CN109475406A - 抑制带支架的心脏瓣膜或生物假体的狭窄、梗阻或钙化的方法 - Google Patents

Abstract

公开了用于在心脏瓣膜植入有壁血管中之后抑制所述心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化的方法。在一个方面，所述方法包括提供安装在弹性支架上的人工生物心脏瓣膜；用组织固定剂处理所述人工生物心脏瓣膜；用包含一种或多种治疗剂的涂层组合物涂覆所述支架和所述人工生物瓣膜；将所述人工生物瓣膜植入病变的天然瓣膜部位中的血管内；从所述人工生物瓣膜洗脱所述涂层组合物；以及通过阻止干细胞附着到所述人工生物心脏瓣膜上来抑制所述人工生物心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化，所述干细胞通过激活(i)所述循环干细胞中，(ii)覆盖所述人工生物心脏瓣膜组织的内皮细胞内衬中，(iii)或两者中的一氧化氮产生而在所述人工生物心脏瓣膜外部和附近循环。

Description

抑制带支架的心脏瓣膜或生物假体的狭窄、梗阻或钙化的 方法

相关专利申请的交叉引用

本申请是2016年6月27日提交的未决美国申请序列号15/193,208的部分继续申请，该未决美国申请是2014年4月28日提交的美国申请序列号14/263,438的分案，该美国申请是2012年10月22日提交、现已被放弃的美国申请序列号13/656,925的部分继续申请；并且本申请是2015年4月15日提交的未决美国申请序列号14/687,479的部分继续申请，该未决美国申请是2014年4月28日提交的未决美国申请序列号14/263,438的部分继续申请，该未决美国申请是2012年10月22日提交、现已被放弃的美国申请序列号13/656,925的部分继续申请；并且本申请是2016年4月22日提交的未决美国申请序列号15/031,532的部分继续申请，该未决美国申请是要求2014年10月22日提交的国际专利申请序列号PCT/US2014/061745的优先权的371(c)国家阶段申请；这些专利的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及用于抑制心脏瓣膜和心脏瓣膜假体的狭窄、梗阻，或钙化的方法。

背景技术

心脏是中空的肌肉器官，其通过有节奏地收缩而使血液循环通过生物体的身体。在哺乳动物中，心脏具有四个室，所述四个室定位为使得右心房和心室与左心房和心室完全分开。通常，血液从全身静脉流到右心房，然后流到右心室，从右心室经由肺动脉将血液驱动到肺部。血液在从肺部返回后进入左心房，然后流到左心室，从左心室将血液驱动进入全身动脉。

以下四种主要心脏瓣膜在节律性收缩期间防止血液回流：三尖瓣、肺动脉瓣、二尖瓣和主动脉瓣。三尖瓣将右心房和右心室分开，肺动脉瓣将右心房和肺动脉分开，二尖瓣将左心房和左心室分开，并且主动脉瓣将左心室和主动脉分开。通常，具有心脏瓣膜异常的患者表征为患有瓣膜性心脏病。

心脏瓣膜可能发生故障的一种方式是由于狭窄而不能正确打开，从而需要通过手术手段或经皮动脉手段置换瓣膜。置换瓣膜通常是由其他动物如猪或牛的瓣膜制成的生物假体瓣膜。不幸的是，随着时间的推移，置换瓣膜本身易受诸如狭窄、梗阻和钙化等问题的影响。

多年来，心脏钙化被认为是被动退行性现象。在美国专利申请2002/0159983中Rajamannan的工作首次尝试解决病变心脏瓣膜的狭窄和钙化问题，但未成功。Rajamannan公开了一种抑制心脏瓣膜组织的狭窄、梗阻或钙化的方法，所述心脏瓣膜组织具有活的、不固定的心脏瓣膜细胞，所述心脏瓣膜细胞含有编码或激活内皮型一氧化氮合酶(一种具有一氧化氮合酶活性的多肽)的外源核酸。当时认为一氧化氮会在使用戊二醛处理活组织之前停止所述活组织的钙化。Rajamannan使用病毒(例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)以通过注射到心脏瓣膜的活细胞(人或猪心脏瓣膜活细胞-体内或体外)内来引入外源核酸(eNOS)，使得多肽——内皮型一氧化氮合酶——被表达。据认为，细胞会产生过量的一氧化氮合酶，所述过量的一氧化氮合酶会使钙化停止。Rajamannan还公开了向哺乳动物口服施用羟甲基戊二酰辅酶A还原酶活性抑制剂(诸如普伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀或洛伐他汀)和/或使细胞沐于(bathing)含有前述物质的牛血清中。在上述处理后，用戊二醛固定人或猪心脏瓣膜。如上所述，该技术不成功。

需要抑制心脏瓣膜和人工生物心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化形成的新方法和系统。

发明内容

根据本发明的心脏瓣膜和方法解决了传统生物假体瓣膜、手术心脏瓣膜和机械心脏瓣膜的缺点。

在一个方面，用于在心脏瓣膜植入有壁血管中之后抑制所述心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化的方法包括提供包括具有一个或多个尖瓣的组织的生物假体心脏瓣膜，所述生物假体心脏瓣膜安装在弹性支架上以用于置换病变的天然瓣膜；用组织固定剂处理生物假体心脏瓣膜；用包含一种或多种治疗剂的涂层组合物涂覆所述支架、一个或多个尖瓣或两者；将所述生物假体瓣膜植入病变的天然瓣膜部位中的血管内；从所述弹性支架、一个或多个尖瓣或两者洗脱所述涂层组合物；通过阻止干细胞附着到所述人工生物心脏瓣膜上来抑制所述生物假体心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化，所述干细胞通过激活(i)循环干细胞中，(ii)覆盖生物假体心脏瓣膜组织的内皮细胞内衬中，(iii)或两者中的一氧化氮产生而在生物假体心脏瓣膜、弹性支架或两者外部和附近循环。

