CN109420167B - 一种治疗肿瘤的联合用药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗肿瘤的联合用药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的绿原酸与抗CTLA‑4单克隆抗体，以及药学上可接受的载体。本发明绿原酸与抗CTLA‑4单克隆抗体的联合使用可以发挥协同增效的作用，有效降低抗CTLA‑4抗体的毒副作用，缓解单用抗CTLA‑4抗体后产生的机体损伤，临床应用前景良好。

Description

一种治疗肿瘤的联合用药物

技术领域

本发明涉及一种治疗肿瘤的联合用药物。

背景技术

近年来，免疫治疗逐渐成为肿瘤治疗的新方向，越来越多的免疫药物被 用于临床治疗。其中，对T细胞肿瘤免疫研究日益深入，多个有治疗意义的 T细胞调节通路位点和共刺激分子被发现，并被用于加强对肿瘤的免疫反应。

抗CTLA-4药物能提高肿瘤治疗疗效，目前针对CTLA-4的单抗已经用 于恶性黑色素瘤等实体瘤的临床治疗中，然而单用CTLA-4单抗的作用在长 期使用中存在药效不理想，不良反应多等特点。

绿原酸是一种具有强生物活性的天然物质，目前的临床试验已经证实， 绿原酸是一种安全、无毒、广谱的抗肿瘤药物，可以用于包括肺癌、脑胶质 瘤、肝细胞癌、淋巴细胞肿瘤等多种恶性肿瘤的治疗，同时机理研究显示， 绿原酸主要通过调节机体T细胞介导的细胞免疫过程，发挥抗肿瘤作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗肿瘤的联合用药物，以提高抗CTLA-4 抗体单独用药的疗效，及降低抗CTLA-4抗体的毒副作用。

本发明提供了一种治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：它含有相同或 不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的绿原酸和抗CTLA-4单克隆抗 体，以及药学上可接受的载体。

进一步地，所述抗CTLA-4单克隆抗体包括易普利、Tremelimumab。

进一步地，绿原酸和抗CTLA-4单克隆抗体的重量比为1.5～300：1；或 者，绿原酸和抗CTLA-4单克隆抗体的摩尔比为10：0.03～40：0.01。

进一步地，绿原酸和抗CTLA-4单克隆抗体的重量比为16：1。

进一步地，上述联合用药物在制备治疗肿瘤的用途。

进一步地，所述肿瘤为恶性实体瘤。

进一步地，所述恶性实体瘤为黑色素瘤、肺腺癌。

本发明还提供了绿原酸和抗CTLA-4单克隆抗体在制备治疗肿瘤的联合 用药物中的用途。

本发明还提供了绿原酸在制备降低抗CTLA-4单克隆抗体的毒副作用的 药物中的用途。

进一步地，所述药物是减弱抗CTLA-4单克隆抗体导致体重变轻的副作 用的药物。

本发明绿原酸与抗CTLA-4单克隆抗体的联合使用治疗肿瘤可以发挥协 同增效的作用，缓解单用抗CTLA-4抗体后产生的机体损伤，有效降低抗 CTLA-4抗体的毒副作用，将绿原酸与抗CTLA-4单克隆抗体制成联合用药 物的疗效优良，毒性小，临床应用前景良好。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发 明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。

附图说明

图1为不同给药组对B16-F10细胞的迁移和侵袭的影响。

图2为A375小鼠模型中，不同给药组小鼠体重监测结果。

图3为A549小鼠模型中，不同给药组小鼠体重监测结果。

图4为A375小鼠模型中，不同给药组小鼠结肠组织MPO活力监测结果。

图5为A549小鼠模型中，不同给药组小鼠结肠组织MPO活力监测结果。

图6为A375异位瘤小鼠模型中，不同给药组小鼠肿瘤质量。

图7为A549异位瘤小鼠模型中，不同给药组小鼠肿瘤质量。

具体实施方式

实施例1、体外MTT法检测绿原酸联合抗CTLA-4单抗对恶性肿瘤细胞的 抑制作用及药物联合作用的评价

1、材料

药品：易普利单抗注射液(Yervoy，百时美施贵宝)，Tremelimumab(四 川大学国家生物重点实验室)，绿原酸原料药(99.1％纯度，四川九章生物 科技有限公司)

细胞株：A375细胞(人恶性黑色素瘤细胞)

2、实验方法

2.1单药及联合用药MTT实验

取对数生长期的A375细胞接种于96孔板中，接种密度为每孔100μL 含5×104个细胞，有3个孔不加细胞，只加培养基，作为空白对照组，在 5％CO2、37℃条件培养箱中孵育12h，待细胞完全贴壁后，吸弃原培养基。

