ID NO:16的具有一个或两个氨基酸取代的HVR-L1，(2)SEQ ID NO:17的具有一个或两个氨基酸取代的HVR-L2，和/或(3)SEQ ID NO:18的具有一个或两个氨基酸取代的HVR-L3。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段(如scFv)包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段(如scFv)包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与SEQ ID NO:19的序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区(VL)包含与SEQ ID NO:20的序列具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的VH或VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含该序列的所述Fab片段保留结合EpCAM的能力。在一些实施方式中，一个或两个氨基酸在任意一个或多个HVR中被取代、插入和/或缺失。在一些实施方式中，取代、插入或缺失发生在HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段(如scFv)包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体是一种全长抗体。在一些实施方式中，所述全长抗EpCAM抗体包含来自免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的任意一个)的Fc序列。在一些实施方式中，所述全长抗EpCAM抗体包含IgG(如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4中的任意一种)的Fc序列。在一些实施方式中，所述全长抗EpCAM抗体包含人免疫球蛋白的Fc序列。在一些实施方式中，所述全长抗EpCAM抗体包含Fc序列，所述Fc序列被改变或经过其它变化使得其具有增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应功能。
本发明还提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其能与任意一种本文所述的抗EpCAM抗体相竞争以结合EpCAM。在一些实施方式中，还提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其结合于任意一种本文所述的抗EpCAM抗体的相同表位。筛选具有所需特异性的抗体的方法包括，但不限于，酶联免疫吸附测定法(ELISA)和其它本领域已知的免疫介导技术。
本领域技术人员会认识到：可能无需过度的实验而确定一种单克隆抗体是否具有与本发明的单克隆抗体(例如，具有SEQ ID NO:19的重链可变区和SEQ ID NO:20的轻链可变区的抗EpCAM抗体)相同的特异性，这通过确认前者是否阻止了后者与EpCAM的结合来进行。如果被测试的单克隆抗体与本发明的单克隆抗体竞争，如通过本发明的单克隆抗体的结合降低所示，则这两种单克隆抗体能结合相同或密切相关的表位。
确定一种单克隆抗体是否具有本发明的单克隆抗体的特异性的替代性方法是将本发明的抗体与可溶的EpCAM蛋白(与其具有正常反应性)预温育，然后加入被测试的单克隆抗体以确定被测试的单克隆抗体在其结合EpCAM的能力方面是否受到抑制。如果被测试的单克隆抗体被抑制，则很可能其具有与本发明的单克隆抗体相同或功能等同的表位特异性。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体是单克隆抗体，例如单价抗体。在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗原结合片段为以下形式：Fab、Fab'、F(ab)'2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双价抗体(diabody)或线性抗体。
在一些实施方式中，提供了包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的抗EpCAMscFv，所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述抗EpCAMscFv包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAMscFv包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAMscFv包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体是多特异性抗体，不仅能结合EpCAM，还能结合一个或多个其它靶物并可选地抑制其功能。多特异性抗体是单克隆的优选人或人源化抗体，其对两个或多个不同抗原具有结合特异性(例如，对至少两个抗原具有结合特异性的双特异性抗体)。例如，结合特异性之一可为针对EpCAM蛋白，另一个可为针对任何其它抗原。在一些实施方式中，所述其它抗原是细胞表面蛋白或受体或受体亚基，例如细胞表面蛋白可为CD3，如CD3ε。由此，根据一种实施方式，本发明的双特异性抗体可同时结合EpCAM和(例如)第二个细胞表面受体。
在一些实施方式中，所述多特异性抗EpCAM分子是例如双价抗体(Db)、单链双价抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚scDb(LD-scDb)、环状二聚scDb(CD-scDb)、二双价抗体、串联scFv,串联双scFv(例如双特异性T细胞衔接器)、串联三scFv、三价抗体、双特异性Fab2、二迷你抗体、四价抗体、scFv-Fc-scFv融合,双亲和重靶向(DART)抗体、双可变结构域(DVD)抗体、IgG-scFab、scFab-ds-scFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体、基座和锁(DNL)抗体、节入穴(KiH)抗体(通过KiH技术制备的双特异性IgG)、DuoBody(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)、异源多聚抗体或异源缀合抗体。在一些实施方式中，所述多特异性抗EpCAM分子是串联scFv(例如串联双scFv，如双特异性T细胞衔接器)。
本发明还进一步提供了包含本文所述的任何抗EpCAM抗体或其抗原结合片段的融合蛋白、缀合物或分离的细胞。
在一些实施方式中，提供了一种包含抗EpCAM抗原结合片段的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，所述EpCAM抗原结合片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含单个抗EpCAM抗原结合片段，其中所述抗EpCAM抗原结合片段与Fab片段的重链多肽或Fab片段的轻链多肽的N末端融合。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含两个抗EpCAM抗原结合片段或两个拷贝的抗EpCAM抗原结合片段。
在一些实施方式中，提供了一种包含Fab片段和抗EpCAM抗原结合片段的多特异性(如双特异性)Fab融合蛋白，其中所述Fab片段的重链多肽的N端或轻链多肽的N端与抗EpCAM抗原结合片段融合，其中所述抗EpCAM抗原结合片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含Fab片段、第一抗EpCAM抗原结合片段和第二抗EpCAM抗原结合片段，其中所述Fab片段的重链多肽的N端与第一抗EpCAM抗原结合片段融合，并且所述Fab片段的轻链多肽的N端与第二抗EpCAM抗原结合片段融合。在一些实施方式中，所述第一抗EpCAM抗原结合片段和所述第二抗EpCAM抗原结合片段具有相同的序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗EpCAM抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗原结合片段是scFv，如包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的scFv。
包含一种或多种本文所述的抗EpCAM抗原结合片段的多特异性Fab融合蛋白可进一步包含上述第II部分“治疗癌症的方法”的“多特异性Fab融合蛋白”小节中描述的多特异性Fab融合蛋白的一种或多种特征。
在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含Fab片段，所述Fab片段特异性结合免疫效应分子。在一些实施方式中，所述Fab片段能结合T细胞受体。在一些实施方式中，所述Fab片段能结合CD3ε链。在一些实施方式中，所述Fab片段结合细胞表面靶物，所述细胞表面靶物选自FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIa、NKG2D、CD25、CD28、CD137、CTLA-4、FAS、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、GITR、LTβR、TLR、TRAIL受体1、TRAIL受体2、EGFR、Her2/neu和ErbB3。
在一些实施方式中，所述Fab片段特异性结合CD3，例如CD3ε的N端，例如CD3ε的N端1-27位氨基酸。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述含重链可变区(VH)包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区(VL)包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。在一些实施方式中，所述Fab片段包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述第二多肽包含EQ ID NO:23的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段缀合于治疗剂(例如细胞毒性药物、放射性同位素和化疗药物)或用于通过成像(例如放射性同位素、荧光染料和酶)检测患者样本中或体内的EpCAM的标记物。在一些实施方式中，所述抗EpCAM抗体或其抗原结合片段缀合于毒素。
在一些实施方式中，提供了一种抗EpCAM嵌合抗原受体(CAR)，其包含：a)包含本文所述的任意一种抗EpCAM抗体或其抗原结合片段的胞外结构域；和b)胞内信号传导结构域。一种跨膜结构域可存在于胞外结构域和胞内结构域之间。在抗EpCAM CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或抗EpCAM CAR的胞内结构域和跨膜结构域之间，可能有一个间隔结构域，如肽接头(例如，柔性的肽接头)。本发明的抗EpCAM CAR使用的胞内信号传导结构域的例子包括在抗原受体接合后协同作用以引发信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及任何这些序列的衍生体或变体，和具有相同的功能能力的任何合成的序列。任何用于生产CAR的方法都可在本发明中使用。参见例如，US6,410,319、US7,446,191、US7,514,537、WO 2002/077029、US2010/065818、US 2010/025177、US 2007/059298、和Berger C.等,J.Clinical Investigation 118:1 294-308(2008)。
在一些实施方式中，提供了一种包含胞外结构域的抗EpCAM重组T细胞受体(TCR)，所述抗EpCAM重组T细胞受体(TCR)包含本发明所述的任何抗EpCAM抗体或其抗原结合片段中的任意一种。改造TCR的方法已描述于，例如参见Stone J.D.等T Cell receptorengineering,Methods Enzymol.(2012)503:189-222。
本发明还提供表达所述抗EpCAM CAR或TCR的分离的细胞(如CAR-T或TCR-T细胞)，以及使用所述抗EpCAM CAR或TCR、或表达所述抗EpCAM CAR或其TCR的细胞治疗疾病(如癌症)的方法。
本发明所述的抗EpCAM抗体或抗原结合片段可用于各种治疗和诊断方法。本发明还提供了治疗个体中的癌症的方法，包含对个体施用有效量的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或其药物组合物。例如抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)可单独或与其他药剂组合用于治疗以异常EpCAM表达为特征的疾病，包括但不限于，头颈癌，胰腺癌，结肠直肠癌和肺癌。本发明提供的抗体也可用于检测患者或患者样本中的EpCAM蛋白。
单克隆抗体
本发明的单克隆抗体进行筛选的方法可被实施，例如通过测量EpCAM介导的信号传导，并确定所测试的单克隆抗体是否能够调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其他方式干扰EpCAM介导的信号传导。这些测定可包括竞争性结合测定法。此外，这些测定可测量生物读数。
可使用本领域中已知的多种方法以产生针对EpCAM或针对其衍生物、片段、类似物、同源物或直系同源物的单克隆抗体(参见例如Antibodies:A Laboratory Manual《抗体：实验室手册》，Harlow E和Lane D，1998，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，纽约冷泉港，其通过提述并入本文)。全人抗体指轻链和重链的全部序列(包括CDR)均来源于人基因的抗体分子。本文中这类抗体被称作“人抗体”或“全人抗体”。例如，可使用下文实施例中描述的方法制备人单克隆抗体。还可使用杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等，1983Immunol Today 4:72)制备人单克隆抗体；以及使用EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见Cole等,1985,MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY(《单克隆抗体和癌症疗法》),ARL有限公司(Alan R.Liss,Inc.),第77-96页)。可利用人单克隆抗体并可通过使用人杂交瘤(参见Cote等,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030)或通过用爱泼斯坦-巴尔二氏(Epstein Barr)病毒体外转化人B细胞(参见Cote等,1985,MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY(《单克隆抗体和癌症疗法》),ARL有限公司(Alan R.Liss,Inc.),第77-96页)以产生人单克隆抗体。
可通过熟知的技术纯化抗体，如使用主要提供免疫血清的IgG级分的蛋白A或蛋白G进行亲和层析。随后或可选择的，可将作为免疫球蛋白目标的特异性抗原或其表位固定在柱子上以通过免疫亲和层析纯化免疫特异性抗体。例如，D.Wilkinson讨论了免疫球蛋白的纯化(The Scientist(《科学家》,科学家出版社(The Scientist,Inc.)出版,宾夕法尼亚州费城,卷14,第8期(2000年4月17日),第25-28页)。
本发明的抗EpCAM抗体是单克隆抗体。能够调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其他方式干扰EpCAM介导的细胞信号传导的单克隆抗体可通过以下方法产生，例如通过使用膜结合和/或可溶的EpCAM(例如人EpCAM或其免疫原性片段、衍生物或变体)免疫动物后产生；或者，用细胞免疫动物，所述细胞转染有包含编码EpCAM的核酸分子的载体，使得EpCAM表达并接合在经转染的细胞表面；或者，通过筛选包含用于结合EpCAM抗体或抗原结合域序列的文库以获得抗体。例如在噬菌体中制备该文库，蛋白质或肽与表达在组装的噬菌体颗粒表面上的噬菌体外壳蛋白融合，且编码的DNA序列包含在噬菌体颗粒内(即“噬菌体展示文库”)。随后筛选来源于骨髓瘤/B细胞融合物的杂交瘤的对EpCAM的反应性。
例如，可采用杂交瘤法来制备单克隆抗体，所述方法例如由Kohler和Milstein，Nature 256:495(1975)所述的那些。在杂交瘤法中，通常用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，来引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性地与所述免疫剂结合。或者，也可体外免疫淋巴细胞。
所述免疫剂通常包括蛋白抗原、其片段或其融合蛋白。通常，如果需要人来源的细胞则使用外周血淋巴细胞，如果需要非人哺乳动物来源则使用脾细胞或淋巴结细胞。随后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(《单克隆抗体：原理与实践》)，学术出版社(Academic Press)，(1986)第59-103页)。永生细胞系通常是经转染的哺乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。经常可使用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞。可在优选含有抑制未融合、永生化的细胞生长或存活的一种或多种物质的合适培养基中培养杂交瘤细胞。例如，如果亲本细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤培养基一般包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质能防止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的永生细胞系是有效地融合、支持抗体由所选抗体产生细胞的稳定高水平地表达并对培养基(例如HAT培养基)敏感的那些。更优选的永生细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，可获自例如加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克细胞销售中心(Salk Institute CellDistribution Center)和弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)。人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系也被描述用于产生单克隆抗体。(参见Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications(《单克隆抗体生产技术和应用》),马塞尔-德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,(1987)第51-63页)。
随后可测定其中培养杂交瘤细胞的培养基中针对所述抗原的单克隆抗体的存在。优选使用免疫沉淀或体外结合试验，例如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。这类技术和试验是本领域已知的。可通过例如Munson和Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的斯卡查德(Scatchard)分析确定单克隆抗体的结合亲和性。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，重要的是鉴定对靶抗原具有高度特异性和高度亲和性的抗体。
鉴定出所需的杂交瘤细胞后，通过限制稀释法对克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长。(参见Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(《单克隆抗体：原理与实践》)，学术出版社(Academic Press)，(1986)第59-103页)。合适的用于该目的的培养基包括例如达氏修正伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagles Medium)和RPMI-1640培养基。或者，可以哺乳动物中腹水的形式在体内生长杂交瘤细胞。
可用常规免疫球蛋白纯化方法(例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)而从培养基或腹水流体中分离或纯化亚克隆分泌的单克隆抗体。