在本发明的另一方面，该方法干细胞是cKit阳性干细胞SCA1细胞、COP细胞、间充质干细胞和前述干细胞的组合。

在本发明的另一方面，该方法包括用eNOS激活剂处理生物假体心脏瓣膜组织，所述eNOS激活剂选自阿托伐他汀、罗苏伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、L-精氨酸、瓜氨酸、NADPH、乙酰胆碱、组胺、精氨酸加压素、去甲肾上腺素、肾上腺素、缓激肽、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5-羟色胺、凝血酶、胰岛素、糖皮质激素、水杨酸盐类、L-NMMA、L-NAME、硝酸甘油、硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、亚硝酸异戊酯、尼可地尔、四氢生物蝶呤、依泽替米贝(Zetia)，以及前述物质的组合。

在本发明的另一方面，所述涂料组合物包含以下物质中的一种或多种(i)抗增殖剂；(ii)胞外生产抑制剂；(iii)成骨发生抑制剂；以及(iv)前述物质的组合，以抑制源自干细胞的成骨细胞进行骨形成。

在本发明的另一方面，抗增殖剂是紫杉醇、西罗莫司、拜尔莫司(biolimus)、依维莫司以及前述物质的组合。

在本发明的另一方面，胞外生产抑制剂是抗法尼基转移酶抑制剂、抗棕榈酰化抑制剂或两者。

在本发明的另一方面，抗法尼基转移酶抑制剂和/或抗棕榈酰化抑制剂包括洛那法尼(Lonafarnib)，Zarnestra Rl 15777，FTI SCH66336，STI571，FLT-3抑制剂，蛋白酶体抑制剂，MAPK抑制剂，BMS-214662，蛋白质棕榈酰化、法尼基肽棕榈酰化的I型非脂质抑制剂或肉豆蔻酰基肽棕榈酰化的2型抑制剂，棕榈酰化酰基转移酶抑制剂，基于脂质的棕榈酰化抑制剂(包括2-溴棕榈酰基(2BP)在内)、衣霉素、浅蓝菌素(cerulnin)，以及前述物质的组合。

在本发明的另一方面，成骨发生抑制剂包括抗骨质疏松剂，诸如双膦酸盐药物，包括阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸、依替膦酸盐，伊班膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐、地诺单抗(Denosumab)抗体、降钙素柠檬酸钙(Calcitonin-Calcimare)、Miacalcin、Forteo特立帕肽(teriparatide)、雷洛昔芬(raloxfine)(Evista)，以及前述物质的组合。

在本发明的另一方面，将口服剂量的eNOS激活剂施用于患者。口服剂量包括每天10mg至80mg的阿托伐他汀；每天10mg至40mg的辛伐他汀；每天5mg至40mg的罗苏伐他汀；每天10mg至40mg的普伐他汀；每天1mg至4mg的匹伐他汀；每天10mg的依泽替米贝，以及前述各项的组合。

在本发明的另一方面，将口服剂量的抗法尼基转移酶抑制剂、抗棕榈酰化抑制剂或两者施用于患者。剂量可以包括剂量为115mg/m2的洛那法尼(Lonafarnib)，洛那法尼与10mg有效量的依泽替米贝联合使用以115mg/m2至150mg/m2的范围投配。

在本发明的另一方面，通过肌内或皮下注射将有效量的PCSK9抑制剂施用于患者。PCSK9抑制剂的初始剂量可以是0.25mg/kg至1.5mg/kg；0.5mg/kg至1mg/kg。

在本发明的另一方面，有效量的PCSK9抑制剂是每2至4周75-150mg的阿利库单抗(Alirocumab)、每2周或每月140mg的依伏库单抗(Evolocumab)，以及前述单抗的组合。

附图说明

为了更好地理解本发明并显示如何实施本公开内容，现在将参考例如附图，在所述附图中：

图1是从牛或猪获得心脏瓣膜，并用戊二醛固定所述心脏瓣膜以使组织惰性，以及将组织放入带支架的瓣膜或手术置换瓣膜中的商业过程的图示。

图2A是具有覆盖有组织的缝合环的生物假体手术心脏瓣膜的透视图。

图2B是在缝合环上具有Gortex覆盖物的机械心脏瓣膜的俯视图。

图2C是带支架的经皮生物假体心脏瓣膜的透视图。

图3示出了心脏钙化的细胞起源和心脏瓣膜上骨形成的三个阶段。

图4描绘了来自三种兔处理组的植入瓣膜的光学显微镜载玻片，其中左列使用对照饮食；中列使用胆固醇饮食；并且右列使用胆固醇饮食加阿托伐他汀。(所有画面放大20倍，右下角放大100倍)图A.马森三色(Masson Trochrome)染色。图C.增殖细胞核抗原染色。图D.骨桥蛋白染色。

图5描绘了来自所述三种兔处理组的植入瓣膜的半定量RT-PCR；RT-PCR使用来自生物假体瓣膜的关于cKit(731bp)、细胞周期蛋白(151bp)、骨桥蛋白(OP)(102bp)、Sox9(170bp)、Cbfa-1(289bp)和GAPDH(451bp)的总RNA。

图6示出了生物假体瓣膜钙化的机制。

图7是陈述由从兔研究中取出的心包瓣产生的实时聚合酶链反应(RTPCR)结果的表。

具体实施方式

本发明提供了一种用于在固定瓣膜以及随后在有需要的患者中植入瓣膜后抑制带支架的生物假体心脏瓣膜11或具有或不具有缝合环12的手术置换瓣膜10中的瓣膜小叶和瓣膜组织的狭窄、梗阻和/或钙化的方法。本发明还提供了一种用于抑制机械心脏瓣膜14的狭窄、梗阻和/或钙化的方法，所述机械心脏瓣膜14具有围绕机械心脏瓣膜的缝合环18的Gortex内衬16。