加入RPMI-1640完全培养基稀释的不同浓度的不同药物并按照表1中的 5个不同浓度交叉组合，每组均设置3个复孔，培养48h后每孔加入PBS配 制的5mg/mL的MTT溶液20μL，继续孵育4h，小心吸弃上清，每孔加150 μLDMSO后置水平摇床上低速振荡10min，充分溶解结晶，490nm波长处 测量各孔吸光值(A)。分别计算各加药组的抑制率。

表1不同药物的浓度及组合

2.2药物联合作用的评价

①根据上述实验结果计算不同药物对不同细胞的抑制率，抑制率计算公 式如下：抑制率(IC)＝1-(实验组A-空白对照组A)/(阴性对照组A-空白 对照组A)×100％

②以同一药物不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图，可得到剂量效应曲线。

③根据药物浓度及对应的肿瘤细胞抑制率，采用Logit法IC50计算软件 计算半数抑制浓度(IC50值)。

④联合用药以公式Q＝E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)计算有无协同作用。 其中E(a+b)为两药合用的抑制率，即实测合并效应，Ea和Eb为两药单用时 的抑制率，分母(Ea+Eb-Ea×Eb)为期望合并效应，Q为两者比值。Q值在0.85～ 1.15时，两药合并效应为相加(+)，Q值在1.15～20时为协同(++)，Q值＞20 为明显协同(+++)，Q值在0.05～0.85时为拮抗，Q值＜0.05为明显拮抗。

3、实验结果

对上述实验结果按照联合用药指数法进行分析后，算得联合用药的联合 用药的Q值，结果如表2、表3所示：

表2不同浓度的绿原酸与易普利单抗联合作用于A375细胞的联合指数

表3不同浓度的绿原酸与Tremelimumab单抗联合作用于A375细胞的联合指数

由表2、表3可以看出：不同浓度绿原酸原料药联合易普利单抗或 Tremelimumab单抗作用于A375细胞上，其联合用药的Q值均在1.15至20 之间，在部分浓度组合表现出强烈协同作用(Q＞20)。表明绿原酸和抗 CTLA-4单抗联合使用在该类细胞上表现为协同作用，可以显著的加强对 A375细胞的抑制作用。

实验结果说明，绿原酸联合抗CTLA-4单抗作用于不同的恶性肿瘤细胞 上，均可以在特定的浓度，达到较强的协同作用。

实施例2、绿原酸联合抗CTLA-4单抗对B16恶性黑色素瘤细胞迁移和侵袭 的影响

1、材料

药品：易普利单抗注射液(Yervoy，百时美施贵宝)，绿原酸原料药(99.1％ 纯度，四川九章生物科技有限公司)

细胞株：B16-F10细胞(高转移恶性小鼠黑色素瘤细胞)

2、实验方法

用马克笔在6孔板背后，均匀的划横线，大约每隔0.5-1cm划一道，横 穿过孔，每孔至少穿过5条线。之后取对数生长期细胞，以5×105个/mL 的浓度将B16-F10细胞接种于6孔板中，每板共设4组，分别为空白对照 组、易普利单抗组、绿原酸单药组及两药联用组，其中，联合用药组均选择 上述实施例1中Q值最大的浓度组合(绿原酸50μmol/L+易普利单抗0.15 μmol/L)，第二天先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，之后用PBS 洗细胞3次，分组给药24h后，弃去培养基，换新的RPMI-1640培养基，培 养24h，拍照，用imageJ测量划痕区域的像素，定量比较细胞迁移的速度， 计算公式为：细胞迁移的距离＝药物处理前的划痕宽度-药物处理后的划痕宽 度。

3、实验结果

划痕实验的结果如图1所示，单独使用绿原酸或单独使用易普利单抗， 都没有显著的抑制B16-F10细胞的迁移，然而当绿原酸和易普利单抗联合使 用时，能够显著的抑制B16-F10细胞的迁移。

实验结果表明：联合使用绿原酸和易普利单抗，可以显著的抑制B16-F10 细胞的迁移和侵袭，这种抑制作用在单独使用两种药物时均未表现出，证明 绿原酸联合抗CTLA-4单抗的协同作用。

实施例3、绿原酸联合抗CTLA-4单抗治疗恶性肿瘤的体内动物实验

1、材料

药品：易普利单抗注射液(Yervoy，百时美施贵宝)，绿原酸原料药(99.1％ 纯度，四川九章生物科技有限公司)

细胞株：A375细胞(人恶性黑色素瘤细胞)；A59细胞(人肺腺癌细胞)

动物：100只BALB/C裸鼠，雌雄各半，6-8周龄

2、实验方法

2.1动物模型的建立与分组

将购买的BALB/C裸鼠饲养1周后，随机分为2组，每组50只，常规 培养A375黑色素瘤细胞和A549人肺腺癌细胞，实验前一周，取对数期生长 的细胞，胰酶消化后，用PBS调整成浓度为5×10⁵个/mL的细胞悬液，随即 分别给各组小鼠背部皮下种植A375细胞和A549细胞。接种完毕后继续饲养 7天，7天后将A375异位瘤小鼠和A549异位瘤小鼠再分为4组，分别为① 模型对照组；②易普利单药组；③绿原酸单药组和④联合用药组，具体的实 验分组如表4所示。