还可通过重组DNA法制备单克隆抗体，如美国专利第4,816,567号中所述。可使用常规方法(例如通过使用特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可容易地分离和测序编码本发明的单克隆抗体的DNA。本发明的杂交瘤细胞可用作这种DNA的优选来源。一旦分离后，可将该DNA置于表达载体中，然后转染到宿主细胞(例如中华仓鼠卵巢(CHO)、人胚胎肾(HEK293)细胞、猿COS细胞、PER.C6、NS0细胞、SP2/0、YB2/0、或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，从而在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。也可修饰该DNA，例如使用人重链和轻链恒定域的编码序列取代同源鼠序列(参见美国专利第4,816,567号；Morrison,Nature 368,812-13(1994))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接于免疫球蛋白编码序列。这类非免疫球蛋白多肽可被本发明抗体的恒定区取代，或被本发明抗体的一个抗原结合位点的可变域取代以产生嵌合二价抗体。
人抗体和抗体人源化
本发明的单克隆抗体包括全人抗体或人源化抗体。这些抗体适于对人施用，不会通过人针对所给予的免疫球蛋白的抵抗而引起免疫反应。
可以使用本领域已知的任何方法获得抗-EpCAM抗体。例如，可在小鼠并随后在杂交瘤中使用经修改的RIMMS(多位点重复免疫)免疫策略鉴定本发明的EpCAM抗体。在其他替代性方法中，例如使用噬菌体展示法开发抗EpCAM抗体，所述噬菌体展示法使用仅包含人序列的抗体。这类方法是本领域已知的，例如在WO92/01047和美国专利号6,521,404中，其通过提述并入本文。在该方法中，使用天然或重组来源的EpCAM或其片段筛选携带随机轻链和重链对的组合噬菌体组合文库。在另一个方法中，可通过一过程产生抗EpCAM抗体，其中该过程的至少一个步骤包括使用人EpCAM蛋白免疫转基因非人动物。在该方法中，该异种非人动物的一些内源性重链和或κ轻链基因座被失能且无法进行生成编码响应抗原的免疫球蛋白的基因所需的重排。此外，至少一个人重链基因座和至少一个人轻链基因座已被稳定地转染至动物中。因此，作为对所施用抗原的响应，该人位点重排已提供编码对该抗原具有免疫特异性的人可变区的基因。因此，免疫后，转基因鼠产生分泌全人免疫球蛋白的B细胞。
多种用于产生异种非人动物的技术是本领域熟知的。例如，参见美国专利第6,075,181号和第6,150,584号，其通过提述以其整体并入本文。如1994年所发表的成果，其中展示了该一般策略连同第一个XenoMouseTM种系的产生。参见Green等,Nature Genetics 7:13-21(1994)，其通过提述以其整体并入本文。也可参见美国专利号6,162,963；6,150,584；6,114,598；6,075,181；和5,939,598和日本专利号3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068507 B2和欧洲专利号EP 0 463 151 B1以及国际专利申请号WO 94/02602、WO96/34096、WO98/24893、WO 00/76310和相关家族成员。
在替代方法中，其他人利用了“微基因座”法，其中外源Ig基因座通过包含来自Ig基因座的片段(个体基因)来模拟。因此，一种或多种VH基因、一种或多种DH基因、一种或多种JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成构建体以插入到动物中。参见例如，美国专利号5,545,806；5,545,807；5,591,669；5,612,205；5,625,825；5,625,126；5,633,425；5,643,763；5,661,016；5,721,367；5,770,429；5,789,215；5,789,650；5,814,318；5,877,397；5,874,299；6,023,010和6,255,458；以及欧洲专利号0 546 073B1；以及国际专利申请号WO92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO 98/24884和相关家族成员。
还证明了从小鼠生成人抗体，其中通过微细胞(microcell)融合引入大片段染色体或整个染色体。参见欧洲专利申请号773 288和843 961。
人抗小鼠抗体(HAMA)反应引领了制备嵌合或其他人源化抗体的产业。虽然嵌合抗体具有人恒定区和鼠可变区，预期会观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)反应，尤其在抗体的慢性或多剂量使用中。因此，人们希望提供抗EpCAM的全人抗体以削弱或缓和对HAMA或HACA反应的担忧和/或影响。
还可通过人源化、嵌合化和使用适当文库的展示技术实现低免疫原性抗体的产生。应理解可使用本领域中熟知的技术人源化或灵长化鼠抗体或来自其他物种的抗体。参考例如，Winter和Harris,Immunol Today 14:4346(1993)以及Wright等,Crit,ReviewsinImmunol.12125-168(1992)。可通过重组DNA技术改造感兴趣的抗体以用相应的人序列取代CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域(参见WO 92102190和美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,792；5,714,350和5,777,085)。而且，使用Ig cDNA以构建嵌合免疫球蛋白基因是本领域已知的(Liu等,P.N.A.S.84:3439(1987)和J.Immunol.139:3521(1987))。mRNA分离自产生抗体并用于产生cDNA的杂交瘤或其他细胞。可使用特异性引物通过聚合酶链式反应扩增感兴趣的cDNA(美国专利号4,683,195和4,683,202)。或者，制备并筛选文库以分离感兴趣的序列。随后将编码抗体可变区的DNA序列与人恒定区序列融合。人恒定区基因的序列可参见Kabat等(1991)Sequences of Proteins of immunologicalInterest(《感兴趣的免疫蛋白序列》),N.I.H.公开号91-3242。可容易地从已知克隆中获得人C区基因。可通过所需效应功能(例如补体固定)或在抗体依赖的细胞毒性中的活性指导同种型的选择。优选的同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可使用人轻链恒定区、κ或λ中任一者。然后使用常规方法表达嵌合、人源化抗体。
可通过切割完整蛋白，如通过蛋白酶或化学切割制备抗体片段(例如Fv、F(ab’)2和Fab)。或者，设计截短基因。例如，编码一部分F(ab’)2片段的嵌合基因包括编码CH1结构域和H链绞链区的DNA序列，后接翻译终止密码子，以产生截短分子。
可使用H和L J区的共有序列以设计用作引物的寡核酸，从而将有用的限制性位点导入J区中，用于随后V区片段与人C区片段的连接。可使用定点诱变修改C区cDNA以在人序列中的类似位置设置限制性位点。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV来源的附加体等。方便的载体指该载体编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列并带有适当限制性位点，其经改造后能够容易地插入和表达任意VH或VL序列。在这类载体中，剪接通常发生在插入的J区中的剪接供体位点和人C区之前的剪接受体位点之间，还发生在人CH外显子中的剪切区域上。聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点上。生成的嵌合抗体可连接至任意强启动子，包括逆转录病毒LTR，例如SV-40早期启动子(Okayama等，Mol.Cell.Bio.3:280(1983))、劳斯氏肉瘤病毒LTR(Gorman等，P.N.A.S.79:6777(1982))和莫罗尼鼠白血病病毒LTR(Grosschedl等，Cell 41:885(1985))。还应理解，可使用天然Ig启动子等。
此外，可通过展示类型技术制备人抗体或来自其他物种的抗体，包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其他技术，其中使用本领域熟知的技术并可对生成的分子进行额外熟化(例如亲和熟化)，这类技术是本领域熟知的。Wright等,Crit,Reviews in Immunol.12 125-168(1992)、Hanes和Plückthun,PNAS USA 94:4937-4942(1997)(核糖体展示)、Parmley和Smith,Gene 73:305-318(1988)(噬菌体展示)、Scott,TIBS,vol.17:241-245(1992)、Cwirla等,PNAS USA 87:6378-6382(1990)、Russel等,Nucl.Acids Research 21:1081-1085(1993)、Hoganboom等,Immunol.Reviews 130:43-68(1992)、Chiswell和McCafferty,TIBTECH；10:80-8A(1992)以及美国专利号5,733,743。如果使用展示技术产生非人抗体，可如上文所述对这类抗体进行人源化。
可使用这些技术产生针对表达EpCAM的细胞、EpCAM的可溶形式、其表位或肽以及其表达文库的抗体(参见例如美国专利号5,703,057)，随后可如上文所述根据本文所述的活性对这些抗体进行筛选。
可通过包含编码上文所述单链抗体的DNA片段的载体表达本发明的抗EpCAM抗体。
这些可包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂协助的DNA、基因枪、导管等。载体包括化学缀合物，如具有靶向部分(例如针对细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)的化学缀合物(如WO 93/64701中所述)、病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)、融合蛋白(例如PCT/US95/02140(WO 95/22618)中所述，其为包含靶向部分(例如对靶细胞特异的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白)、质粒、噬菌体等。所述载体可为染色体的、非染色体的或合成的。
优选载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫罗尼鼠白血病病毒。优选DNA病毒载体。这些载体包括痘病毒载体(例如正痘病毒或禽痘病毒载体)、疱疹病毒载体(例如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体)(参见Geller,A.I.等，J.Neurochem,64:487(1995)；Lim,F.等,于DNA Cloning:Mammalian Systems(《DNA克隆：哺乳动物系统》,D.Glover编(牛津大学出版社(Oxford Univ.Press)，英格兰牛津))(1995)；Geller,A.I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.:U.S.A.90:7603(1993)；Geller,A.I.等,Proc Natl.Acad.SciUSA 87:1149(1990))、腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等,Science,259:988(1993)；Davidson等,Nat.Genet 3:219(1993)；Yang等,J.Virol.69:2004(1995))以及腺相关病毒载体(参见Kaplitt,M.G.等,Nat.Genet.8:148(1994))。
痘病毒载体将基因导入细胞质中。禽痘病毒载体导致核酸仅发生短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体优选用于将核酸导入神经细胞中。腺病毒载体所引起的短期表达(约2个月)短于腺相关病毒(约4个月)，后者又短于HSV载体。所选择的特定载体取决于靶细胞和所治疗的病症。可通过标准技术完成导入，例如感染、转染、转导或转化。基因转移模式的示例包括例如裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE右旋糖酐、电穿孔、原生质体融合、脂质转染、细胞微注射和病毒载体。
可使用这些载体以靶向任意所希望的靶细胞。例如，可使用立体定位注射将载体(例如腺病毒、HSV)定位至希望的位置。此外，可使用微泵输注系统(例如思科洛美(Synchromed)输注系统)通过脑室内(icv)输注递送颗粒。一种基于总体流动(术语为对流)的方法也被证明能够有效地将大分子递送至脑的扩展区域，并可用于将载体递送至靶细胞。(参见Bobo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994)；Morrison等,Am.J.Physiol.266:292-305(1994))。其他可使用的方法包括导管、静脉内、胃肠外、腹膜内和皮下注射以及口腔或其他已知的施用途径。
可使用这些载体表达大量的能够以多种方式使用的抗体。例如，检测样品中是否存在EpCAM。所述抗体还可用于尝试结合和破坏EpCAM介导的信号传导。
可调整技术使之适应对本发明的抗原蛋白特异的单链抗体的产生(参见例如美国专利号4,946,778)。此外，可调整方法使之适应Fab表达文库的构建(参见例如Huse等,1989Science 246:1275-1281)，从而能够快速且有效地鉴定对某种蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所需特异性的单克隆Fab片段。包含针对蛋白抗原的同种型的抗体片段可使用本领域已知的技术产生，包括但不限于：(i)通过对抗体分子进行胃蛋白酶消化生成的F(ab’)2片段；(ii)通过还原F(ab’)2的二硫键桥生成的Fab片段；(iii)通过使用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子生成的Fab片段；以及(iv)Fv片段。
本发明还包括Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2EpCAM片段、单链EpCAM抗体、单结构域抗体(例如纳米抗体或VHH)、多特异性(如双特异性)抗EpCAM抗体和异源缀合抗EpCAM抗体。
制备双特异性抗体的方法为本领域已知。通常，双特异性抗体的重组产生是基于共同表达两对免疫球蛋白重链/轻链对，其中两条重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)可能产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常须用亲和层析步骤纯化该正确的分子。公开于1993年5月13日的WO93/08829和Traunecker等，EMBO J.,10:3655-3659(1991)公开了相似方法。
具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域可以与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选与含有至少部分绞链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有结合轻链所必需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物，如果需要还有免疫球蛋白轻链的DNA，插入单独的表达载体中，共同转染到合适的宿主生物体中。产生双特异性抗体的进一步详情参见例如，Suresh等,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
按照WO 96/27011所述的另一方法，可工程改造一对抗体分子之间的界面以最大程度提高从重组细胞培养物中回收的异源二聚体百分比。优选界面包含抗体恒定结构域的至少部分CH3区。在这种方法中，用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代第一抗体分子界面上的一个或多个较小氨基酸侧链。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代较大氨基酸侧链，在第二抗体分子界面上产生与较大侧链相同或相似大小的补偿性“空穴”。这提供了用于增加异源二聚体相对于不希望的终产物如同源二聚体的产率的机制。
可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。文献中描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81(1985)描述了一种方法，其中通过蛋白水解切割完整抗体以产生F(ab')2片段。在二硫醇复合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段可稳定邻近的二硫醇并阻止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab’片段转变成巯基硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate，TNB)衍生物。然后用巯基乙胺还原将Fab’-TNB衍生物之一再转变成Fab’-硫醇，与等摩尔量的另一Fab’-TNB衍生物混合从而形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作酶的选择性免疫试剂。
此外，可从大肠杆菌中直接回收Fab’片段，将其化学缀合以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了一种全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子的产生。各Fab’片段分别从大肠杆菌(E.coli)分泌，对其进行体外定向化学偶连而形成双特异性抗体。
从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已有描述。例如，利用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接于两种不同抗体的Fab’部分。在绞链区还原该同质二聚体抗体形成单体，然后再氧化形成异质二聚体抗体。也可用该方法产生抗体同质二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)所述的“双特异抗体”技术为制备双特异性抗体片段提供了替代机制。这些片段包含通过接头与轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)，所述接头短到不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了另一使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
涵盖多于二价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
例示性双特异性抗体可结合两种不同的表位，其中至少一个来源于本发明的蛋白抗原。或者，可将免疫球蛋白分子的抗抗原性臂与结合至白细胞上的引发分子(例如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合，从而将细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。也可利用双特异性抗体将细胞毒剂定位至表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂(如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。另一个感兴趣的双特异性抗体结合本文所述蛋白抗原，并且还结合组织因子(TF)。
异源缀合物抗体也在本发明的范围内。异源缀合物抗体有两个共价连接的抗体组成。例如，已提出这类抗体使免疫系统细胞靶向不想要的细胞(参见美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(参见WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。预期可通过合成蛋白化学的已知方法来制备该抗体，包括使用交联剂的那些方法。例如，可使用二硫交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的示例包括亚氨基硫醇和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸(butyrimidate)以及例如美国专利号4,676,980中公开的那些。