如本文所用，术语“狭窄”是指心脏瓣膜变窄，所述心脏瓣膜变窄可阻塞或栓塞来自心脏的血流并引起心脏中的压力和血流回退。瓣膜狭窄可由各种原因引起，包括但不限于由于疾病如风湿热引起的瘢痕化；渐进性钙化；渐进性劳损；等等。这对于带支架的治疗而言不重要，但对于瓣膜而言很重要，这与本专利的其余部分一致。

如本文所用，术语“瓣膜”可以指在节律性收缩期间防止血液回流的四种主要心脏瓣膜中的任何一种。所述四种主要的心脏瓣膜是三尖瓣、肺动脉瓣、二尖瓣和主动脉瓣。三尖瓣将右心房和右心室分开，肺动脉瓣将右心房和肺动脉分开，二尖瓣将左心房和左心室分开，并且主动脉瓣将左心室和主动脉分开。因此，在一个方面，生物假体瓣膜和病变瓣膜可以是主动脉瓣、肺动脉瓣、三尖瓣或二尖瓣。

如本文所用，术语“生物假体瓣膜”是带支架的组织心脏瓣膜，并且可以指用于置换或补充有缺陷、功能障碍或缺失的心脏瓣膜的装置。生物假体瓣膜假体的示例包括但不限于Edwards Sapien 1经导管心脏瓣膜、Edwards Sapien 2经导管心脏瓣膜、EdwardsSapien 3经导管心脏瓣膜、以及Edwards Sapien经导管瓣膜的所有其他变型，包括但不限于Edwards Sapien XT经导管心脏瓣膜、Boston Scientific Lotus Edge经导管心脏瓣膜和Lotus瓣膜的所有变型、Medtronic Core Valve经导管瓣膜和Medtronic Core ValveEvolut R经导管瓣膜、Melody经导管肺动脉瓣疗法及其所有变型。

通常，生物假体瓣膜包括具有一个或多个尖瓣的组织瓣膜，并且所述瓣膜安装在框架或支架上，两者通常都是弹性的。如本文所用，术语“弹性”是指装置能够弯曲、折叠、展开或它们的组合。瓣膜的尖瓣通常由哺乳动物的组织制成，所述哺乳动物为诸如但不限于猪、牛、马、绵羊、山羊、猴子和人。

如本文所用，“手术心脏瓣膜”是从猪或奶牛中收获的仅包括组织和缝合环的心脏瓣膜。手术心脏瓣膜通常是无支架的。手术心脏瓣膜的非限制性示例包括ATS 3F主动脉生物瓣膜假体；Carpentier-Edwards PERIMOUNT Magna Ease主动脉心脏瓣膜；Carpentier-Edwards PERIMOUNT Magna主动脉心脏瓣膜；Carpentier-Edwards PERIMOUNT Magna二尖瓣心脏瓣膜；Carpentier-Edwards PERIMOUNT主动脉心脏瓣膜；Carpentier-EdwardsPERIMOUNT Plus二尖瓣心脏瓣膜；Carpentier-Edwards PERIMOUNT Theon主动脉心脏瓣膜；Carpentier-Edwards PERIMOUNT Theon二尖瓣置换系统；Carpentier-Edwards主动脉猪生物假体瓣膜；Carpentier-Edwards Duraflex低压猪二尖瓣生物假体瓣膜；Carpentier-Edwards Duraflex二尖瓣生物假体瓣膜(猪)；Carpentier-Edwards二尖瓣猪生物假体瓣膜；Carpentier-Edwards S.A.V.主动脉猪生物假体瓣膜；Edwards Prima Plus无支架生物假体瓣膜；Medtronic公司的主动脉根生物假体瓣膜；II带支架生物假体瓣膜；Hancock II生物假体瓣膜；生物假体瓣膜；Mosaic生物假体瓣膜；St.Jude Medical公司的Biocor.TM.Supra、心包膜、Biocor.TM.Stentless、Epic.TM.、Epic Supra.TM.、Toronto无支架猪瓣膜Toronto SPVTrifecta；Sorin Group公司，Mitroflow Aortic PericardialCryolife、Cryolife主动脉Cryolife肺Cryolife-O'Brien无支架主动脉异种移植物Contegra肺动脉瓣导管、使用Linx AC技术、主动脉瓣和二尖瓣的Epic带支架组织瓣膜；使用Guide技术、主动脉瓣和二尖瓣的Trifecta瓣膜。

如本文所用，“机械心脏瓣膜”是通常由生物相容性材料如热解碳制成的心脏瓣膜。机械心脏瓣膜的非限制性示例包括SJM Regent心脏瓣膜，二尖瓣和主动脉位置；以及Starr-Edwards瓣膜，二尖瓣和主动脉瓣；Smeloff Cutler瓣膜，二尖瓣和主动脉瓣；CagedBall瓣膜，二尖瓣和主动脉瓣；倾斜式碟瓣，二尖瓣和主动脉瓣；双叶瓣，二尖瓣和主动脉瓣；Bjork-Shiley瓣膜，二尖瓣和主动脉瓣；Medtronic Hall心脏瓣膜，二尖瓣和主动脉瓣，包括Physio I和Physio II的瓣环成形术环，Duran AnCore环和带，CG Future复合环和带，Profile 3D环，Open Pivot机械心脏瓣膜，Medtroinc Open Pivot主动脉带瓣管道，Simulus可调式瓣膜成形术系统，Simulus柔性瓣膜成形术系统，Simulus半刚性瓣膜成形术系统，Amplatzer装置(包括但不限于开放性卵圆孔、室间隔缺损闭合装置、心房间隔缺损装置、开放性动脉导管)和CryoLife On-X瓣膜(包括但不限于具有Conform-A缝合环的主动脉心脏瓣膜、具有解剖缝合环的主动脉心脏瓣膜、具有标准缝合环的主动脉心脏瓣膜、具有标准缝合环的二尖瓣心脏瓣膜、具有Conform-X缝合环的二尖瓣心脏瓣膜、升主动脉人工瓣膜。