表4动物实验分组及给药剂量

2.2实验操作

按上述表4的分组及给药方式，所有异位瘤小鼠中，绿原酸单独给药组， 从D1开始，连续腹腔注射28天；易普利单药组于实验D1、D7、D14和D21 各给药一次，共4次；联合用药组，从D1开始，每天腹腔注射绿原酸，同 时D1、D7、D14和D21静脉注射一次易普利单抗。D28实验结束。

①小鼠体重的监测

分别于D1、D7、D14、D21和D28给药前称量小鼠的体重；

②髓过氧化物酶(MPO)的测定

MPO是中性粒细胞的特征性酶，MPO活力代表了结肠组织中中性粒细 胞的浸润程度，MPO活性越高，则结肠炎的程度越强。根据目前的研究结果， 易普利单抗临床应用时比较显著的不良反应即结肠炎，故本实施例设计MPO 的检测，考虑单用易普利单抗和联合用药对MPO是否有影响。

分别于两组异位瘤小鼠给药完毕处死后，分离结肠，取结肠中下段约2cm 长称量后匀浆，使用MPO试剂盒对小鼠结肠中MPO进行检测。

③肿瘤体积的监测

于最后一次给药后(D28)，量取各组小鼠瘤体积后，处死各组小鼠， 将瘤体剥离，称取瘤体重量。

3、实验结果

3.1小鼠体重监测结果

对各组小鼠不同时间点体重监测结果显示，在A375异位瘤小鼠和A549 异位瘤小鼠中，单用抗CTLA-4单抗(易普利单抗)治疗的小鼠，其体重较 其它各组均有明显的下降，结合临床已有的研究资料显示，该类药物对小鼠 产生了机体损伤，体重减轻即为机体损伤的表现之一。根据实验过程中不同 给药组小鼠体重的监测结果，绿原酸联合易普利单抗治疗能显著的抑制小鼠 体重下降的趋势，具体实验结果如图2和图3所示。

3.2小鼠MPO活力检测

对A375和A549两种异位瘤小鼠模型中的4组小鼠进行MPO检测后， 结果显示，与临床应用的结论一致，单用抗CTLA-4单抗(易普利单抗)治 疗的小鼠，与模型对照组相比，其MPO活力显著上升，提示存在显著的结 肠炎症状。另外，绿原酸联合易普利单抗治疗组的小鼠，其MPO活力较单 用易普利单抗组明显降低，且与各自的模型对照组无显著性差异。具体的实 验结果如图4和图5所示。

实验结果表明：绿原酸联合易普利单抗治疗荷瘤小鼠，可以显著的降低 小鼠的MPO活力，进而有效缓解单用易普利单抗产生的不良反应。

3.3小鼠肿瘤体积监测结果

对A375异位瘤小鼠和A549异位瘤小鼠治疗过程中的小鼠肿瘤体积进行 监测，结果显示绿原酸联合易普利治疗组的小鼠，其肿瘤体积生长的速率显 著低于其它各组，最终的肿瘤质量也是所有组中最小的，继而证明，在体内 动物实验中，绿原酸联合抗CTLA-4单抗(易普利单抗)，可以显著的减缓小 鼠体内肿瘤的生长速率，具有显著的协同作用。具体的实验结果如图6和图 7所示。

实验结果表明：绿原酸联合用药组在不同的异位瘤小鼠模型中，与单用 抗CTLA-4单抗(易普利单抗)组相比，均能更显著的抑制肿瘤的增大，证 明了绿原酸联合抗CTLA-4单抗具有显著的协同作用。

综上，本发明绿原酸与抗CTLA-4单克隆抗体的联合使用治疗恶性肿瘤 可以发挥协同增效的作用，缓解单用抗CD20抗体后产生的机体损伤，有效 降低抗CTLA-4抗体的毒副作用，将绿原酸与抗CTLA-4单克隆抗体制成联 合用药物的疗效优良，毒性小，临床应用前景良好。

Claims (8)

1.绿原酸在制备降低抗CTLA-4单克隆抗体的毒副作用的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗CTLA-4单克隆抗体为易普利或Tremelimumab。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：绿原酸和抗CTLA-4单克隆抗体的重量比为1.5~300：1；或者，绿原酸和抗CTLA-4单克隆抗体的摩尔比为10：0.03~40：0.01。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：绿原酸和抗CTLA-4单克隆抗体的重量比为16:1。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述抗CTLA-4单克隆抗体用于治疗肿瘤。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述肿瘤为恶性实体瘤。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述恶性实体瘤为黑色素瘤、肺癌。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是减弱抗CTLA-4单克隆抗体导致体重变轻的副作用的药物。

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