在效应功能方面修饰本发明的抗体是可期望的，以增强例如抗体在治疗异常EpCAM信号传导相关疾病和紊乱中的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在该区域中形成链间二硫键。如此产生的同源二聚体抗体可能具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等,J.ExpM编,176:1191-1195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992))。或者，可工程改造具有双Fc区的抗体，使其补体裂解能力和ADCC能力得到提高。(参见Stevenson等,Anti-CancerDrug Design,3:219-230(1989))。
本发明还涉及免疫缀合物，所述免疫缀合物包括缀合有细胞毒性试剂如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)的抗体。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、分裂毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族毒素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于放射性缀合抗体的产生。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
所述抗体与细胞毒剂的缀合可利用多种双功能蛋白缀合剂完成，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸盐(SPDP)、亚氨基四氢噻吩(IT)、亚胺酸酯的双功能衍生物(如己二酸亚氨酸二甲酯HCL)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(p-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(p-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰苄基-3-亚甲二氧基三胺五乙酸(1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid,MX-DTPA)为用于缀合放射性核素与抗体的例示性螯合剂。(参见WO94/11026)。
本领域普通技术人员应认识到可将大量可能的部分缀合至本发明的所得抗体。(参加例如“Conjugate Vaccines”,Contributions to Microbiology and Immunology(《“缀合疫苗”，对微生物学和免疫学的贡献》),J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr编,卡吉尔出版社(Carger Press),纽约,(1989)，其全部内容通过提述以其整体并入本文)。
可通过任意能够使两种分子结合的化学反应完成缀合，前提是抗体和其他部分保持其各自的活性。该连接可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、插层、协同结合和复合。但优选的结合是共价结合。可通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的整合完成共价结合。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子(例如本发明的抗体)缀合至其他分子。例如，代表性缀合剂可包括有机化合物，如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和1,6-己二胺。这一列表并不旨在穷尽各种本领域已知的缀合剂类别，而是较常用缀合剂的示例。(参见Killen和Lindstrom,Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等,Immunological Reviews 62:185-216(1982)；以及Vitetta等,Science 238:1098(1987))。
文献中描述了优选的接头。(参见例如Ramakrishnan,S.等，Cancer Res.44:201-208(1984)，其描述了MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)用法)。还可参见美国专利号5,030,719，其描述了通过寡肽接头将卤化乙酰肼衍生物与抗体缀合。具体地，优选接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)-甲苯(皮尔斯化学公司(Pierce Chem.Co.),目录号21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶二硫)丙酰胺基]己酸乙酯，皮尔斯化学公司(Pierce Chem.Co.),目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶二硫)丙酰胺基]己酸乙酯，皮尔斯化学公司(Pierce Chem.Co.),目录号2165-G)；和(v)缀合至EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：皮尔斯化学公司(PierceChem.Co.),目录号24510)。
上文所述接头包含具有不同特性的组分，从而导致缀合物具有不同的理化特性。例如，烷基羧化物的磺基-NHS酯比芳香族羧化物的磺基-NHS酯更稳定。包含接头的NHS-酯的溶解性低于磺基-NHS酯。此外，接头SMPT包含空间位阻的二硫键，并可形成稳定性增加的缀合物。二硫接头通常不如其他接头稳定，因为二硫接头会在体外被切割，导致可用的缀合物较少。磺基-NHS特别能够增强碳二亚胺缀合的稳定性。与磺基-NHS联用时碳二亚胺缀合(如EDC)形成比单独碳二亚胺缀合反应对水解更具抗性的酯。
本文所公开的抗体还可配制为免疫脂质体。可通过本领域已知的方法制备包含抗体的脂质体，例如Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030(1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。美国专利号5,013,556中公开了具有增强的循环时间的脂质体。
可通过反相蒸发方法，用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。使脂质体通过孔隙大小确定的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。可如Martin等,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中所述，通过二硫互换反应将本发明抗体的Fab'片段缀合于脂质体。
抗EpCAM抗体的用途
应理解根据本发明的治疗实体可与并入制剂中的合适的运载体、赋形剂和其他试剂一起施用，从而提供改善的转移、递送、耐受等。可从所有药物化学家已知的配方中找到许多合适的配方：Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)(第15版,马克出版公司(Mack Publishing Company),宾西马尼亚州伊斯顿,(1975))，特别是其中Blaug,Seymour所著的第87章。这些制剂包括例如粉末、糊剂、油膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡的半固体混合物。前述混合物中的任意一个均适用于根据本发明的治疗和疗法，前提是制剂中的活性成分并未受制剂影响而失活且该制剂是生理相容的且对施用途径耐受。还可参见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development:the need for preclinical guidance(药物赋形剂发展：临床前指导的需要)”Regul.Toxicol Pharmacol.32(2):210-8(2000)、WangW.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals(固体蛋白药物的冻干与开发)”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000)、Charman WN“Lipids,lipophilicdrugs,and oral drug delivery-some emerging concepts(脂质、亲脂性药物和口服药物递送—一些新兴的概念)”J Pharm Sci.89(8):967-78(2000)、Powell等,“Compendium ofexcipients for parenteral formulations(用于胃肠道外配方的赋形剂一览)”PDA JPharm Sci Technol.52:238-311(1998)，和其中与药物化学家们已知的制剂、赋形剂和运载剂相关的其他信息的引用文献。
在一个实施方式中，包括本发明的单克隆抗体的本发明的抗体可用作治疗剂。这类试剂通常用于诊断、预后、监控、治疗、缓和和/或预防受试者中异常EpCAM表达、活性和/或信号传导相关的疾病或病变。通过使用标准方法鉴定患有与异常EpCAM表达、活性和/或信号传导相关的疾病或病症(例如癌症或其他肿瘤病症)或处于疾病发展风险的受试者(例如人类患者)，可实施治疗方案。给予受试者一种抗体制剂，优选对其靶抗原具有高特异性和高亲和性的制剂，由于其与靶物的结合该制剂通常具有效果。抗体的施用可消除或抑制或干扰靶物(例如EpCAM)的表达、活性和/或信号传导功能。抗体的施用可消除或抑制或干扰靶物(例如EpCAM)与其天然状态下结合的内源性配体的结合。例如，抗体与靶物结合并调节、阻断、抑制、降低、拮抗、中和或以其他方式干扰EpCAM的表达、活性和/或信号传导。
作为非限制性示例，涉及异常的EpCAM表达、活性和/或信号传导的疾病或病症包括血液癌症和/或实体瘤。血液癌症包括例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。作为非限制性示例，白血病的某些形式包括急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、髓性增生疾病/肿瘤(MPDS)、和脊髓发育不良综合征。作为非限制性示例，淋巴瘤的某些形式包括霍奇金淋巴瘤、无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤(小细胞和大细胞)。作为非限制性示例，骨髓瘤的某些形式包括多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或本斯-琼斯骨髓瘤。实体瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤、结直肠癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和肾癌。
与癌症和其他肿瘤病症相关的症状包括例如炎症、发热、全身不适、发热、疼痛、经常定位至发炎区域(often localized to the inflamed area)、食欲下降、体重下降、水肿、头痛、疲劳、皮疹、贫血、肌无力、肌肉疲劳和腹部症状(如腹痛、腹泻或便秘)。
本发明的抗体的治疗有效量通常涉及达到治疗目标所需的量。如上所述，在某些情况下，抗体及其靶抗原之间的相互作用会干扰靶物的功能。施用所需的量进一步取决于抗体对其特异抗原的结合亲和性，还取决于在接受施用的受试者中给予的抗体从自由体积耗尽的速率。作为非限制性示例，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见范围为约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重。常见的剂量频率范围是例如每天两次至每周一次。
可连同用于诊断或治疗特定炎症相关病症的任何已知方法确定治疗的有效性。一种或多种炎症相关病症症状的缓解表明抗体具有临床益处。
在另一个实施方式中，针对EpCAM的抗体可用于本领域已知的与EpCAM定位和/或定量相关的方法中(例如用于测量合适的生理样品中EpCAM的水平、用于诊断方法、用于蛋白质成像等)。在特定的实施方式中，包含来源于抗体的抗原结合域的特异性针对EpCAM的抗体或其衍生物、片段、类似物或同源物被用作药理学活性化合物(下文称作“治疗(剂)”)。
在另一个实施方式中，可通过标准方法(例如免疫亲和、层析或免疫沉淀)使用EpCAM特异性的抗体分离EpCAM多肽。可在诊断中使用针对EpCAM蛋白(或其片段)的抗体作为临床测试流程的一部分以监控组织中的蛋白水平，从而例如确定特定治疗方案的有效性。将抗体与可检测物质缀合(即物理连接)可利于探测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适荧光材料的例子包括：伞形酮(umbelliferone)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括：萤光素酶、萤光素和发光蛋白；合适的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。
而在另一个实施方式中，本发明的抗体可用作检测样品中EpCAM(或其蛋白片段)的存在的试剂。在一些实施方式中，所述抗体含有可检测标记。抗体是多克隆的，或更优选地，是单克隆的。使用了完整的抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab’)2)。关于探针或抗体的术语“标记”，意在涵盖通过缀合(即物理连接)可检测物质与探针或抗体而对探针或抗体进行的直接标记，和通过与直接标记的另一试剂反应而进行的探针或抗体的间接标记。间接标记的示例包括使用荧光标记的二抗检测一抗和使用生物素标记DNA探针末端使得可使用荧光标记的链霉亲和素对其进行检测。术语“生物样品”旨在包括从受试者中分离的组织、细胞和生物液体，以及受试者中存在的组织、细胞和生物液体。因此，血液和血液的部分或组分(包括血清、血浆或淋巴)包括在术语“生物样品”的用法中。换言之，本发明的检测方法可用于在体外及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于体外检测分析物mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。用于体外检测分析物蛋白质的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于体外检测分析物基因组DNA的技术包括Southern杂交。进行免疫试验的方法可参见例如“ELISA:Theoryand Practice:Methods in Molecular Biology(《ELISA：理论与实践：分子生物学中的方法》)”,卷42,J.R.Crowther编,休曼出版社(Human Press),新泽西州托瓦它,1995；“Immunoassay(《免疫试验》)”,E.Diamandis和T.Christopoulus,学术出版社有限公司(Academic Press Inc.),加利福尼亚州圣地亚哥,1996；以及“Practice and Theory ofEnzyme Immunoassays(《酶促免疫测定的实践及理论》)”,P.Tijssen,埃尔斯威尔科学公司(Elsevier Science),阿姆斯特丹,1985。此外，体内检测分析物蛋白质的技术包括将经标记的抗分析物蛋白质抗体导入受试者中。例如，可使用放射性标志标记抗体，可通过标准成像技术检测受试者中放射性标志的存在和位置。
IV.制备方法
本发明所述的MSFP或抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)可用本领域已知的蛋白表达和纯化方法制备。
在一些实施方式中，本发明提供了分离的核酸，其编码本文所述的任意一种MSFP或抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)一个或多个多肽链。在一些实施方式中，所述分离的核酸包含SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32的核酸序列。所述分离的核酸可为DNA或RNA。
SEQ ID NO:31(编码SEQ ID NO:22的核酸)
gaggtgcagctggtggagtcagggggaggcttggtccagcctgggggatccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtaattattggatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaattctatgcggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacggctgtctattactgtgcgagagtggggccgtcctgggagcaggactactggggccagggaaccctggtcactgtctcggccggtggcggtggcagcggcggtggtgggtccggtggcggcggatctggcgcgcagtctgtactgactcaaccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcgggtcttattatggtgtgcactggtaccagcagcttccaggaacagcccccaaactcctcatctattctgacactaatcgaccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcggcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcgtatgacaagggcttcgggcaccgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctagggggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttaacacctacgccatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtcgcacgcataagaagtaaatataataattatgcaacatattatgccgattcagtgaaagaccggttcaccatctccagagacgattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgtgagacatgggaacttcggtaatagctacgtttcctggtttgcttactggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcagctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtccaccgtgctcatga
SEQ ID NO:32(编码SEQ ID NO:23的核酸)
gaggtgcagctggtggagtcagggggaggcttggtccagcctgggggatccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtaattattggatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaattctatgcggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacggccgtctattactgtgcgagagtggggccgtcctgggagcaggactactggggccagggaaccctggtcactgtctcggccggtggcggtggcagcggcggtggtgggtccggtggcggcggatctggcgcgcagtctgtactgactcaaccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcgggtcttattatggtgtgcactggtaccagcagcttccaggaacagcccccaaactcctcatctattctgacactaatcgaccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcggcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcgtatgacaagggcttcgggcaccgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctagggggccaggctgtggtgactcaggagccctcactgactgtgtccccaggagggacagtcactctcacctgtcgctcaagtactggggctgttacaactagtaactatgccaactgggtccagcagaaacctggacaagcacccaggggtctgattggtggtaccaacaagcgagctccaggtacccctgcccggttctcaggctccctccttgggggcaaagctgccctgacactgtcaggtgtgcagcctgaggacgaggctgagtattactgcgctctatggtacagcaacctctgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgtccaccgtgctcatga
在一些实施方式中，分离的核酸被插入载体，例如病毒载体或克隆载体。为了表达核酸，可将载体引入宿主细胞中以使多肽在宿主细胞中表达。表达载体可包含用于控制表达的多种元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择标记和信号序列。本领域技术人员可视情况选择这些元件。例如，可选择启动子序列以促进载体中多核酸的转录。合适的启动子序列包括但不限于T7启动子、T3启动子、SP6启动子、β-肌动蛋白启动子、EF1a启动子、CMV启动子和SV40启动子。可选择增强子序列以增强多聚核酸的转录。可以选择选择标记以便允许将插入载体的宿主细胞从未插入所述载体的宿主细胞中选择出来，例如选择标记可为赋予抗生素抗性的基因。可选择信号序列以便允许所表达的多肽被运输至宿主细胞之外。在一些实施方式中，分离的核酸还包含编码信号肽的核酸序列。在一些实施方式中，所述信号肽包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述编码信号肽的核酸序列包含SEQ ID NO:34的核酸序列。
SEQ ID NO:33(信号肽)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS
SEQ ID NO:34(编码信号肽的核酸)
atggaatggagctgggtctttctcttcttcctgtcagtaacgactggtgtccactcc
在一些实施方式中，提供了包含本文提供的载体的分离的宿主细胞。包含载体的宿主细胞可用于所述载体中包含的多核酸的表达或克隆。合适的宿主细胞可包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞例如哺乳动物细胞。本领域已建立抗体和抗原结合片段在原核细胞如大肠杆菌中的表达。对于综述，参见例如Pluckthun,A.BioTechnology 9:545-551(1991)。在真核细胞中的培养表达也被本领域技术人员用作产生抗体或其抗原结合片段的选择，参见最近的综述，例如Ref,M.E.(1993)Curr.OpinionBiotech.4:573-576；Trill J.J.等(1995)Curr.Opinion Biotech 6:553-560。高等真核细胞，特别是来源于多细胞生物体的那些可用于本文提供的糖基化多肽的表达。合适的高等真核细胞包括但不限于无脊椎动物细胞和昆虫细胞，以及脊椎动物细胞。
可利用本领域已知的任何合适方法将载体引入宿主细胞中，所述方法包括但不限于：DEAE-右旋糖酐介导的递送、磷酸钙沉淀法、阳离子脂质介导的递送、脂质体介导的转染、电穿孔法、微粒轰击、受体介导的基因递送、由聚赖氨酸、组蛋白、壳聚糖和肽介导的递送。用于目的载体表达的细胞转染和转化的标准方法为本领域已知。在一些实施方式中，宿主细胞包含编码第一多肽的第一载体和编码第二多肽的第二载体。在一些实施方式中，宿主细胞包含单一的载体，所述载体包含编码第一多肽和第二多肽的分离的核酸。
在一些实施方式中，本发明提供了表达本公开的任意一种MSFP或抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)的方法，包含培养含有载体的分离的宿主细胞以及从培养物中回收所述MSFP或抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)，所述分离的宿主细胞在允许表达插入于载体中的核酸的条件下培养，所述表达多核酸的合适的条件可包括但不限于：合适的培养基、培养基中宿主细胞的合适的密度、存在必要的营养物质、存在补充因子、合适的温度和湿度以及不存在微生物污染物。本领域普通技术人员可视情况选择用于表达目的的合适的条件。
在一些实施方式中，宿主细胞中表达的多肽可形成二聚体，并由此产生本发明的MSFP或抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)。在一些实施方式中，宿主细胞中表达的多肽可形成同源二聚体的多肽复合体。在一些实施方式中，宿主细胞中表达第一多肽和第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽可形成异源二聚体的多肽复合体。
在一些实施方式中，所述多肽复合体(例如MSFP或抗EpCAM抗体或其抗原结合片段)可在宿主细胞内形成，例如，二聚体可在相关酶和/或辅因子的帮助下在宿主细胞内形成。在一些实施方式中，所述多肽复合体可分泌至细胞外。在一些实施方式中，第一多肽和第二多肽可分泌至细胞外并在宿主细胞外形成二聚体(如MSFP或抗EpCAM抗体或其抗原结合片段)。
在一些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽可分别表达并允许在合适的条件下二聚化，形成MSFP或抗EpCAM抗体或其抗原结合片段。例如，可将所述第一多肽和第二多肽在合适的缓冲液中组合并允许第一蛋白单体和第二蛋白单体通过合适的相互作用例如疏水相互作用来二聚化。在一些实施方式中，可将所述第一多肽和第二多肽在包含酶和/或辅因子的合适的缓冲液中组合，所述酶和/或辅因子可促进所述第一多肽和第二多肽的二聚化。在一些实施方式中，可将所述第一多肽和第二多肽在合适的媒介中组合并允许其在存在合适的试剂和/或催化剂的情况下彼此相互作用。
可利用任何合适的方法来收集所表达的多肽和/或多肽复合体。多肽和/或多肽复合体可在细胞内、在细胞周质间隙中表达或分泌至细胞外进入培养基中。如果多肽和/或多肽复合体在细胞内表达，可裂解包含所述多肽和/或所述多肽复合体的宿主细胞，并可通过离心或超滤去除不想要的碎片来从裂解物中分离所述多肽和/或所述多肽复合体。如果所述多肽和/或所述多肽复合体分泌至大肠杆菌的细胞周质间隙，可在存在如醋酸钠(PH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的试剂的情况下在约30分钟内将胞浆解冻，并通过离心除去细胞碎片(Carter等,BioTechnology 10:163-167(1992))。如果所述多肽和/或所述多肽复合体分泌至培养基中，可利用市售的蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤装置)收集并浓缩细胞培养物的上清液。在收集和浓缩步骤中可包含蛋白酶抑制剂和/或抗生素以抑制蛋白降解和/或污染微生物的生长。
表达的多肽和/或多肽复合体可通过合适的方法来进一步纯化，所述方法例如包括但不限于：亲和层析法、羟基磷灰石层析法、大小排阻层析法、凝胶电泳、透析、在离子交换柱上的离子交换分离法、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析法、肝素琼脂糖上的层析法、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析法、层析聚焦法、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀法(参见综述Bonner,P.L.,Protein purification,Taylor&Francis,2007出版；Janson,J.C.等,Protein purification:principles,high resolution methods andapplications,Wiley-VCH,1998出版)。
在一些实施方式中，所述多肽和/或多肽二聚体可通过亲和层析法来纯化。在一些实施方式中，蛋白A层析或蛋白A/G(蛋白A和蛋白G的融合蛋白)层析可用于纯化包含来源于抗体CH2结构域和/或CH3结构域的组分的多肽和/或多肽复合体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))；Zettlit,K.A.,Antibody Engineering,Part V,531-535,2010)。在一些实施方式中，蛋白G层析可用于纯化包含IgGγ3重链的多肽和/或多肽复合体(Guss等,EMBO J.5:1567 1575(1986))。在一些实施方式中，蛋白L层析可用于纯化包含κ轻链的多肽和/或多肽复合体(Sudhir,P.,Antigen engineering protocols,第26章,Humana Press,1995出版；Nilson,B.H.K.等,J.Biol.Chem.,267,2234-2239(1992))。亲和配体附接的基质最常见的是琼脂糖，但可使用其它基质。相比琼脂糖能实现的，机械稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯具有更快的流速和更短的处理时间。如果抗体包含CH3结构域，Bakerbond ABX树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。
V.药物组合物、单位剂型、制品和试剂盒
本发明还提供了药物组合物，其包含任意一种所述的MSFP或抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)以及药学上可接受的载体。
药物组合物可用于多种本公开的施用方法，包括例如系统地或局部地注射。在一些实施方式中，所述药物组合物被配制用于静脉注射。在一些实施方式中，所述药物组合物被配制用于皮下注射。在一些实施方式中，所述药物组合物被配制用于局部注射于肿瘤部位。在一些实施方式中，所述药物组合物被配制用于瘤内注射。
使用的“载体”包括对暴露在所用剂量或浓度下的细胞或哺乳动物无毒性的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。常见的生理上可接受的载体是水溶性pH缓冲的溶液。可接受的载体、赋形剂对暴露在所用剂量或浓度下的接受者无毒性，并且包含缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方式中，药物组合物被制备成pH约4.5至约9.0的范围，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0范围中的任意一个。在一些实施方式中，药物组合物通过添加合适的强度改性剂如甘油制备成与血液等渗。
用于体内注射的药物组合物通常被制备成无菌的、实质等渗的，并且完全符合美国食品药品监督管理局的良好生产规范(GMP)法规。无菌性可通过采用无菌过滤膜过滤完成。在一些实施方式中，所述组合物不含病原体。为了注射，所述药物组合物可为液体形式，例如生理上兼容的缓冲液如Hank's溶液或Ringer's溶液。此外，药物组合物可以是固体形式，并且在使用前立即重新溶解或重悬。冻干的组合物也包括在本发明中。
在一些实施方式中，所述药物组合物被配制按照常规程序制备成适于静脉内、腹膜内，或玻璃体内注射的药物组合物。通常，用于注射的组合物是无菌等渗缓冲的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂如利诺卡因以减轻注射部位疼痛。通常，所述成分可单独提供或以单位剂型混合在一起，例如，作为在密封的容器(例如指示活性剂的量的安瓿或小袋)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当组合物通过输液施用时，其可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶进行分配。当组合物通过注射施用时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得成分可以在施用前进行混合。
在一些实施方式中，所述药物组合物适合于对人施用。在一些实施方式中，所述药物组合物保存在一个单次使用小瓶中，例如一个单次使用密封小瓶。在一些实施方式中，所述药物组合物保存在一个多次使用小瓶中。在一些实施方式中，所述药物组合物以散装的形式保存在容器中。在一些实施方式中，所述药物组合物是冷冻保存的。
本发明还提供了MSFP、抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)或其组合物的单位剂型。每剂量可包含自约0.01μg至约10mg，包括例如约0.01μg至约10mg、约0.01μg至约5mg、约0.01μg至约1mg、约0.1μg至约300μg、约0.1μg至约200μg、约0.1μg至约100μg、约0.1μg至约90μg、约0.1μg至约80μg、约0.1μg至约70μg、约0.1μg至约60μg、约0.1μg至约50μg、约0.1μg至约40μg、约0.1μg至约30μg、约0.1μg至约20μg、约0.1μg至约10μg、约0.1μg至约5μg,或约0.1μg至约1μg。在一些实施方式中，MSFP、抗EpCAM抗体(或其抗原结合片段)或其组合物的单位剂型以下任意一个范围内，所述范围的上限为0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、1000μg、1500μg、2000μg、2500μg、3000μg、6000μg、或10000μg中的任意一个，所述范围的下限独立地选自0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、1000μg、1500μg、2000μg、2500μg、3000μg、6000μg、或10000μg中的任意一个，并且其中所述下限小于所述上限。术语“单位剂型”是指对个体来说，适合作为单位剂量的物理离散的单位，每个单位含有经计算以产生所需疗效的活性物质的预定量，与合适的药物载体、稀释剂或赋形剂联合。这些单位剂型可以以单个或多个单位剂量存储于合适的包装，并且还可以进一步灭菌并密封。
本发明还提供了包含在合适包装中的本公开的组合物(如药物组合物)的制品。对于所描述的组合物(例如如MSFP或抗-EpCAM抗体组合物)合适的包装是本领域中已知的，并且包括，例如，小瓶(例如密封的小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如密封聚酯薄膜或塑料袋)等。这些制品可进一步被灭菌和/或密封。
本发明还提供了包含所述组合物(如药物组合物)的试剂盒，以及进一步包含所述组合物的使用方法说明，例如本文描述的使用。本文所述的试剂盒可进一步包括从商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器以及具有用于执行本文所述的任何方法的说明的包装插页。
例示性实施方式
本发明提供了下列实施方式：
1.一种治疗个体中的癌症的方法，其包含对个体施用有效量的多特异性Fab融合蛋白，所述多特异性Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段，和特异性结合EpCAM的结合域；其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合；并且其中所述多特异性Fab融合蛋白的施用剂量是约0.01μg/kg到约250μg/kg。
2.如实施方式1所述的方法，其中，所述结合域是scFv。
3.如实施方式2所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv，和特异性结合EpCAM的第二scFv；其中，所述第一scFv与所述Fab片段的VH的N端融合；并且其中所述第二scFv与所述Fab片段的VL的N端融合。
4.如实施方式3所述的方法，其中，所述第一scFv和所述第二scFv具有相同序列。
5.如实施方式1-4任一项所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。
6.如实施方式1-5任一项所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。
7.如实施方式6所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白每周施用两次。
8.如实施方式1-7任一项所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴为约0.1μg/kg至约100μg/kg的剂量施用。
9.如实施方式1-8任一项所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以不引起细胞因子风暴的剂量施用。
10.如实施方式9所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴为不高于约30μg/kg的剂量施用。
11.如实施方式1-10任一项所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以第一剂量施用于个体第一时间段，并且连续地，所述多特异性Fab融合蛋白以第二剂量施用于个体第二时间段，并且其中所述第二剂量超过所述第一剂量。
12.如实施方式11所述的方法，其中，所述第二时间段超过所述第一时间段。
13.如实施方式11或实施方式12所述的方法，其中，所述第一时间段为至少约7天。
14.如实施方式11-13任一项所述的方法，其中，所述第二时间段为至少约2周。
15.如实施方式11-14任一项所述的方法，其中，所述第一剂量为不超过约1μg/kg。
16.如实施方式11-14任一项所述的方法，其中，所述第二剂量为约0.1μg/kg至约10μg/kg。
17.如实施方式1-16任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包含对个体施用糖皮质激素。
18.如实施方式17所述的方法，其中，所述糖皮质激素是地塞米松。
19.如实施方式17或实施方式18所述的方法，其中，所述糖皮质激素在所述多特异性Fab融合蛋白的第一剂量之前施用。
20.如实施方式17-19任一项所述的方法，其中，所述糖皮质激素以约0.1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用。
21.如实施方式1-20任一项所述的方法，其中，所述个体是人类个体。
22.如实施方式1-21任一项所述的方法，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的N端。
23.如实施方式22所述的方法，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε氨基酸1-27内的表位。
24.如实施方式23所述的方法，其中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3。
25.如实施方式23或实施方式24所述的方法，其中，所述Fab片段的VL包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
26.如实施方式23-25任一项所述的方法，其中，所述Fab片段的VH包含与选自SEQID NO:7和39-43的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
27.如实施方式23-26任一项所述的方法，其中，所述Fab片段的VL包含与选自SEQID NO:8和44-47的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
28.如实施方式23-27任一项所述的方法，其中，所述Fab片段包含人免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
29.如实施方式23-27任一项所述的方法，其中，所述Fab片段包含人λ轻链恒定区，所述人λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
30.如实施方式23-29任一项所述的方法，其中，所述Fab片段的CH1和CL通过一个或更多二硫键连接。
31.如实施方式30所述的方法，其中，所述Fab片段包含第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
32.如实施方式30或实施方式31所述的方法，其中，所述Fab片段包含第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
33.如实施方式1-32任一项所述的方法，其中，所述癌症是EpCAM阳性实体癌。
34.如实施方式33所述的方法，其中，所述EpCAM阳性实体癌是癌瘤或腺癌。
35.如实施方式1-34任一项所述的方法，其中，所述癌症选自下组：小肠癌，结肠直肠癌，肺癌，宫颈癌，肝癌，胃癌，胰腺癌，皮肤癌，肾癌，膀胱癌，甲状腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，乳腺癌，胆管癌和头颈癌。
36.如实施方式35所述的方法，其中，所述癌症是结肠直肠腺癌。
37.如实施方式35所述的方法，其中，所述癌症是肺腺癌。