现参考图1，示出了在病变天然瓣膜的手术瓣膜置换对照经皮瓣膜置换中用于生物假体心脏瓣膜的两种类型的材料，即牛心包瓣尖瓣和/或猪主动脉瓣尖瓣。在将组织放入缝合环和/或手术支架之前，生物材料的结构元件和组织变性是称为“固定”的常规的组织制备预处理，所述固定通过使用醛溶液引起组织的交联以使组织无活性或变成惰性，如图1所示。使用各种浓度的戊二醛或甲醛进行组织的“固定”。使用戊二醛或甲醛作为交联剂进行该预处理以改善组织耐久性。

在将(牛心包和/或猪主动脉的)瓣膜小叶用戊二醛或甲醛固定处理并附接到缝合环和/或支架上后，然后通过两种途径中的一种途径将所述瓣膜小叶置于人体中以置换病变的瓣膜。手术途径涉及打开胸腔以置换病变瓣膜。经皮途径涉及将生物假体瓣膜定位在导管上并将导管穿过动脉，直到所述生物假体瓣膜到达病变瓣膜部位，在所述病变瓣膜部位使用本领域技术人员已知的技术用所述生物假体瓣膜置换病变瓣膜。还可以使用经心尖途径，其中使用本领域的技术人员已知的技术将生物假体瓣膜通过心尖部引入病变瓣膜部位。

现在参考图2A至图2C，示出了三种不同类型的心脏瓣膜。图2A描绘了具有三个小叶20、21、22和由组织覆盖的缝合环12的生物假体手术心脏瓣膜10。图2B描绘了具有两个机械小叶23、24的机械心脏瓣膜14。使用开胸手术来通过外科手术放置机械心脏瓣膜。虽然机械心脏瓣膜14不使用组织作为小叶，但是瓣膜结构14、23、24本身以及覆盖机械心脏瓣膜的缝合环18的Gortex内衬16也可能具有钙化的风险。图2C描绘了安装在支架26上的生物假体心脏瓣膜11。带支架的生物假体瓣膜通常穿过动脉经皮放置，并且也可以经心尖放置。

为了理解根据本发明的抑制钙化的方法，重要的是要理解钙化的机制，所述钙化的机制在图3和图6中示出。当瓣膜被放置在心脏中(心脏中的主动脉、肺动脉、三尖瓣或二尖瓣任一位置)时，在植入后几周内，心脏在包括小叶、支架和缝合环在内的整个瓣膜表面区域上产生内皮内衬，和在机械瓣膜的情况下在Gortex上产生内皮内衬。随着时间的推移，暴露于诸如高胆固醇、高血压(高血压病)、糖尿病、吸烟和高水平的C反应蛋白等应激因素导致内皮细胞内衬降低内皮型一氧化氮合酶基因的eNOS功能并减少内皮内衬的一氧化氮产生。较少的一氧化氮产生导致(i)内皮细胞释放Wnt并且(ii)由于一氧化氮产生减少，内皮细胞变得“粘性”。Wnt的释放继而激活循环干细胞中的Wnt级联。因为内皮细胞是“粘性”干细胞，所以cKIT阳性细胞、SCA1、循环成骨前体细胞、间充质循环干细胞和前述细胞的组合附着到瓣膜上已经生长的异常内皮细胞内衬上。上述细胞中Wnt的释放和Wnt级联的激活触发了骨形成的三个阶段，即细胞增殖、软骨特异性蛋白质的胞外基质产生和成骨细胞发生，其中干细胞变成成骨细胞，沉积骨基质(钙和磷酸盐)到软骨支架内，在那里钙和磷酸盐与骨基质结合。该骨基质或钙化物像“壳”一样覆盖人工生物瓣膜，这就是钙化并代表骨形成。

本发明人测试了以下假设：生物假体瓣膜钙化是干细胞介导的动脉粥样硬化过程。针对干细胞标记物测试了假体瓣膜钙化模型。将正常生物假体瓣膜皮下植入兔(n＝10)对照、(n＝10)0.5％胆固醇饮食和(n＝10)0.5％胆固醇+阿托伐他汀中3个月以分析动脉粥样硬化型骨形成。从饲喂胆固醇饮食的兔子中取出的生物假体瓣膜组织表现出严重的动脉粥样硬化，具有对ckit、巨噬细胞和骨桥蛋白表达呈阳性的干细胞岛。对照瓣膜表现出标记物的轻微增加。阿托伐他汀处理过的瓣膜没有干细胞标记物或动脉粥样硬化的迹象(p<0.05)。生物假体瓣膜钙化是间充质ckit介导的动脉粥样硬化型钙化过程，该过程被阿托伐他汀减弱。这些实验数据对于使用生物假体瓣膜的患者的未来治疗具有减缓瓣膜钙化进展的意义。

在美国和欧洲，钙化性主动脉瓣狭窄是手术瓣膜置换的最常见适应症。目前，机械心脏瓣膜与生物假体心脏瓣膜是瓣膜置换的两种选择。瓣膜的选择取决于手术时的患者特征。生物假体心脏瓣膜降低了血栓形成的风险，因此减少了抗凝需要。因此，生物假体心脏瓣膜尽管长期耐久性有限，但对于年龄大于75岁或有长期抗凝禁忌症的患者是首选瓣膜。最近的一项研究表明，人主动脉瓣同种异体移植物中骨蛋白的表达为该疾病过程奠定了基础。据估计，20-30％已植入的生物假体心脏瓣膜将在10年内出现一定程度的血流动力学功能障碍。多年来，瓣膜退行性变的机制被认为是由于被动过程。然而，最近的研究已经证明生物假体瓣膜钙化的风险因素与血管动脉粥样硬化相似。此外，最近的病理学研究已经清楚地表明，在这些钙化生物瓣膜中发生了炎症反应，所述炎症反应包括脂质沉积、炎性细胞浸润和骨基质蛋白表达。这些发现与天然钙化性主动脉瓣疾病中发现的类似组织病理学损伤相似。

为了研究生物假体心脏瓣膜钙化的机制，该研究测试了以下假设：生物假体瓣膜钙化继发于干细胞介导的动脉粥样硬化过程。如果动脉粥样硬化风险因素与生物假体瓣膜退化的发展独立相关，则动脉粥样硬化的实验模型可以提供测试生物假体瓣膜心脏病的发展的方法。

该研究评估了在高胆固醇血症兔模型中手术植入的牛心包瓣膜，以确定类似的动脉粥样硬化病变是否沿着植入瓣膜的表面发生。为了检验在炎症存在下间充质cKit阳性干细胞归巢于瓣膜的假设。最后，该研究试图确定阿托伐他汀是否在实验模型中减弱了这种动脉粥样硬化过程。

如图4中图A1的马森三色染色(Masson Trichrome stain)所示，来自对照动物的植入瓣膜小叶似乎沿着小叶表面具有轻微量的细胞浸润。高倍放大显示，小叶与沿着小叶表面发展的细胞浸润物之间有分界。对照生物假体瓣膜中有少量cKit阳性染色细胞，如图4中的图B1所示；以及少量表达骨桥蛋白的增殖细胞，如图4中的图C1和图D1所示。相比之下，在图4中的图A2、图B2、图C2、图D2所示的来自饲喂胆固醇的兔子的瓣膜组织中，存在如马森三色染色所示的明显细胞炎性浸润物，所述细胞浸润物表达cKit、PCNA和OPN，如左下角的高分辨率视野所示，具有蓝染细胞。最后，如通过半定量视觉分析所测量的，在取出时且在光学显微镜下，使用胆固醇处理使动脉粥样硬化负荷增加了四倍。阿托伐他汀处理的兔中植入的小叶表现出显著减少量的动脉粥样硬化细胞浸润物、增殖、cKit和骨桥蛋白表达，如图4中的图A3、B3、C3、D3所示。免疫组织化学和马森三色染色表明，与胆固醇饲喂动物和对照动物中的小叶相比，用阿托伐他汀处理过的动物的小叶得到了显著改善。形态测定分析显示，与用阿托伐他汀处理过的瓣膜相比动脉粥样硬化负荷增加了4倍，用阿托伐他汀处理过的瓣膜显著减弱了动脉粥样硬化(p<0.05)，对照由于将瓣膜植入兔子体内引起炎症反应而炎症增加了2倍。

图5示出了对照兔子、用胆固醇处理的兔子和用胆固醇以及阿托伐他汀处理的兔子的RNA基因表达。胆固醇饲喂动物的小叶中的Sox9成骨细胞转录因子、细胞周期蛋白和cKit相较于对照有所增加，其中胆固醇组中的细胞周期蛋白和cKit相较于对照显著增加(p<0.05)，其中相较于胆固醇组，阿托伐他汀减弱cKit、细胞周期蛋白和Sox9(p<0.05)。在所有三个不同处理组中，不存在Cbfal表达并且在骨桥蛋白基因表达方面没有差异。图7是来自兔子研究的RTPCR数据。

与对照动物相比，饲喂胆固醇的动物中的血清胆固醇水平显著更高(1846.0±525.3mg/dL对比18.0±7mg/dL，p<0.05)。用阿托伐他汀处理的兔子表现出比仅接受胆固醇饮食的兔子更低的胆固醇水平(824.0±152.lmg/dl，p<0.05)。根据图7，与对照兔子相比，饲喂胆固醇的兔子中hsCRP血清水平增加(13.6±19.7mg/dl对比0.24±0.1mg/dL，p<0.05)，阿托伐他汀降低hsCRP血清水平(7.8±8.7mg/dL，p<0.05)。

最近的流行病学研究已经表明，生物假体瓣膜钙化的风险因素，即男性、吸烟和血清胆固醇升高，与血管性动脉粥样硬化的相关风险因素相似。该数据表明，实验性高胆固醇血症产生了沿着生物假体心包瓣膜组织表面的动脉粥样硬化变化与在主动脉瓣疾病早期阶段中发现的变化类似的生化和形态学证据。

具体地，沿着饲喂高胆固醇饮食的动物的瓣膜表面存在动脉粥样硬化病变，并且该过程用阿托伐他汀减弱。在该模型中，通过免疫组织化学和成骨细胞骨标记物Sox9，高胆固醇血症生物假体瓣膜不仅形成了增生的动脉粥样硬化病变，而且还形成了表达增加水平的骨基质蛋白的病变。在该实验性高胆固醇血症模型中hsCRP水平也增加，表明炎性环境使间充质干细胞归巢到植入的小叶中。在兔皮下模型中，确认了从具有相关动脉粥样硬化的高胆固醇血症兔中取出的生物假体瓣膜组织中具有增加的Sox9表达。