38.如实施方式2-37任一项所述的方法，其中，所述scFv包含N-VH-VL-C融合多肽。
39.如实施方式2-38任一项所述的方法，其中，所述scFv的VH包含：包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1；包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2；和包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的HVR-H3。
40.如实施方式2-39任一项所述的方法，其中，所述scFv的VL包含：包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
41.如实施方式2-40任一项所述的方法，其中，所述scFv的VH包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
42.如实施方式2-41任一项所述的方法，其中，所述scFv的VL包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
43.如实施方式42所述的方法，其中，所述scFv包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
44.如实施方式1-43任一项所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
45.如实施方式1-44任一项所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
46.一种抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，(2)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和(3)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，(2)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
47.如实施方式46所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变域序列包含VH，所述VH包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
48.如实施方式46或47所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变域序列包含VL，所述VL包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
49.如实施方式46-48任一项所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗EpCAM抗体包含人IgG的Fc序列。
50.如实施方式46-49任一项所述的抗EpCAM抗体，其中，所述抗EpCAM抗体是多特异性抗体。
51.如实施方式46-48任一项所述的抗EpCAM抗体的抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是单链Fv(scFv)。
52.如实施方式51所述的抗EpCAM抗体的抗原结合片段，其中，所述scFv包含与SEQID NO:21的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
53.一种多特异性Fab融合蛋白，其包含实施方式46-48和51-52任一项所述的抗EpCAM抗原结合片段。
54.如实施方式53所述的多特异性Fab融合蛋白，其包含特异性结合CD3的Fab片段、抗EpCAM抗原结合片段的第一拷贝和抗EpCAM抗原结合片段的第二拷贝；其中，所述抗EpCAM抗原结合片段的第一拷贝与所述Fab片段的VH的N端融合；并且，其中所述抗EpCAM抗原结合片段的第二拷贝与所述Fab片段的VL的N端融合。
55.如实施方式54所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的N端。
56.如实施方式55所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε氨基酸1-27内的表位。
57.如实施方式56所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3。
58.如实施方式56或实施方式57所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段的VL包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
59.如实施方式56-58任一项所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段的VH包含与选自SEQ ID NO:7和39-43的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
60.如实施方式56-59任一项所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段的VL包含与选自SEQ ID NO:8和44-47的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
61.如实施方式53-60任一项所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段包含人免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
62.如实施方式53-61任一项所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段包含人λ轻链恒定区，所述人λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
63.如实施方式53-61任一项所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段的CH1和CL通过一个或更多二硫键连接。
64.如实施方式56-63所述的方法，其中，所述Fab片段包含第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
65.如实施方式56-64所述的方法，其中，所述Fab片段包含第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
66.一种分离的核酸分子，其编码实施方式46-65任一项所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或多特异性Fab融合蛋白。
67.一种表达载体，其包含实施方式66所述的分离的核酸分子。
68.一种分离的宿主细胞，其包含实施方式67所述的表达载体。
69.一种生产抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或多特异性Fab融合蛋白的方法，其包含培养实施方式68所述的分离的宿主细胞和从细胞培养物中回收所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或多特异性Fab融合蛋白。
70.一种组合物，包含实施方式46-65任一项所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或多特异性Fab融合蛋白，和药学上可接受的载体。
71.一种治疗个体中的癌症的方法，包含对所述个体施用有效量的实施方式70所述的组合物。
72.如实施方式46-65任一项所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或多特异性Fab融合蛋白在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途。
73.一种多特异性Fab融合蛋白在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域；其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合。
74.如实施方式73所述的用途，其中，所述结合域是scFv。
75.如实施方式74所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv，和特异性结合EpCAM的第二scFv；其中，所述第一scFv与Fab片段的VH的N端融合，所述第二scFv与Fab片段的VL的N端融合。
76.如实施方式75所述的用途，其中，所述第一scFv和所述第二scFv具有相同序列。
77.如实施方式73-76任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。
78.如实施方式73-77任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。
79.如实施方式78所述的方法，其中，所述多特异性Fab融合蛋白每周施用两次。
80.如实施方式73-79任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.1μg/kg至约250μg/kg。
81.如实施方式80所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以等同于对食蟹猴为约0.1μg/kg至约100μg/kg的剂量施用。
82.如实施方式63-81任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以不引起细胞因子风暴的剂量施用。
83.如实施方式63-82所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以第一剂量施用于个体第一时间段，并且连续地，所述多特异性Fab融合蛋白以第二剂量施用于个体第二时间段，并且其中所述第二剂量超过所述第一剂量。
84.如实施方式83所述的用途，其中，所述第二时间段超过所述第一时间段。
85.如实施方式83或实施方式84所述的用途，其中，所述第一时间段为至少约7天。
86.如实施方式83-85所述的用途，其中，所述第二时间段为至少约2周。
87.如实施方式83-86所述的用途，其中，所述第一剂量为不超过约1μg/kg。
88.如实施方式83-87所述的用途，其中，所述第二剂量为约0.1μg/kg至约10μg/kg。
89.如实施方式83-88所述的用途，其中，还进一步包含对个体施用糖皮质激素。
90.如实施方式89所述的用途，其中，所述糖皮质激素是地塞米松。
91.如实施方式89或实施方式90所述的用途，其中，所述糖皮质激素在所述多特异性Fab融合蛋白的第一剂量之前施用。
92.如实施方式89-91所述的方法，其中，所述糖皮质激素以约0.1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用。
93.如实施方式73-92所述的用途，其中，所述个体是人类个体。
94.如实施方式73-93任一项所述的用途，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的N端。
95.如实施方式94所述的用途，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε氨基酸1-27内的表位。
96.如实施方式95所述的用途，其中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2；和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3。
97.如实施方式95或实施方式96所述的用途，其中，所述Fab片段的VL包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2；和包含SEQID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
98.如实施方式95-97任一项所述的用途，其中，所述Fab片段的VH包含与选自SEQID NO:7和39-43的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
99.如实施方式95-98任一项所述的用途，其中，所述Fab片段的VL包含与选自SEQID NO:8和44-47的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
100.如实施方式95-99任一项所述的用途，其中，所述Fab片段包含人免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
101.如实施方式95-100任一项所述的用途，其中，所述Fab片段包含人λ轻链恒定区，所述人λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
102.如实施方式95-101任一项所述的用途，其中，所述Fab片段的CH1和CL通过一个或更多二硫键连接。
103.如实施方式102所述的用途，其中，所述Fab片段包含第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
104.如实施方式102或实施方式103所述的用途，其中，所述Fab片段包含第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
105.如实施方式73-104任一项所述的用途，其中，所述癌症是EpCAM阳性实体癌。
106.如实施方式105所述的用途，其中，所述EpCAM阳性实体癌是癌瘤或腺癌。
107.如实施方式73-106任一项所述的用途，其中，所述癌症选自下组：小肠癌，结肠直肠癌，肺癌，宫颈癌，肝癌，胃癌，胰腺癌，皮肤癌，肾癌，膀胱癌，甲状腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，乳腺癌，胆管癌和头颈癌。
108.如实施方式107所述的用途，其中，所述癌症是结肠直肠腺癌。
109.如实施方式107所述的用途，其中，所述癌症是肺腺癌。
110.如实施方式74-109任一项所述的用途，其中，所述scFv包含N-VH-VL-C融合多肽。
111.如实施方式74-110任一项所述的用途，其中，所述scFv的VH包含：包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的HVR-H3。
112.如实施方式74-111任一项所述的用途，其中，所述scFv的VL包含：包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
113.如实施方式74-112任一项所述的用途，其中，所述scFv的VH包含与SEQ IDNO:19的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
114.如实施方式74-113任一项所述的用途，其中，所述scFv的VL包含与SEQ IDNO:20的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
115.如实施方式114所述的用途，其中，所述scFv包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
116.如实施方式73-115任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
117.如实施方式73-116任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少约85％(如约100％)序列同一性的氨基酸序列。
实施例
以下的实施例旨在纯粹示例本发明，因此不应认为其以任何方式限制本发明。下面的实施例和发明详述作为说明提供，而不是作为限制提供。对于其中未描述实验方法的细节的实施方式，这些方法根据常规条件进行，例如Sambrook等在Molecular Cloning:ALaboratory Manual(纽约,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)描述的那些，或由制造商建议的实验方法。
实施例1：例示性双特异性Fab融合蛋白的表达和纯化
1.瞬时表达
Fab片段或Fab融合蛋白用常规的方法进行表达。将包含编码Fab融合蛋白轻链和重链DNA片段克隆入表达载体pcDNA，产生表达轻链和重链的构建体，为了使该轻链和重链的蛋白能分泌表达，这些构建体还包括信号肽。DNA测序鉴定插入基因正确。将构建体质粒转化入大肠杆菌以获得转染级的质粒DNA。在EXPI293TM培养基(Invitrogen)中培养HEK293F细胞。对于转染，将10mL含质粒DNA和25KD的聚乙烯亚胺(PEI)复合物的培养基(DNA/线性25KD PEI的重量比为1:3)加入90mL细胞培养物中。将转染细胞在CO2培养箱(37℃,5％CO2,125rpm)中培养约6天，然后收集上清液。
2.稳定表达
将编码包含EpCAM×CD3Fab融合蛋白(命名为ITAB1002)轻链的DNA片段(SEQ IDNo.32)克隆入携带潮霉素抗性基因的表达载体，将包含编码Fab融合蛋白重链(SEQ IDNo.31)的DNA片段克隆入携带嘌呤霉素抗性基因的表达载体。编码Fab融合蛋白轻链或重链基因的DNA片段还各包括Kozak序列、信号肽(氨基酸序列如SEQ ID No.33所示，核苷酸序列如SEQ ID No.34所示)，并将其克隆入HindIII和Not I限制酶位点之间以分别产生表达轻链和重链的构建体。将分别含重链和轻链基因的质粒DNA各40μg经由电穿孔法(MaxCyte)转染入对数生长期的CHO-S悬浮细胞，细胞数约为8x 108个，24小时后细胞计数，将转染细胞以约1.5x 106细胞/mL的细胞密度接种于含5μg/mL嘌呤霉素(Invitrogen)和200μg/mL潮霉素B(Hyclone)的CD OptiCHO培养基(Invitrogen)中，于CO2培养箱(37℃,5％CO2,125rpm)中培养。每2-3天更换新鲜的选择培养基，直至转染细胞恢复至正常生长速率，然后收集对数生长期的细胞，保存稳定转染细胞群体，并通过有限稀释法获得单细胞克隆。稳定转染细胞群体用补充了1X谷氨酸和1g/L PF68的CD OptiCHO培养基(Invitrogen)培养(37℃,5％CO2,125rpm)，当细胞浓度达到至少3x106细胞/mL时，将细胞转移至32℃培养(HF511 2.5％,HF502 0.2％MednaBio)，每2天更换培养基，培养基更换2-4次后收集细胞上清。
培养上清液采用IgG-CH1亲和层析纯化柱(Thermo Fisher Scientific)纯化目的蛋白。培养上清液经0.22μm无菌膜过滤，加载到用150mM NaCl，10mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)平衡的IgG-CH1亲和基质上，并以150mM NaCl，50mM醋酸钠缓冲液(pH3.5)洗脱，用2MTris调节洗脱液pH至7.2，用10KD分子量截留旋管(Sartorius)浓缩蛋白浓度，纯化的蛋白贮存于4℃。蛋白通常用4-20％的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)根据非还原和/或还原条件下(5％β-巯基乙醇)来进行分析，分析示于图2A和图2B中。进行非还原和/或还原毛细管电泳(CE-SDS,Beckman Coulter,PA800plus)来分析纯化的Fab融合蛋白，结果示于图3A和图3B中。HPLC分析指示，纯化的Fab融合蛋白的纯度为>90％。
图2A和图2B显示了纯化的EpCAM×CD3Fab融合蛋白的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳。其中，图2A显示了在非还原条件下的SDS-PAGE电泳图，泳道1为蛋白分子量标准PageRulerTMUnstained Protein Ladder(Thermo Scientific)，分子量从上至下依次为200、150、120、100、85、70、60、50、40、30、25、20、15、10KD，泳道2为纯化的蛋白，分子量为～100KD，与EpCAM×CD3Fab融合蛋白的理论分子量一致；图2B显示了在还原条件下SDS-PAGE电泳图，泳道1为蛋白分子量标准PierceTM Unstained Protein MW Marker(ThermoScientific)，分子量从上至下依次为116、66.2、45、35、25、18.4、14.4KD，泳道2为纯化的蛋白，其分子量为45-66kD。