在这些动脉粥样硬化生物假体瓣膜中发现cKit和其他间充质表达提供了这样的机制，通过该机制钙化可以如该机制所示发展。参照图6，示出了生物假体瓣膜钙化的机制。在胆固醇升高、高血压、吸烟、糖尿病和/或异常氧化应激过程的存在下，循环干细胞归巢到正常的生物假体心脏瓣膜中并在细胞炎症的存在下附着于瓣膜小叶。炎症导致循环cKit阳性细胞、任何和所有类型的成骨前体细胞、间充质细胞、sca1阳性细胞附着于心室和主动脉表面，导致瓣膜小叶和/或支架和/或缝合环两侧上均发生钙化。在存在风险因素的情况下，所述风险因素主要是高脂血症，其在内衬于植入的心脏瓣膜周围的新形成的内皮内衬细胞中引起异常的氧化应激和异常的内皮型一氧化氮合酶功能。循环cKit阳性细胞、循环成骨前体细胞、间充质细胞、sca1阳性细胞，沿着植入的瓣膜“粘附”到新形成的内皮内衬。这些不同类型的干细胞具有沿着成骨途径分化以在瓣膜小叶上形成骨，从而导致生物假体瓣膜小叶退化。一旦从围绕植入瓣膜的新形成的内皮内衬细胞分泌出Wnt，就会发生这种分化过程或从一种细胞类型到另一种细胞类型的细胞转化过程。由于干细胞在存在升高脂质的情况下粘附到新形成的内皮内衬上，并且粘附于内皮内衬的干细胞的紧密接近允许所分泌的Wnt与位于“附着的干细胞”的细胞膜上的Lrp5受体结合。一旦Lrp5/Wnt结合，则干细胞分化或转化为骨形成细胞。阻止细胞附着于瓣膜的化合物的示例是使用在动物模型中所测试的阿托伐他汀来减少炎症，以减少附着于瓣膜小叶的干细胞的数量，并减缓钙化的进展。在存在高胆固醇血症的情况下，cKit阳性细胞附着于人工生物瓣膜并通过成骨基因程序开始分化，首先在体内皮下植入物的低压模型中进行Sox9上调，然后在来自手术的离体人移植瓣膜的高压模型中进行Cbfa1上调。其余细胞是天然的肌成纤维细胞分化为成骨细胞表型，如在其他主动脉瓣疾病研究中所涉及的。在该模型中，由于高胆固醇血症的环境诱导炎症，所以间充质干细胞移动并归巢到植入的人工生物瓣膜中。如先前研究所示，这些细胞具有沿着成骨途径分化的潜力。

上述发现在体内实验模型中证明，高胆固醇血症表达cKit阳性细胞、动脉粥样硬化和心包生物假体瓣膜小叶中的成骨基因表达可能是生物假体瓣膜钙化中的关键机制。

为了解决上述瓣膜钙化机制，本发明人已经发明了一种通过以下方式抑制瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化的方法：抑制(i)骨形成的三个阶段，即循环ckit和Scal阳性干细胞、成骨细胞和间充质干细胞在生物假体瓣膜或机械瓣膜外部和附近的区域中的增殖，防止软骨特异性蛋白的胞外基质产生以及成骨发生或骨基质沉积到软骨支架内；以及抑制(ii)上述细胞附着于心脏瓣膜和/或机械心脏瓣膜上的Gortex内衬上。通过激活内皮细胞自身中的一氧化氮来实现上述防止。

为了激活内皮细胞中的一氧化氮，在用戊二醛固定后，将心脏瓣膜小叶用包含一种或多种治疗剂的涂层组合物涂覆，所述涂层组合物粘附于心脏瓣膜小叶、支架和/或机械心脏瓣膜情况下的Gortex。所述涂层组合物可沉积在瓣膜小叶、支架和/或缝合环(生物假体瓣膜固定在所述支架和/或缝合环上)、或者在机械瓣膜的情况下覆盖缝合环的Gortex衬里的两侧上，从而抑制瓣膜假体在植入有需要的患者体内后的狭窄、梗阻或钙化。

可以通过将聚合物和治疗剂溶解或悬浮在溶剂中来制备涂料组合物。可用于制备涂料组合物的合适溶剂包括可使聚合物和治疗剂溶解或悬浮在溶液中的溶剂。合适溶剂的示例包括但不限于四氢呋喃、甲乙酮(MEK)、氯仿、甲苯、丙酮、异辛烷、1,1,1-三氯乙烷、二氯甲烷、异丙醇以及它们的混合物。然而，在许多情况下不需要溶剂。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法将涂料组合物涂覆到瓣膜假体或生物假体的弹性支架部分和缝合环的表面上。将涂料组合物涂覆到瓣膜假体的弹性支架部分表面的合适方法包括但不限于喷涂、涂漆、辊涂、静电沉积、喷墨涂布和分批法(诸如空气悬涂、锅包衣或超声喷雾)，或它们的组合。

涂覆涂料组合物后，可以使涂料组合物固化。如本文所用，“固化”可以指通过施加热、真空和/或化学试剂将任何聚合物材料转化为最终或有用状态的过程，所述热、真空和/或化学试剂的施加诱导物理化学变化。用于固化的适用时间和温度由所涉及的特定聚合物和所用的本领域技术人员已知的特定治疗剂确定。此外，在弹性支架被涂覆后，可以通过本领域已知的灭菌方法对弹性支架进行灭菌(参见例如，《工业和FDA工作人员指南——血管内支架和相关递送系统的非临床工程测试和推荐标签》(Guidance for Industry and FDAStaff--Non-Clinical Engineering Tests and Recommended Labeling forIntravascular Stents and Associated Delivery Systems)http://www.fda.gov/medicaldevices/deviceregulationandguidance/guidancedoc-uments/ucm071863.htm和标题为“Reduced temperature sterilization of stents(支架的降温灭菌)”的美国专利7,998,404)。

涂料组合物可包含一类至四类治疗剂。第一类可以是eNOS激活剂；第二类是抑制细胞增殖的抗增殖剂；第三类抑制细胞外基质产生；并且第四类抑制成骨发生。

为了抑制干细胞附着到“粘性”瓣膜结构上，目标是上调瓣膜结构上新生长的内皮内衬中和循环干细胞中的内皮型一氧化氮，以防止干细胞附着到瓣膜结构。上调一氧化氮产生的药剂(eNOS激活剂)可选自阿托伐他汀、罗苏伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、L-精氨酸、瓜氨酸、NADPH、乙酰胆碱、组胺、精氨酸加压素、去甲肾上腺素、肾上腺素、缓激肽、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5-羟色胺、凝血酶、胰岛素、糖皮质激素、水杨酸盐类，L-NMMA、L-NAME、硝酸甘油、硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、亚硝酸异戊酯、尼可地尔、四氢生物蝶呤，以及前述各项的组合。

另外，可以根据患者的体重，以不同的剂量口服施用上调一氧化氮的药剂和降脂药物。此类药剂包括阿托伐他汀(每天10至80mg，具体取决于患者体内的LDL水平)、罗苏伐他汀(每天5-40mg)、普伐他汀(每天10-40mg)、美伐他汀(每天5-40mg)、氟伐他汀(每天5-40mg)、辛伐他汀(每天5-40mg)、洛伐他汀(每天5-40mg)、依泽替米贝(每天10mg)，以及前述药剂的组合。

PCSK9抑制剂可以通过肌内注射以与患者体重相关的剂量施用于患者。PCSK9抑制剂的初始剂量可以是约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg或约1.5mg/kg，并且初始剂量和第一后续剂量以及其他后续剂量可以在时间上彼此相隔约一周。PCSK9抑制剂及其剂量包括每2至4周75-150mg的阿利库单抗和每2周140mg的依伏库单抗，可通过皮下注射，以双月或每月以及前述的组合方式给药。PCSK9是血浆脂蛋白胆固醇(LDL-C)的调节剂，并且是有效降低冠状动脉疾病风险的药剂。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)蛋白调节低密度脂蛋白(LDL)受体的活性，所述受体定位为沿着内皮和在患者的肝脏中。用单克隆抗体抑制PCSK9导致LDL受体的循环增加和LDL胆固醇(LDL-C)的清除增加。PCSK9在肝脏中高度表达并在前结构域的自催化切割后分泌，所述前结构域保持与催化结构域非共价地缔合。PCSK9的催化结构域与低密度脂蛋白受体(LDLR)的表皮生长因子样重复A(EGF-A)结构域结合。PCSK9的两种功能都是靶向LDLR-PCSK9复合物以进行溶酶体降解和降低LDL-C所必需的，这与功能丧失和功能获得相关的两个结构域中的突变一致。

阿托伐他汀可以10mg至80mg的范围口服给药，辛伐他汀可以10mg至40mg的范围口服给药，罗苏伐他汀可以5mg至40mg的范围口服给药，普伐他汀可以10mg至80mg的范围口服给药，匹伐他汀可以1mg至4mg的范围口服给药。

同样重要的是在涂层组合物中包含抑制成骨形成的三个阶段的治疗剂。选自紫杉醇、西罗莫司、拜尔莫司、依维莫司、他克莫司和前述物质的组合的药剂可包含在涂料组合物中以抑制细胞增殖。

涂料组合物还可包含胞外基质生产抑制剂，诸如抗法尼基转移酶抑制剂(FTI)和抗棕榈酰化抑制剂。此类药剂可包括洛那法尼，Zarnestra Rl 15777，FTI SCH66336，STI571，FLT-3抑制剂，蛋白酶体抑制剂，MAPK抑制剂，BMS-214662，蛋白质棕榈酰化、法尼基肽棕榈酰化的I型非脂质抑制剂或肉豆蔻酰基肽棕榈酰化的2型抑制剂，棕榈酰化酰基转移酶抑制剂，基于脂质的棕榈酰化抑制剂(包括2-溴棕榈酰基(2BP)在内)、衣霉素、浅蓝菌素，以及前述物质的组合。

FTI抑制剂抗棕榈酰化抑制剂也可以口服给药。洛那法尼可以以115mg/m2的剂量与10mg有效量的依泽替米贝联合以115mg/m2至150mg/m2的范围给药。

涂层组合物还可以包含抗骨质疏松剂，例如双膦酸盐药物，包括阿仑膦酸盐(口服5-70mg，具体取决于患者的临床状态)、利塞膦酸盐(每天口服5-150mg，具体取决于患者的临床状态)、唑来膦酸(每年一次15min的5mg静脉输注)、依替膦酸盐(放置瓣膜后一个月内每天20mg/kg)、伊班膦酸盐(每月口服150mg)、帕米膦酸盐(静脉输注一次性剂量60-90)、替鲁膦酸盐(3个月每天一次口服400mg)、地诺单抗抗体(每6个月皮下注射60mg)、降钙素柠檬酸钙(每天口服60mg)，Miacalcin(每天口服60mg)、Forteo特立帕肽(每天口服60mg)、雷洛昔芬(Evista)(每天口服60mg)，以及前述物质的组合。这些药剂将通过抑制植入瓣膜中的骨形成来抑制最终骨形成阶段。

前述治疗骨形成的第三阶段的药剂也可以以与患者体重相对应的剂量向患者口服或肌内注射给药。

实施例I

用涂层组合物涂覆生物假体心脏瓣膜，所述涂层组合物包含eNOS激活剂、阿托伐他汀、抗增殖剂、紫杉醇；胞外生产抑制剂、抗法尼基转移酶抑制剂；以及成骨发生抑制剂、双膦酸盐药物。将人工生物心脏瓣膜植入75岁的女性患者体内。该患者还接受降脂治疗，所述降脂治疗包括每天口服80mg阿托伐他汀和每月皮下注射一次75mg量的PCSK9抑制剂，以将她的LDL胆固醇水平从350mg/ml降低至80mg/ml。回顾她的超声心动图，植入人工生物瓣膜的小叶和支架在25年时段内具有正常的血液动力学，平均梯度为10mmHg，并且主动脉瓣面积为2.0cm2。通过计算机断层扫描和超声波心动描记术诊断出，生物假体瓣膜小叶和支架未显示任何钙化迹象。

尽管已经参考各个方面和实施方案描述了本发明，但是本领域普通技术人员应认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行改变。

Claims (18)

1.一种用于在心脏瓣膜植入有壁血管中之后抑制所述心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化的方法，所述方法包括：