图3A和图3B显示了纯化的EpCAM×CD3Fab融合蛋白的CE-SDS(毛细管电泳)电泳结果。其中，图3A描绘了在非还原CE-SDS结果，在迁移时间～21.59分钟处呈现单一的蛋白峰；图3B描绘了在还原CE-SDS结果，在迁移时间～18.37分钟和～18.84分钟处呈现两个单一的蛋白峰，分别对应于Fab融合蛋白的轻链和重链。
实施例2：EpCAM×CD3Fab融合蛋白的结合活性测定
抗原结合亲和力
采用带有抗人IgG Fc(AHC)捕获传感器的Octet QKe检测例示性的EpCAM×CD3Fab融合蛋白(例如ITAB1002)的抗EpCAM和抗CD3结构域与对应的人和食蟹猴抗原的亲和力。人EpCAM抗原构建体(huEpCAM.Fc)和食蟹猴EpCAM抗原构建体(cynoEpCAM.Fc)具有与人IgGFc融合的全长EpCAM蛋白。人CD3抗原构建体(CD3εAA1-27.Fc)和食蟹猴CD3抗原构建体(cynoCD3εAA 1-27.Fc)具有由与人IgG Fc融合的CD3εN端1-27位氨基酸组成的多肽。抗原构建体的表达参见美国专利8,846,042。用稀释液(PBS,0.1％BSA,0.02％Tween-20,0.05％NaN3)将抗原构建体稀释至0.02mg/mL、并将稀释后的抗原构建体固定在抗-hIgG Fc捕获(AHC)生物传感器上。将ITAB1002稀释至不同浓度，并以200μL/孔添加至黑色微孔板。还设置只含有PBS的对照孔。使用ForteBio Data Acquisition和ForteBio Data Analysis软件分析检测结果。
如表1所示，抗EpCAM和抗CD3结构域对人和食蟹猴的EpCAM及CD3构建体均分别具有高的体外结合亲和力，指示EpCAM×CD3Fab融合蛋白具有在人和食蟹猴中的交叉反应性。
表1.体外结合亲和力(Kd)
结构域 抗原 Kd(M)
抗EpCAM huEpCAM.Fc 3.49x 10<sup>-9</sup>
抗EpCAM cynoEpCAM.Fc 4.71x 10<sup>-9</sup>
抗CD3 CD3εAA 1-27.Fc 1.26x 10<sup>-8</sup>
抗CD3 cyno CD3εAA 1-27.Fc 1.56x 10<sup>-8</sup>
细胞结合亲和力
进行了以下结合测定以确定例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(即ITAB1002)与表达靶抗原细胞的结合亲和力。
使用荧光活化细胞分选(FACS)确定ITAB1002与人和食蟹猴外周血单个核细胞(hPBMC或cynoPBMC)的结合亲和力。
hPBMC的制备：健康成人白细胞浓缩液经PBS缓冲液(Gibco)稀释，通过密度梯度离心法(Ficoll-Paque,GE Healthcare)离心以获得PBMC，用PBS洗涤两次，然后于室温、1000g离心10分钟，收集细胞并重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基(Gibco)。
食蟹猴PBMC的制备：食蟹猴全血经PBS缓冲液(Gibco)稀释，通过密度梯度离心法(Ficoll-Paque,GE Healthcare)离心以获得PBMC，用PBS洗涤两次，然后于室温、1000g离心10分钟，收集细胞并重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基(Gibco)。
将ITAB1002用FACS缓冲液(含1％FBS的PBS)稀释至不同浓度，与约3.6x105个PBMC混合，于室温温育45分钟，同时设置无ITAB1002的阴性对照(1％FBS/PBS+hPBMC)。用FACS缓冲液洗涤细胞一次，重悬于50μL FACS缓冲液，补充CD4抗体(RFT-4g)缀合物(Invitrogen)和PE Mouse Anti-Human Light Chainλ(BD PharmingenTM)，并于室温温育45分钟。最终加入150μL FACS缓冲液，并使用C6(BD Bioscience)分析样品。检测结果示于图4A。
将ITAB1002在50μL FACS缓冲液(含1％FBS的PBS)中稀释至不同浓度，与约4×105个食蟹猴PBMC混合，于室温温育60分钟，同时设置无ITAB1002的阴性对照。将细胞用CD4抗体(RFT-4g)缀合物(Invitrogen)和PE Mouse Anti-Human Light Chainλ(BDPharmingenTM)染色，并于室温温育45分钟。最终加入150μL FACS缓冲液，使用C6(BD Bioscience)分析样品。检测结果示于图4B。
如图4A和图4B所示，EpCAM×CD3Fab融合蛋白对人和食蟹猴PBMC具有强力的结合亲和力，而阴性对照则基本上不具有对人和食蟹猴PBMC的结合亲和力。
此外，进行了以下结合测定以确定EpCAM×CD3Fab融合蛋白(即ITAB1002)对EpCAM+细胞的结合亲和力。
使用人结肠癌SW480细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)和转染了食蟹猴EpCAM的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(命名为CyEpCAM-CHO)确定ITAB1002对EpCAM的结合亲和力。SW480细胞或CyEpCAM-CHO细胞用0.25％Trypsin-EDTA(Gibco)消化，用FACS缓冲液重悬。将ITAB1002用FACS缓冲液稀释至不同浓度，按等体积分别与约1x105个SW480细胞或CyEpCAM-CHO细胞混合，然后于4℃温育30分钟。然后，用FACS缓冲液洗涤细胞并重悬于50μLFACS缓冲液，加入Mouse anti-Human IgG FabSecondary Antibody PE缀合物(Invitrogen)，并允许于4℃温育30分钟。最后，加入150μL FACS缓冲液，使用C6(BD Bioscience)分析样品。检测结果示于图5。
如图5所示，EpCAM×CD3Fab融合蛋白显示对表达人EpCAM的SW480细胞(EC50＝411.2ng/mL)和在细胞表面上表达食蟹猴EpCAM的CHO细胞(CyEpCAM-CHO,EC50＝107.6ng/mL)两者强力的结合亲和力。
因此，例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白ITAB1002在体外显示对人和食蟹猴抗原的交叉反应。双特异性Fab融合蛋白的交叉反应性可促进将食蟹猴中的毒性和功效研究结果外推至人体临床研究。
实施例3：EpCAM×CD3Fab融合蛋白对人PBMC细胞的肿瘤依赖性激活
CD4、CD8是T细胞的标志性表面抗原，由此可将T细胞分为CD4+和CD8+两大亚群，CD69是一种细胞表面受体，其在T细胞活化后上调。CD4+CD69+、CD8+CD69+亚型的百分比可作为T细胞活化状态的有效指示。进行了基于FACS的T细胞活化测定以确定例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(例如ITAB1002)在T细胞激活中的能力。
按实施例2所述的方法制备人PBMC，并重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基(Gibco)。SW480细胞用0.25％Trypsin-EDTA(Gibco)消化，重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基。将50μL/孔的细胞混合物以10,000个SW480细胞/孔和100,000个PBMC/孔的最终密度添加至96孔板的每孔。用RPMI-1640培养基将ITAB1002或OKT3(Sigma)稀释至不同浓度，并将50μL的稀释的ITAB1002或OKT3添加至每孔。还设置不含SW480细胞的对照孔(PBMC+ITAB1002)。所有样品于37℃温育24小时。之后，弃去上清，将细胞重悬于50μL FACS缓冲液，将抗体CD4抗体(RFT-4g)缀合物(Invitrogen)、CD8抗体(3B5)RPE缀合物(Invitrogen)和FITC Mouse Anti-Human CD69(BD PharmingenTM)添加至重悬细胞，并允许于室温温育30分钟。加入150μL FACS缓冲液，并使用C6Cytometer(BDBIOSCIENCE)分析样品。检测结果示于图6A、图6B。
如图6A和图6B中所示，在存在SW480细胞时，EpCAM×CD3Fab融合蛋白以剂量依赖性方式上调CD4+和CD8+T细胞群体中的CD69表达(在CD4+T细胞中EC50＝149.6ng/mL；和在CD8+T细胞中EC50＝68.78ng/mL)。在不存在SW480细胞时，EpCAM×CD3Fab融合蛋白未显著上调T细胞的CD69表达，另一方面，OKT3上调CD4+和CD8+T细胞群体中的CD69表达。
此外，Ki-67是细胞表面上细胞增殖的指示。CD4+Ki-67+亚型在CD4+细胞中的百分比、和CD8+Ki-67+亚型在CD8+细胞中的百分比可作为T细胞的增殖状态的有效指示。进行了基于FACS的T细胞增殖测定以确定例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(例如ITAB1002)在T细胞增殖中的能力。
按实施例2所述的方法制备人PBMC，并重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基(Gibco)。SW480细胞用0.25％Trypsin-EDTA(Gibco)消化，并重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基。将细胞混合物以20,000个SW480细胞/孔和300,000个PBMC/孔的最终密度添加至96孔板的每孔。用含10％FBS的RPMI-1640培养基将ITAB1002稀释至不同浓度，并添加至细胞。将仅含PBMC和ITAB1002的孔(PBMC+ITAB1002)、仅含PBMC和SW480的孔(PBMC+SW480)和仅含PBMC的孔设置为对照。于37℃进行72小时温育。之后，弃去上清，并在Fixation/Permeabilization Solution(BD Pharmingen)在4℃固定并透化细胞20分钟，然后重悬于50μL BD Perm/WashTM缓冲液。将细胞用CD4抗体(RFT-4g)缀合物(Invitrogen)、CD8抗体(3B5)RPE缀合物(Invitrogen)、FITC Mouse Anti-Ki-67Set(BD PharmingenTM)在暗处染色30分钟。使用C6Cytometer(BD Biosciences)分析样品。检测结果示于图6C和图6D。
如图6C和图6D所示，在存在SW480细胞时，EpCAM×CD3Fab融合蛋白以剂量依赖性方式上调CD4+和CD8+T细胞群体中的Ki-67表达。在不存在SW480细胞时，EpCAM×CD3Fab融合蛋白未显著上调T细胞的Ki-67表达。
上述结果证明，EpCAM×CD3Fab融合蛋白对T细胞的活化是特异性的并且依赖于其肿瘤抗原靶物。
实施例4：EpCAM×CD3介导的针对肿瘤细胞的PBMC细胞毒性(细胞毒性试验)
按实施例2所述的方法制备人和食蟹猴PBMC，并重悬于含10％FBS(Gibco)RPMI-1640培养基(Gibco)。
SW480细胞(靶细胞)用0.25％Trypsin-EDTA(Gibco)消化，并重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基。将50μL/孔的细胞混合物以10,000个SW480细胞/孔和100,000个PBMC/孔的最终密度添加至96孔板的每孔。根据试验设计将例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(即ITAB1002)以不同浓度添加至细胞。将无药物的孔(PBMC+靶细胞)、仅含靶细胞的孔、仅含PBMC的孔和仅含培养基的孔设置为对照。于37℃，5％CO2进行约18小时培养，进行CYTOTOXNon-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega)以测量乳酸脱氢酶(LDH)释放，并使用酶标仪(Molecular device,Versa Max)测量OD490。EpCAM×CD3Fab融合蛋白介导的细胞毒性使用下式计算：
死亡率＝(OD样品孔-OD无药物对照孔)/(OD具有最大裂解的靶细胞对照孔-OD具有自发释放的靶细胞对照孔)×100％
采用GraphPad Prism 6.0软件分析数据，以死亡率为纵坐标，药物浓度为横坐标。使用4参数逻辑模型拟合曲线以确定EC50。测定结果示于图7。ITB1002介导人PBMC细胞毒性针对SW480细胞的EC50为41.4ng/mL。ITB1002介导的食蟹猴PBMC细胞毒性针对SW480细胞的EC50为35.5ng/mL。
如图7所示，EpCAM×CD3Fab融合蛋白能够介导食蟹猴PBMC或人PBMC杀伤肿瘤细胞，如肿瘤细胞SW480。对于人和食蟹猴PBMC，针对肿瘤细胞的细胞毒性是可比较的。
实施例5：EpCAM×CD3介导的针对肿瘤细胞的人PBMC细胞毒性(细胞毒性试验)
按实施例2所述的方法制备人PBMC，并重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基(Gibco)。肿瘤细胞(靶细胞)用0.25％Trypsin-EDTA(Gibco)消化，并重悬于含10％FBS的RPMI-1640培养基。将50μL/孔的细胞混合物以10,000个肿瘤细胞/孔和100,000个PBMC/孔的最终密度添加至96孔板的每孔。根据试验设计将例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(即ITAB1002)以不同浓度添加至细胞。将无药物的孔(PBMC+靶细胞)、仅含靶细胞的孔、仅含PBMC的孔和仅含培养基的孔设置为对照。于37℃，5％CO2进行约18小时温育(对于H1975和N87细胞为48小时)。进行CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega)以测量LDH释放，并使用酶标仪(Molecular device，Versa Max)测量OD490。EpCAM×CD3Fab融合蛋白介导的细胞毒性可使用下式计算：
死亡率＝(OD样品孔-OD无药物对照孔)/(OD具有最大裂解的靶细胞对照孔-OD具有自发释放的靶细胞对照孔)×100％
采用GraphPad Prism 6.0软件分析数据，以死亡率为纵坐标，药物浓度为横坐标，按4参数逻辑模型拟合曲线以确定EC50。测定结果示于表2和图8。
表2.EpCAM×CD3Fab融合蛋白介导的针对肿瘤细胞的人PBMC细胞毒性的EC50值
实施例6：EpCAM×CD3Fab融合蛋白在免疫缺陷小鼠中杀伤皮下人结肠肿瘤异种移植物中的功效测定
为了检查例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(即ITAB1002)对人结肠肿瘤异种移植物的生长抑制作用，在用SW480肿瘤细胞移植的免疫缺陷小鼠上进行体内药物功效测定。
雌性免疫缺陷小鼠NOD SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl)购自上海灵畅生物科技有限公司，饲养于SPF级别的动物设施中。
体外培养和收集人结肠癌SW480细胞，用冰上预冷的无血清L-15培养基(Gibco)重悬，冰上放置备用。收集健康人捐献的白细胞浓缩物，通过密度梯度离心法(Ficoll-Paque,GE Healthcare)离心以获得PBMC，用冰上预冷的培养基RPMI-1640(Gibco)重悬，冰上放置备用。将肿瘤细胞和人PBMC按等体积混合，皮下接种入NOD SCID小鼠(每只动物约5.0×106个SW480细胞和5.0×106人PBMC)。
细胞接种小鼠1小时后，进行随机分组施用，将动物分为5组，每组6只动物，分别为媒介对照组、2.5μg/kg ITAB1002治疗组、25μg/kg ITAB1002治疗组、250μg/kg ITAB1002治疗组、西妥昔单抗(Cetuximab)30mg/kg对照组。接种分组当天定义为D0。待测试药物ITAB1002用媒介(0.05％Tween-80/PBS缓冲液)稀释至所需浓度，分别按2.5μg/kg、25μg/kg和250μg/kg剂量静脉施用于动物尾部，施用体积为0.1mL/10g体重，每天施用一次，连续施用5天(D0到D4)。媒介对照组中动物给予等体积的媒介。参照药物西妥昔单抗(Cetuximab)(Merck Serono)用媒介稀释至所需浓度，并以30mg/kg的剂量静脉施用于动物尾部，施用体积为0.1mL/10g体重，每周施用2次，连续3周。
同时，设置未用人PBMC进行混合接种的对照治疗组，NOD SCID小鼠皮下接种约5.0×106个SW480肿瘤细胞，接种1小时后，进行随机分组，分别以不同剂量的ITAB1002静脉施用于动物尾部。
每周检查动物体重和肿瘤大小。根据公式肿瘤体积(mm3)＝长径(mm)×宽径(mm)×宽径(mm)×0.5，计算肿瘤体积。用肿瘤生长抑制率(TGI％)评价药物治疗效果，TGI％＝[1-(avTi-avT0)/(avCi-avC0)]×100，其中avTi-avT0为治疗组在第i天时的平均肿瘤体积减去第0天时的平均肿瘤体积，avCi-avC0为媒介对照组在第i天时的平均肿瘤体积减去第0天时的平均肿瘤体积。各组动物肿瘤体积的检测结果示于图9A，实验终点时，从小鼠中分离的SW480肿瘤照片示于图9B。
如图9A和图9B中所示，在媒介对照组中，SW480肿瘤细胞和人PBMC混合接种，肿瘤细胞生长正常，接种后第56天平均肿瘤体积达到1414.06mm3。ITAB1002施用以剂量依赖性方式有效抑制SW480肿瘤的体内生长。在2.5μg/kg、25μg/kg和250μg/kg ITAB1002治疗组中第56天TGI％分别为46.93％、89.80％和99.35％。30mg/kg西妥昔单抗(Cetuximab)治疗组中第56天TGI％为-16.97％，表面未能抑制SW480肿瘤的体内生长。相比之下，未用人PBMC进行混合接种的治疗组肿瘤细胞生长正常，均未显示肿瘤衰退的迹象(数据未显示)。因此，例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白针对小鼠中SW480异种移植物的细胞毒性依赖于人PBMC。
结果指示，EpCAM×CD3Fab融合蛋白能重导向免疫细胞杀伤肿瘤细胞，并以剂量依赖性方式显著地抑制肿瘤体内生长。
实施例7：EpCAM×CD3Fab融合蛋白在免疫重建小鼠模型中杀伤皮下人结肠肿瘤异种移植物中的功效测定
为了检查例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(即ITAB1002)对人结肠肿瘤异种移植物的生长的抑制作用，在具有用人淋巴细胞重建的免疫系统并用SW480肿瘤细胞移植的免疫缺陷小鼠上进行了体内药物功效测定。
雌性免疫缺陷小鼠NOG(NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级别的动物设施中。
当NOG小鼠体重达到20g时开始实验。小鼠先用白消安(busulfan,Sigma)处理清除骨髓细胞。次日，收集体外培养的人结肠癌SW480细胞，用冰上预冷的无血清L-15培养基(Gibco)彻底混和及重悬，皮下接种NOG小鼠(每只动物接种约2.5×106个肿瘤细胞)，肿瘤细胞接种当天定义为D0；2周后，收集健康人捐献的白细胞浓缩液，通过密度梯度离心法(Ficoll-Paque,GE Healthcare)离心以获得PBMC，用冰上预冷的培养基RPMI-1640(Gibco)重悬混匀，皮下接种入NOG小鼠(每只动物接种约3.0×106个肿瘤细胞)；当肿瘤体积生长到150-250mm3，进行随机分组并施用药物，40只动物分为5组(每组8只动物)，分别为模型组、2.5μg/kg ITAB1002治疗组、25μg/kg ITAB1002治疗组、250μg/kg ITAB1002治疗组、30mg/kg西妥昔单抗(Cetuximab)对照组。
待测药物ITAB1002用无菌过滤的媒介(PBS+0.05％Tween-80)稀释至不同浓度，分别按2.5μg/kg、25μg/kg和250μg/kg剂量腹膜内施用，施用体积为0.1mL/10g体重，每天施用一次，连续25天。参照药物西妥昔单抗(Cetuximab)(Merck Serono)用无菌过滤的媒介(PBS+0.05％Tween-80)稀释至所需浓度，按剂量30mg/kg腹膜内施用，每周施用2次，连续25天。模型组中的动物给予等体积的媒介。
每周检查动物体重和肿瘤大小。根据公式肿瘤体积(mm3)＝长径(mm)×宽径(mm)×宽径(mm)×0.5，计算肿瘤体积。用肿瘤生长抑制率(TGI％)评价药物治疗效果，TGI％＝[1-(avTi-avT0)/(avCi-avC0)]×100；其中avTi-avT0为治疗组在第i天时的平均肿瘤体积减去分组起始时的平均肿瘤体积，avCi-avC0为模型组在第i天时的平均肿瘤体积减去分组起始时的平均肿瘤体积。实验结束时，收集抗凝全血，用PE-CyTM5Mouse Anti-Human CD3(BDPharmingen)进行染色，裂解红细胞，用FACS分析血液样品中人CD3+T细胞比例。图10A显示肿瘤体积评估结果。图10B显示实验终点时从小鼠中分离的SW480肿瘤的照片。
图10A和图10B显示了ITAB1002对接种在用人PBMC进行免疫重建的NOG小鼠皮下SW480移植瘤的生长抑制作用。结果显示，在模型组中，SW480肿瘤细胞接种到用人PBMC进行免疫重建的NOG小鼠皮下，肿瘤细胞生长正常，接种后46天平均肿瘤体积达到738.78mm3。ITAB1002施用能有效抑制SW480肿瘤的体内生长，并导致肿瘤消退。在2.5μg/kgITAB1002治疗组中，第40天TGI％为13.29％；在25μg/kg ITAB1002治疗组中，第46天TGI％为68.55％。在250μg/kg ITAB1002治疗组中，第46天TGI％为131.65％。在30mg/kg的西妥昔单抗(Cetuximab)治疗组中，西妥昔单抗未能抑制SW480肿瘤的体内生长，且第46天TGI％为8.91％。如图10C中所示，CD3+人T细胞占全部血液白细胞的平均比例为26.84％，指示人T细胞免疫系统在NOG小鼠中成功重建。
因此，在白消安清除NOG小鼠骨髓，用人PBMC重建免疫系统后，施用EpCAM×CD3Fab融合蛋白可有效抑制人结肠癌细胞SW480在小鼠体内的生长，指示EpCAM×CD3Fab融合蛋白能介导免疫细胞体内杀伤肿瘤细胞，并以剂量依赖性方式显著地抑制肿瘤生长。
实施例8：EpCAM×CD3Fab融合蛋白在免疫重建小鼠模型中杀伤皮下人肺肿瘤异种移植物中的功效测定
为了检查例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(即ITAB1002)对人肺肿瘤异种移植物的生长的抑制作用，在具有用人PBMC重建的免疫系统并用人肺癌肿瘤细胞(NCI-H1975)移植的免疫缺陷小鼠上进行了体内药物功效测定。
雌性免疫缺陷小鼠NOG(NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级别的动物设施中。
当NOG小鼠体重达到20g时开始实验。小鼠白消安(busulfan，Sigma)处理清除骨髓细胞。次日，收集体外培养的人肺腺癌NCI-H1975细胞，用冰上预冷的无血清L-15培养基(Gibco)重悬混匀，皮下接种NOG小鼠(每只动物接种约2.5×106个肿瘤细胞)，肿瘤细胞接种当天定义为D0。2天后，收集健康人捐献的白细胞浓缩液，通过密度梯度离心法(Ficoll-Paque,GE Healthcare)离心以获得PBMC，用冰上预冷的培养基RPMI-1640(Gibco)重悬混匀，皮下接种入NOG小鼠(每只动物接种约3.0×106个PBMC细胞，对照组中的动物除外)。当肿瘤体积达到100-150mm3，18只小鼠随机分为3组并施用药物，包括对照组(接种肿瘤细胞，n＝6)、模型组(接种肿瘤细胞和PBMC，n＝5)和250μg/kg ITAB1002治疗组(接种肿瘤细胞和PBMC，n＝7)。
待测药物ITAB1002用无菌过滤的媒介(0.05％Tween-80/PBS缓冲液)稀释至所需浓度，按250μg/kg剂量腹膜内施用，施用体积为0.1mL/10g体重，每天施用一次，连续24天。对照组和模型组给予等体积的媒介。每周检查动物体重和肿瘤大小。
图11显示了ITAB1002对接种在用人PBMC进行免疫重建的免疫缺陷小鼠皮下NCI-H1975移植瘤的生长抑制作用。对照组和模型组动物肿瘤细胞生长正常，接种后28天平均肿瘤体积分别为1382.63mm3、1432.15mm3；250μg/kg ITAB1002治疗组能完全抑制SW480肿瘤的生长，并导致肿瘤消退，第34天的平均肿瘤体积为7.77mm3。
因此，施用例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白可以有效抑制人肺腺癌细胞NCI-H1975在用人PBMC进行免疫重建的NOG小鼠体内的生长，指示EpCAM×CD3Fab融合蛋白能介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞，显著地抑制体内肿瘤生长。
实施例9：EpCAM×CD3Fab融合蛋白在食蟹猴中诱导T细胞再分布、细胞因子释放和药代动力学
食蟹猴(等级：普通级)，年龄：3-5岁，体重3.0-5.0kg，16只食蟹猴分为四组进行例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(例如ITAB1002)施用，分别为0.5μg/kg剂量组(n＝3)、5μg/kg剂量组(n＝4)、15μg/kg剂量组(n＝6)和50μg/kg剂量组(n＝3)。
待测药物ITAB1002用媒介(0.5％猴血清/PBS缓冲液)稀释至不同浓度，施用体积为2.0mL/kg体重，施用剂量分别为0.5μg/kg、5μg/kg、15μg/kg、50μg/kg，前肢静脉内输注1小时，单次施用。每天观察动物体征、行为、精神状态、粪便等情况。
全血采集：使用EDTA-K2涂覆的抗凝血采集管(BD Bioscience)在开始输注前和开始输注测试药物后不同的时间点分别收集血液样品0.3mL；采集的抗凝血分两部分，一部分血液100μL用血细胞自动计数仪(Siemens,2120)测定淋巴细胞亚类；另一部分血液200μL进行CD4和CD8抗原(APC Mouse Anti-Human CD4and PE MouseAnti-Human CD8,BD PHARMINGENTM)染色，使用FACS(Beckman Coulter,Cytomics FC 500)分析CD4+和CD8+T细胞亚群。
血清采集：同时使用非抗凝管，在开始输注前和开始输注测试药物后不同的时间点分别收集血液样品1.2mL，待血液凝固后离心收集血清，-80℃保存，用Non-humanPrimate Th1/Th2Cytokine Kit(BD PharmingenTM)检测血清中IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF和IFN-γ细胞因子的分泌，测定血清中药物浓度(酶联免疫吸附法)，并用PK Solver2.0软件计算药物代谢动力学参数。
试验期间，各组猴未见死亡或濒死。各组猴自主活动正常、精神状况良好、皮肤被毛清洁，注射部位未见红肿、溃烂等反应，亦未见其它明显异常症状。EpCAM×CD3Fab融合蛋白在食蟹猴中显示良好的安全性和耐受性。
图12A为不同剂量的EpCAM×CD3Fab融合蛋白单次静脉输注施用后，食蟹猴血液中CD4+T细胞数量，随时间的变化曲线(横坐标中H：小时，D：天)。施用后，动物血液中CD4+T细胞数量减少，施用后约8小时降至最低值，然后开始逐步恢复。
图12B为不同剂量的EpCAM×CD3Fab融合蛋白单次静脉输注施用后，食蟹猴血液中CD8+T细胞数量，随时间的变化曲线(横坐标中H：小时，D：天)。施用后，动物血液中CD8+T细胞数量减少，施用后约8小时降至最低值，然后开始逐步恢复。
图13A-13F为不同剂量的EpCAM×CD3Fab融合蛋白单次静脉输注施用后，食蟹猴血清中IL-2(图13A)、IL-4(图13B)、IL-5(图13C)、IL-6(图13D)、TNF(图13E)和IFN-γ(图13F)的浓度随时间变化。结果显示，EpCAM×CD3Fab融合蛋白单次静脉输注施用后，食蟹猴血清中的IL-6、IL-2、TNF、IFN-γ的浓度有不同程度地升高，达到峰浓度后回复到基础水平，并呈现剂量依赖关系；IL-4和IL-5的血清浓度无显著变化。
图14显示了不同剂量的EpCAM×CD3Fab融合蛋白单次静脉输注施用后，食蟹猴血清中的药物浓度随时间变化曲线。
结果显示，在三个剂量组中(5μg/kg，15μg/kg，50μg/kg)，EpCAM×CD3Fab融合蛋白单次静脉输注施用1小时后，血清中药物浓度达到峰值，并逐步下降。EpCAM×CD3Fab融合蛋白在食蟹猴体显示出延长的体内半衰期。
EpCAM×CD3融合蛋白的具体药代动力学参数示于表3。
表3.例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白在食蟹猴中体内药代动力学参数(均值±SD)
实施例10：ITAB1002和ITAB1012介导的针对肿瘤细胞的PBMC细胞毒性的比较
ITAB1012是EpCAM×CD3Fab融合蛋白，其包含具有与ITAB1002的EpCAM scFv中的HVR不同的HVR的EpCAM scFv。ITAB1012的瞬时表达和纯化如实施例1中所描述。ITAB1012的重链具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列，并且由SEQ ID NO:37的核酸序列编码。ITAB1012的轻链具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列，并且由SEQ ID NO:38的核酸序列编码。EpCAM scFv片段的HVR在下列的序列中加下划线表示。ITAB1012的EpCAM scFv已在美国专利号8,846,042中描述。
SEQ ID NO:35(ITAB1012重链)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKFYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARVGGAWELGYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSYYGVHWYQQLPGTAPKLLIYSDTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQS YDSSLSGRVFGGGTKLTVLGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCPPCS
SEQ ID NO:36(ITAB1012轻链)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKFYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDMAVYYCARVGGAWELGYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGAQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGSYYGVHWYQQLPGTAPKLLIYSDTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQS YDSSLSGRVFGGGTKLTVLGGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECPPCS
SEQ ID NO:37(编码ITAB1012重链的核酸)
gaggtgcagctggtggagtcagggggaggcttggtccagcctgggggatcactgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtaattattggatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaattctatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacatggctgtctattactgtgcgagagtggggggggcgtgggagctaggctactggggccagggaaccctggtcactgtctcggccggtggcggtggcagcggcggtggtgggtccggtggcggcggatctggcgcgcagtctgtactgactcaaccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcgggtcttattatggtgtgcactggtaccagcagcttccaggaacagcccccaaactcctcatctattctgacactaatcgaccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcggcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcgtatgacagcagcctgagtggccgggtgttcggcggagggaccaagctgacagtactaggtggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttaacacctacgccatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtcgcacgcataagaagtaaatataataattatgcaacatattatgccgattcagtgaaagaccggttcaccatctccagagacgattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgtgagacatgggaacttcggtaatagctacgtttcctggtttgcttactggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcagctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtccaccgtgctcatga
SEQ ID NO:38(编码ITAB1012轻链)
gaggtgcagctggtggagtcagggggaggcttggtccagcctgggggatcactgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtaattattggatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaattctatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacatggctgtctattactgtgcgagagtggggggggcgtgggagctaggctactggggccagggaaccctggtcactgtctcggccggtggcggtggcagcggcggtggtgggtccggtggcggcggatctggcgcgcagtctgtactgactcaaccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcgggtcttattatggtgtgcactggtaccagcagcttccaggaacagcccccaaactcctcatctattctgacactaatcgaccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcggcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcgtatgacagcagcctgagtggccgggtgttcggcggagggaccaagctgacagtactaggtggccaggctgtggtgactcaggagccctcactgactgtgtccccaggagggacagtcactctcacctgtcgctcatccactggggctgttacaactagtaactatgccaactgggtccagcagaaacctggacaagcacccaggggtctgattggtggtaccaacaagcgagctccaggtacccctgcccggttctcaggctccctccttgggggcaaagctgccctgacactgtcaggtgtgcagcctgaggacgaggctgagtattactgcgctctatggtacagcaacctctgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtccta ggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaa tgtccaccgtgctcatga
如实施例5中所述，使用人PBMC在细胞毒性测定中测试ITAB1002和ITAB1012。结果示于图15中。ITAB1002介导的人PBMC针对SW480细胞的细胞毒性的EC50为约3.54ng/mL。相比之下，ITAB1012介导的人PBMC针对SW480细胞的细胞毒性的EC50为约223.3ng/mL。因此，与ITAB1012相比，ITAB1002表现出显著更高的介导人PBMC针对肿瘤细胞的细胞毒性的活性。
另外，采用实施例2描述的方法检测例示性EpCAM×CD3Fab融合蛋白(即，ITAB1002和ITAB1012)的抗EpCAM和抗CD3结构域与人抗原的结合亲和力。如表4所示，ITAB1002表现出与EpCAM更强的结合亲和力，而与ITAB1012相比，其与CD3的结合亲和力更弱。
表4.体外结合亲和力(KD)
实施例11：在类固醇存在下，EpCAM×CD3Fab融合蛋白介导的人PBMC针对肿瘤细胞的细胞毒性
进行体外探索性测定以评估类固醇预处理对ITAB1002诱导的人T细胞的肿瘤细胞杀伤活性和细胞因子释放的影响。
如实施例5中所述的方法进行细胞毒性测定。从健康供体分离PBMC并与地塞米松(DXM)在3μM的浓度下温育1小时，然后加入96孔板的孔中，每孔终密度为30,000个SW480细胞和300,000个PBMC。将混合细胞在37℃，5％CO2下温育约18小时，DXM最终浓度为0.15μM。通过乳酸脱氢酶(LDH)测定法测量细胞杀伤并计算。在相同的测定中，通过人IL-6ELISA试剂盒(BD Biosciences)分析细胞因子(即IL-6)释放。
图16显示了地塞米松(DXM)对ITAB1002介导的SW480细胞杀伤活性的影响。与单独的ITAB1002相比，在地塞米松存在下，ITAB1002显示相当的体外针对SW480细胞的杀伤活性。
图17显示了细胞因子释放测定的结果。IL-6由ITAB1002诱导的活化T细胞释放。然而，在地塞米松的存在下，IL-6释放几乎完全被抑制，这表明DXM治疗可为接受ITAB1002的患者中控制细胞因子释放综合征(CRS)的有效预先治疗策略。
实施例12：EpCAM×CD3Fab融合蛋白在食蟹猴中的临床前研究
进行了探索性研究以评估地塞米松预处理对减轻接受ITAB1002治疗的食蟹猴的潜在毒性的影响。在第一周期间，每周两次通过静脉内(IV)输注施用0.5μg/kg ITAB1002(第1天和第4天)治疗6只猴子(ITAB1002+DXM)。在第二周期间，每周两次(第8天和第11天)通过IV输注1.0μg/kg ITAB1002治疗动物。在第3周期间，每周两次(第15天和第18天)通过IV输注2.0μg/kg ITAB1002治疗动物。在第4周和第5周期间，每周两次(第22、25、29和32天)通过IV输注4.0μg/kg ITAB1002治疗动物。在每个剂量水平的第一次输注之前约1小时，通过静脉内注射(IV)给每只动物施用1mg/kg剂量的地塞米松。在第5周，地塞米松的剂量增加至2mg/kg。在没有DXM预处理的组中(n＝10)，在没有任何DXM预处理的情况下，每周两次对每只猴子通过静脉内输注施用2.0μg/kg ITAB1002。在不同时间点收集血液样品并分析血清化学参数。通过人IL-6ELISA试剂盒(BD Biosciences)分析血清IL-6水平。
与没有DXM预处理的治疗组相比，在ITAB1002之前用DXM预处理显著降低了血清ALT(图18A-18B)、Tbil(图19A-19B)和ALP水平(图20A-20B)，以及抑制了IL-6释放(图21A-21B)。这些结果证明，用ITAB1002治疗的猴子中IL-6释放的早期诱导和肝脏中的副作用可通过DXM预处理得到改善。
实施例13：ITAB1002在人类癌症患者中的临床测试
在人类癌症患者的临床试验中评估ITAB1002的安全性和功效。该试验的目的是评估ITAB1002在患有局部晚期或转移性实体瘤的成人受试者中的安全性，耐受性，药代动力学，免疫原性和抗肿瘤活性，对于这些受试者，标准疗法或不存在，或已被证明是无效或非耐受的。通过剂量递增评估0.3、0.6、1.2、2.4和3.6μg/kg的五个剂量水平。常规的3+3设计(每剂量组3名患者，可能将额外3名患者添加到同一组中以进一步评估毒性)用于剂量递增和MTD测定。招募5组，每组约6名患者。
所有患者在第一周期间通过静脉内(IV)输注两次(第1天和第4天)接受0.3μg/kgITAB1002的顺应剂量。在接下来的三周内，5组中的患者每周两次通过静脉输注接受ITAB1002，剂量分别为：0.3μg/kg，0.6μg/kg，1.2μg/kg，2.4μg/kg和3.6μg/kg。在第一次顺应剂量的ITAB1002和第一次爬坡剂量(0.3μg/kg至3.6μg/kg)之前1小时给予20mg剂量的地塞米松。根据临床评估，在随后的ITAB1002剂量之前给予地塞米松20mg或10mg。下表4显示了该研究中五组的施用方案。
表4.人临床试验的施用方案
*ITAB1002的剂量单位为μg/kg。
本发明中提及的所有参考文献均通过引用并入本文，如同这些参考文献中的每一篇已通过引用单独并入。尽管描述涉及特定实施例，但是本领域技术人员将清楚，可以通过改变这些具体细节来实践本发明。因此，本发明不应被解释为限于这里阐述的实施例。
序列表
<110> 健能隆医药技术（上海）有限公司(GENERON (SHANGHAI) CORPORATION LTD.)