提供包括具有一个或多个尖瓣的组织的生物假体心脏瓣膜，所述生物假体心脏瓣膜安装在弹性支架上以用于置换病变的天然瓣膜；

用组织固定剂处理所述生物假体心脏瓣膜；

用包含一种或多种治疗剂的涂层组合物涂覆所述支架、一个或多个尖瓣或两者；

将所述生物假体瓣膜植入病变的天然瓣膜部位的所述血管内；

从所述弹性支架、一个或多个尖瓣或两者洗脱所述涂层组合物；

通过阻止干细胞附着到所述生物假体心脏瓣膜上来抑制所述生物假体心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化，所述干细胞通过激活(i)所述循环干细胞中，(ii)覆盖所述生物假体心脏瓣膜组织的内皮细胞内衬中，(iii)或两者中的一氧化氮产生而在所述生物假体心脏瓣膜、弹性支架或两者外部和附近循环。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞选自cKit阳性干细胞SCA1细胞、COP细胞、间充质干细胞，以及前述细胞的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括用eNOS激活剂处理所述生物假体心脏瓣膜组织，所述eNOS激活剂选自阿托伐他汀、罗苏伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、L-精氨酸、瓜氨酸、NADPH、乙酰胆碱、组胺、精氨酸加压素、去甲肾上腺素、肾上腺素、缓激肽、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5-羟色胺、凝血酶、胰岛素、糖皮质激素、水杨酸盐类，L-NMMA、L-NAME、硝酸甘油、硝酸异山梨酯、5-单硝酸异山梨酯、亚硝酸异戊酯、尼可地尔、四氢生物蝶呤、依泽替米贝，以及前述各项的组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述涂料组合物包含以下物质中的一种或多种(i)抗增殖剂；(ii)胞外生产抑制剂；(iii)成骨发生抑制剂；以及(iv)前述物质的组合，以抑制源自所述干细胞的成骨细胞中的骨形成。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗增殖剂选自紫杉醇、西罗莫司、拜尔莫司、依维莫司，以及前述物质的组合。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述胞外生产抑制剂选自抗法尼基转移酶抑制剂、抗棕榈酰化抑制剂或两者。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗法尼基转移酶抑制剂、抗棕榈酰化抑制剂选自洛那法尼，Zarnestra Rl 15777，FTI SCH66336，STI571，FLT-3抑制剂，蛋白酶体抑制剂，MAPK抑制剂，BMS-214662，蛋白质棕榈酰化、法尼基肽棕榈酰化的I型非脂质抑制剂或肉豆蔻酰基肽棕榈酰化的2型抑制剂，棕榈酰化酰基转移酶抑制剂，基于脂质的棕榈酰化抑制剂(包括2-溴棕榈酰基(2BP)在内)、衣霉素、浅蓝菌素，以及前述物质的组合。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述成骨发生抑制剂选自抗骨质疏松剂，诸如双膦酸盐药物，包括阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、唑来膦酸、依替膦酸盐，伊班膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐、地诺单抗抗体、降钙素柠檬酸钙、Miacalcin、Forteo特立帕肽、雷洛昔芬(Evista)，以及前述物质的组合。

9.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括施用口服剂量的所述eNOS激活剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述口服剂量包括每天10mg至80mg的阿托伐他汀；每天10mg至40mg的辛伐他汀；每天5mg至40mg的罗苏伐他汀；每天10mg至40mg的普伐他汀；每天1mg至4mg的匹伐他汀；每天10mg的依泽替米贝，以及前述各项的组合。

11.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括施用口服剂量的所述抗法尼基转移酶抑制剂、所述抗棕榈酰化抑制剂或两者。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述剂量包括剂量为115mg/m2的洛那法尼，所述洛那法尼与10mg有效量的依泽替米贝联合使用以115mg/m2至150mg/m2的范围投配。

13.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过肌内或皮下注射施用有效量的PCSK9抑制剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述PCSK9抑制剂的初始剂量是0.25mg/kg至1.5mg/kg。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述PCSK9抑制剂的所述初始剂量是0.5mg/kg至1mg/kg。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述有效量的所述PCSK9抑制剂是每2至4周75-150mg的阿利库单抗、每2周或每月140mg的依伏库单抗，以及前述单抗的组合。

17.一种用于在机械心脏瓣膜植入有壁血管中之后抑制所述机械心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化的方法，所述方法包括：

提供具有由Gortex材料覆盖的缝合环的机械心脏瓣膜；

用包含一种或多种治疗剂的涂层组合物涂覆所述机械心脏瓣膜、所述Gortex材料或两者；

将所述机械心脏瓣膜植入病变的天然瓣膜部位中的所述血管内；

从所述机械心脏瓣膜、所述Gortex材料或两者洗脱所述涂层组合物；

通过阻止干细胞附着到所述机械心脏瓣膜或所述Gortex材料上来抑制所述机械心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化，所述干细胞通过激活(i)所述循环干细胞中，(ii)覆盖所述机械心脏瓣膜和/或所述Gortex材料的内皮细胞内衬中，(iii)或两者中的一氧化氮产生而在所述机械心脏瓣膜外部和附近循环。

18.一种用于在心脏瓣膜植入有壁血管中之后抑制所述心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化的方法，所述方法包括：

提供具有缝合环的无支架手术心脏瓣膜，所述手术心脏瓣膜包括具有一个或多个尖瓣的组织，所述手术心脏瓣膜用于置换病变的天然瓣膜；

用组织固定剂处理所述手术心脏瓣膜；

用包含一种或多种治疗剂的涂层组合物涂覆所述手术心脏瓣膜、一个或多个尖瓣和/或缝合环；

将所述手术心脏瓣膜植入病变的天然瓣膜部位中的所述血管内；

从所述缝合环、一个或多个尖瓣或两者洗脱所述涂层组合物；

通过阻止干细胞附着到所述手术心脏瓣膜上来抑制所述手术心脏瓣膜的狭窄、梗阻和/或钙化，所述干细胞通过激活(i)所述循环干细胞中，(ii)覆盖所述手术心脏瓣膜的内皮细胞内衬中，(iii)或两者中的一氧化氮产生而在所述手术心脏瓣膜外部和附近循环。