<120> 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途
<130> 720622000841
<140> 尚未分配
<141> 随本申请同时
<150> CN 201610147227.8
<151> 2016-03-15
<160> 47
<170> FastSEQ for Windows 4.0版
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180 185 190
Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr
195 200 205
Val Ala Pro Thr Glu
210
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM HVR-H1
<400> 13
Asn Tyr Trp Met Ser
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM HVR-H2
<400> 14
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM HVR-H3
<400> 15
Val Gly Pro Ser Trp Glu Gln Asp Tyr
1 5
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM HVR-L1
<400> 16
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Gly Val His
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM HVR-L2
<400> 17
Ser Asp Thr Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM HVR-L3
<400> 18
Gln Ser Tyr Asp Lys Gly Phe Gly His Arg Val
1 5 10
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM VH
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Pro Ser Trp Glu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 20
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM VL
<400> 20
Gly Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro
1 5 10 15
Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp
85 90 95
Lys Gly Phe Gly His Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu
<210> 21
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EpCAM scFv
<400> 21
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
130 135 140
Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Asn Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Ser Tyr Asp Lys Gly Phe Gly His Arg Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 22
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAB1002 HC
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Pro Ser Trp Glu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
130 135 140
Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Asn Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Ser Tyr Asp Lys Gly Phe Gly His Arg Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
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290 295 300
Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe
340 345 350
Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
370 375 380
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
405 410 415
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
420 425 430
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
435 440 445
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
450 455 460
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Ser
465 470 475 480
<210> 23
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAB1002 LC
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Pro Ser Trp Glu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
130 135 140
Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Asn Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Ser Tyr Asp Lys Gly Phe Gly His Arg Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro
245 250 255
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser
260 265 270
Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln
275 280 285
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg
290 295 300
Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
305 310 315 320
Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr
325 330 335
Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
340 345 350
Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu
355 360 365
Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val
370 375 380
Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys
385 390 395 400
Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser
405 410 415
Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr
420 425 430
Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His
435 440 445
Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Pro Pro
450 455 460
Cys Ser
465
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 29
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Pro Leu Gly Leu Ala Gly
1 5
<210> 31
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAB1002 HC
<400> 31
gaggtgcagc tggtggagtc agggggaggc ttggtccagc ctgggggatc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aattattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaattctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggctgtct attactgtgc gagagtgggg 300
ccgtcctggg agcaggacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ggccggtggc 360
ggtggcagcg gcggtggtgg gtccggtggc ggcggatctg gcgcgcagtc tgtactgact 420
caaccgccct cagtgtctgg ggccccaggg cagagggtca ccatctcctg cactgggagc 480
agctccaaca tcgggtctta ttatggtgtg cactggtacc agcagcttcc aggaacagcc 540
cccaaactcc tcatctattc tgacactaat cgaccctcag gggtccctga ccgattctct 600
ggctccaagt ctggcacctc ggcctccctg gccatcactg ggctccaggc tgaggatgag 660
gctgattatt actgccagtc gtatgacaag ggcttcgggc accgggtgtt cggcggaggg 720
accaagctga ccgtcctagg gggcgaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcttggta 780
cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt taacacctac 840
gccatgaact gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtcgc acgcataaga 900
agtaaatata ataattatgc aacatattat gccgattcag tgaaagaccg gttcaccatc 960
tccagagacg attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac 1020
acggccgtat attactgtgt gagacatggg aacttcggta atagctacgt ttcctggttt 1080
gcttactggg gccaagggac aatggtcacc gtctcttcag ctagcaccaa gggcccatcc 1140
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 1200
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 1260
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 1320
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 1380
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtcc accgtgctca 1440
tga 1443
<210> 32
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAB1002 LC
<400> 32
gaggtgcagc tggtggagtc agggggaggc ttggtccagc ctgggggatc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aattattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaattctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac acggccgtct attactgtgc gagagtgggg 300
ccgtcctggg agcaggacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ggccggtggc 360
ggtggcagcg gcggtggtgg gtccggtggc ggcggatctg gcgcgcagtc tgtactgact 420
caaccgccct cagtgtctgg ggccccaggg cagagggtca ccatctcctg cactgggagc 480
agctccaaca tcgggtctta ttatggtgtg cactggtacc agcagcttcc aggaacagcc 540
cccaaactcc tcatctattc tgacactaat cgaccctcag gggtccctga ccgattctct 600
ggctccaagt ctggcacctc ggcctccctg gccatcactg ggctccaggc tgaggatgag 660
gctgattatt actgccagtc gtatgacaag ggcttcgggc accgggtgtt cggcggaggg 720
accaagctga ccgtcctagg gggccaggct gtggtgactc aggagccctc actgactgtg 780
tccccaggag ggacagtcac tctcacctgt cgctcaagta ctggggctgt tacaactagt 840
aactatgcca actgggtcca gcagaaacct ggacaagcac ccaggggtct gattggtggt 900
accaacaagc gagctccagg tacccctgcc cggttctcag gctccctcct tgggggcaaa 960
gctgccctga cactgtcagg tgtgcagcct gaggacgagg ctgagtatta ctgcgctcta 1020
tggtacagca acctctgggt gttcggcgga gggaccaagc tgaccgtcct aggccaaccg 1080
aaagcggcgc cctcggtcac tctgttcccg ccctcctctg aggagcttca agccaacaag 1140
gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag 1200
gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg gagaccacca caccctccaa acaaagcaac 1260
aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga 1320
agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca 1380
gaatgtccac cgtgctcatg a 1401
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 33
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 34
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 34
atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa cgactggtgt ccactcc 57
<210> 35
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAB1012 HC
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Gly Ala Trp Glu Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
130 135 140
Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Asn Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
260 265 270
Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
275 280 285
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn
290 295 300
Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe
340 345 350
Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
370 375 380
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
405 410 415
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
420 425 430
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
435 440 445
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
450 455 460
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Cys Ser
465 470 475 480
<210> 36
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAB1012 LC
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Phe Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Gly Ala Trp Glu Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
130 135 140
Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Asn Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro
245 250 255
Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser
260 265 270
Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln
275 280 285
Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg
290 295 300
Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys
305 310 315 320
Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr
325 330 335
Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
340 345 350
Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu
355 360 365
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370 375 380
Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys
385 390 395 400
Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser
405 410 415
Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr
420 425 430
Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His
435 440 445
Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Pro Pro
450 455 460
Cys Ser
465
<210> 37
<211> 1443
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAB1012 HC
<400> 37
gaggtgcagc tggtggagtc agggggaggc ttggtccagc ctgggggatc actgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aattattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaattctat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac atggctgtct attactgtgc gagagtgggg 300
ggggcgtggg agctaggcta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ggccggtggc 360
ggtggcagcg gcggtggtgg gtccggtggc ggcggatctg gcgcgcagtc tgtactgact 420
caaccgccct cagtgtctgg ggccccaggg cagagggtca ccatctcctg cactgggagc 480
agctccaaca tcgggtctta ttatggtgtg cactggtacc agcagcttcc aggaacagcc 540
cccaaactcc tcatctattc tgacactaat cgaccctcag gggtccctga ccgattctct 600
ggctccaagt ctggcacctc ggcctccctg gccatcactg ggctccaggc tgaggatgag 660
gctgattatt actgccagtc gtatgacagc agcctgagtg gccgggtgtt cggcggaggg 720
accaagctga cagtactagg tggcgaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcttggta 780
cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt taacacctac 840
gccatgaact gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggtcgc acgcataaga 900
agtaaatata ataattatgc aacatattat gccgattcag tgaaagaccg gttcaccatc 960
tccagagacg attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac 1020
acggccgtat attactgtgt gagacatggg aacttcggta atagctacgt ttcctggttt 1080
gcttactggg gccaagggac aatggtcacc gtctcttcag ctagcaccaa gggcccatcc 1140
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 1200
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 1260
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 1320
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 1380
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtcc accgtgctca 1440
tga 1443
<210> 38
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ITAB1012 LC
<400> 38
gaggtgcagc tggtggagtc agggggaggc ttggtccagc ctgggggatc actgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aattattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaattctat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaagac atggctgtct attactgtgc gagagtgggg 300
ggggcgtggg agctaggcta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ggccggtggc 360
ggtggcagcg gcggtggtgg gtccggtggc ggcggatctg gcgcgcagtc tgtactgact 420
caaccgccct cagtgtctgg ggccccaggg cagagggtca ccatctcctg cactgggagc 480
agctccaaca tcgggtctta ttatggtgtg cactggtacc agcagcttcc aggaacagcc 540
cccaaactcc tcatctattc tgacactaat cgaccctcag gggtccctga ccgattctct 600
ggctccaagt ctggcacctc ggcctccctg gccatcactg ggctccaggc tgaggatgag 660
gctgattatt actgccagtc gtatgacagc agcctgagtg gccgggtgtt cggcggaggg 720
accaagctga cagtactagg tggccaggct gtggtgactc aggagccctc actgactgtg 780
tccccaggag ggacagtcac tctcacctgt cgctcatcca ctggggctgt tacaactagt 840
aactatgcca actgggtcca gcagaaacct ggacaagcac ccaggggtct gattggtggt 900
accaacaagc gagctccagg tacccctgcc cggttctcag gctccctcct tgggggcaaa 960
gctgccctga cactgtcagg tgtgcagcct gaggacgagg ctgagtatta ctgcgctcta 1020
tggtacagca acctctgggt gttcggcgga gggaccaagc tgaccgtcct aggccaaccg 1080
aaagcggcgc cctcggtcac tctgttcccg ccctcctctg aggagcttca agccaacaag 1140
gccacactgg tgtgtctcat aagtgacttc tacccgggag ccgtgacagt ggcctggaag 1200
gcagatagca gccccgtcaa ggcgggagtg gagaccacca caccctccaa acaaagcaac 1260
aacaagtacg cggccagcag ctatctgagc ctgacgcctg agcagtggaa gtcccacaga 1320
agctacagct gccaggtcac gcatgaaggg agcaccgtgg agaagacagt ggcccctaca 1380
gaatgtccac cgtgctcatg a 1401
<210> 39
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 1VH
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 2VH
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 41
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 3VH
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 42
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 4VH
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 43
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 11VH
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 2VL
<400> 44
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 45
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 3VL
<400> 45
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 46
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 4VL
<400> 46
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 47
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 5VL
<400> 47
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105

Claims (37)

1.一种多特异性Fab融合蛋白在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，并且其中，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg到约250μg/kg的剂量施用。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述结合域是scFv。
3.如权利要求2所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含特异性结合EpCAM的第一scFv和特异性结合EpCAM的第二scFv，其中，所述第一scFv与Fab片段的VH的N端融合，所述第二scFv与Fab片段的VL的N端融合。
4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白通过静脉内施用。
5.如权利要求1-4任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以低频率施用。
6.如权利要求1-5任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白以第一剂量施用于个体第一时间段，并且连续地，所述多特异性Fab融合蛋白以第二剂量施用于个体第二时间段，并且其中所述第二剂量超过所述第一剂量。
7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其中，进一步包括对所述个体施用糖皮质激素。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述糖皮质激素是地塞米松。
9.如权利要求1-8任一项所述的用途，其中，所述个体是人类个体。
10.如权利要求1-9任一项所述的用途，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的N端。
11.如权利要求10所述的用途，其中，所述Fab片段特异性结合CD3ε的氨基酸1-27内的表位。
12.如权利要求11所述的用途，其中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中所述Fab片段的VL包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
13.如权利要求11或权利要求12所述的用途，其中，所述Fab片段的VH包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和39-43，和/或所述Fab片段的VL包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8和44-47。
14.如权利要求11-13任一项所述的用途，其中，所述的Fab片段包含人免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)，所述重链恒定区1(CH1)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。
15.如权利要求11-14任一项所述的用途，其中，所述Fab片段包含人λ轻链恒定区，所述人λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
16.如权利要求11-15任一项所述的用途，其中，所述Fab片段的CH1和CL通过一个或多个二硫键连接。
17.如权利要求16所述的用途，其中，所述Fab片段包含第一多肽和/或第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，所述第二多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
18.如权利要求1-17任一项所述的用途，其中，所述癌症是EpCAM阳性实体癌。
19.如权利要求18所述的用途，其中，所述EpCAM阳性实体癌是癌瘤(carcinoma)或腺癌(adenocarcinoma)。
20.如权利要求1-19任一项所述的用途，其中，所述癌症选自下组：小肠癌，结肠直肠癌，肺癌，宫颈癌，肝癌，胃癌，胰腺癌，皮肤癌，肾癌，膀胱癌，甲状腺癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌，乳腺癌，胆管癌和头颈癌。
21.如权利要求20所述的用途，其中，所述癌症是结肠直肠腺癌。
22.如权利要求20所述的用途，其中，所述癌症是肺腺癌。
23.如权利要求2-22任一项所述的用途，其中，所述scFv的VH包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；和/或其中所述scFv的VL包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
24.如权利要求2-23任一项所述的用途，其中，所述scFv的VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和/或所述scFv的VL包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
25.如权利要求24所述的用途，其中，所述scFv包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
26.如权利要求1-25任一项所述的用途，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；和/或所述多特异性Fab融合蛋白包含第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
27.一种治疗个体中的癌症的方法，其包括对所述个体施用有效量的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含：特异性结合CD3的Fab片段和特异性结合EpCAM的结合域，其中，所述结合域与所述Fab片段的N端融合，并且，所述多特异性Fab融合蛋白以约0.01μg/kg到约250μg/kg的剂量施用。
28.一种抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HVR-H1，(2)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HVR-H2，和(3)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-H3；所述轻链可变区包含：(1)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L1，(2)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L2，和(3)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-L3。
如权利要求28所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变结构域序列包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和/或所述轻链可变结构域序列包含VL，所述VL包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
29.如权利要求27或权利要求28所述的抗EpCAM抗体，其中，所述抗EpCAM抗体是多特异性抗体。
30.如权利要求27或权利要求28所述的抗EpCAM抗体的抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是单链Fv(scFv)。
31.如权利要求30所述的抗EpCAM抗体的抗原结合片段，其中，所述scFv包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列。
32.一种多特异性Fab融合蛋白，其包含权利要求27-29和30-31中任一项所述的抗EpCAM抗原结合片段。
33.如权利要求32所述的多特异性Fab融合蛋白，其包含特异性结合CD3的Fab片段、抗EpCAM抗原结合片段的第一拷贝、和抗EpCAM抗原结合片段的第二拷贝；其中，抗EpCAM抗原结合片段的第一拷贝与所述Fab片段的VH的N端融合；其中，抗EpCAM抗原结合片段的第二拷贝与所述Fab片段的VL的N端融合。
34.如权利要求33所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述Fab片段的VH包含：包含SEQID NO:1的氨基酸序列的HVR-H1，包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HVR-H2，和包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的HVR-H3；和/或所述Fab片段的VL包含：包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HVR-L1，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HVR-L2，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HVR-L3。
35.如权利要求34所述的多特异性Fab融合蛋白，其中，所述多特异性Fab融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；所述第二多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
36.一种组合物，其包含权利要求27-35中任一项所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或多特异性Fab融合蛋白，和药学上可接受的载体。
37.如权利要求27-35中任一项所述的抗EpCAM抗体或其抗原结合片段或多特异性Fab融合蛋白在制备用于治疗个体中的癌症的药物中的用途。
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