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CN109402071B - 一种表达h9n2亚型禽流感病毒h9蛋白的重组火鸡疱疹病毒 - Google Patents

一种表达h9n2亚型禽流感病毒h9蛋白的重组火鸡疱疹病毒 Download PDF

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CN109402071B CN201811324183.7A CN201811324183A CN109402071B CN 109402071 B CN109402071 B CN 109402071B CN 201811324183 A CN201811324183 A CN 201811324183A CN 109402071 B CN109402071 B CN 109402071B
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Abstract

本发明公开了一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒。该重组火鸡疱疹病毒是出发火鸡疱疹病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因的DNA分子；所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。实验证明，实验第1天，向1日龄SPF鸡颈部皮下接种重组火鸡疱疹病毒；实验第35天，鼻腔接种BJ/15病毒株；实验第38天和第40天，SPF鸡的口腔和泄殖腔均不排毒，BJ/15病毒株不能够在SPF鸡的脏器(如内脏器官、气管、肺、脾和肾脏)中有效复制。由此可见，重组火鸡疱疹病毒对H9N2亚型AIV具有优良的免疫保护效果。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒。
背景技术
1994年，我国首次报道鸡感染H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)疫情，自此H9N2亚型AIV在我国家禽中广泛流行，该病毒感染鸡群之后导致蛋鸡产蛋下降或者引起继发感染，给养殖业带来巨大经济损失。H9N2亚型AIV在陆生禽类中流行并演化成为不同的基因型，目前H9N2亚型AIV在我国鸡群中优势流行株是G57基因型，该基因型最早出现在2007年，2010年以后成为优势基因型；该基因型的H9N2亚型AIV不仅严重威胁养殖业健康发展，同时作为基因供体，在H7N9、H10N8等新型流感病毒产生中起到重要作用，给禽流感病毒的防控带来巨大挑战。
针对H9N2亚型AIV，自1998年以来，我国实行灭活疫苗免疫防控策略。但是灭活疫苗存在许多固有的缺陷，其只能刺激机体产生体液免疫，而不能产生有效的细胞免疫，同时灭活疫苗产生免疫保护主要是通过其较高的血清抗体水平，由于灭活疫苗产生的抗体维持时间短，需要持续的多次免疫来维持较高的抗体滴度，这样给养殖人来带来巨大的工作量，同时过多的免疫造成机体免疫疲劳，降低免疫效果，进而降低生产性能。灭活疫苗产生抗体所需时间较长，易错过最佳保护时机。因此在过去的20年时间里，灭活疫苗能够减轻感染鸡临床症状，降低鸡排毒，却不能产生完全保护，同时由于病毒抗原性的变异，导致没有有效控制H9N2亚型AIV的流行。对近年来H9N2亚型AIV在免疫鸡群中的流行情况进行调查发现，H9N2亚型AIV的分离率逐年上升，从2010年的22.08％上升到2013年的47.08％，表明传统的灭活疫苗免疫不能有效的防控H9N2亚型AIV感染，因此新疫苗的研发迫在眉睫。
活载体疫苗能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，成为新疫苗研制的热点。火鸡疱疹病毒(Turkey herpesvirus，HVT)属于疱疹病毒科，1970s年代分离以来一直作为免疫防控马立克氏病(MD)的疫苗毒株被广泛使用。HVT可以容纳外源基因并携带外源基因进行复制，是目前活载体疫苗研究的热门。自1970年以来，HVT FC126株己成为全球范围内用于预防MD的主要疫苗。HVT为双链DNA病毒，基因组大，存在许多复制非必需区，可以承载外源基因在体内复制并表达。同时还具有如下优点：HVT可在鸡体内持续感染，刺激机体持续产生抗体，接种一次即可达到终生免疫的效果；HVT作为疫苗对鸡无致病性，不影响其生产性能，安全性好；HVT可刺激机体产生较强的细胞免疫反应，且持续时间长，接种一次即可达到终生免疫的效果；HVT具有很强的细胞结合特性，可在细胞间传播，突破母源抗体的干扰等。因此，HVT为载体的基因工程疫苗具有广阔的应用前景。目前，以HVT作为载体成功表达许多禽类病毒的免疫保护性抗原，如传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、新城疫病毒(NDV)及艾美尔球虫病(Eimeria)等，这些HVT重组疫苗不仅可以同时诱导禽类产生针对病毒载体和外源病毒的免疫保护力，起到预防多种疾病的效果，而且重组病毒在体内产生的免疫应答反应持久、潜伏期短。
发明内容
本发明的目的是制备预防禽流感病毒和马立克病毒的疫苗。
本发明首先保护一种重组火鸡疱疹病毒；所述重组火鸡疱疹病毒是出发火鸡疱疹病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因的DNA分子；
所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因可为如下c1)或c2)或c3)：
c1)序列表的序列1所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA分子杂交且编码所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的DNA分子或cDNA分子。
所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白来源于名称为A/Chicken/Beijing/0701/2015(H9N2)的禽流感病毒病毒株，该病毒株具体由本发明的发明人从北京市活禽市场采集鸡的咽喉拭子样本，参考文献(Pu juan et al.Evolution of the H9N2influenza genotypethat facilitated the genesis of the novel H7N9virus.Proc Natl Acad Sci U SA.2015.)中的记载的方法分离和鉴定获得。
上述任一所述的重组火鸡疱疹病毒中，所述改造的实现方式可为：向出发火鸡疱疹病毒的基因组UL区的95322nt-95323nt之间插入特异DNA分子；所述特异DNA分子中可含有启动子、所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和终止子。
所述特异DNA分子中还可含有增强子；所述增强子可位于所述启动子的上游。
上述任一所述特异DNA分子自上游至下游依次可含有所述增强子、所述启动子、所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和所述终止子。
上述任一所述增强子可为CMV增强子。所述CMV增强子可为序列表中序列3自5’末端起第1至274位所示的DNA分子。
上述任一所述启动子可为鸡β-肌动蛋白启动子。所述鸡β-肌动蛋白启动子可为序列表中序列3自5’末端起第275至561位所示的DNA分子。
上述任一所述终止子可为bGH终止子。所述bGH终止子可为序列表中序列3自5’末端起第2350至2573位所示的DNA分子。
上述任一所述特异DNA分子可为序列表的序列3所示的DNA分子。
上述任一所述出发火鸡疱疹病毒具体可为HVT FC-126疫苗株。
上述任一所述特异DNA分子也属于本发明保护的保护范围。
上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白也属于本发明保护的保护范围。
上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因也属于本发明保护的保护范围。
本发明还保护X1)或X2)或X3)或X4)。
X1)上述任一所述重组火鸡疱疹病毒在预防禽流感病毒和/或马立克病毒中的应用也属于本发明的保护范围。
X2)上述任一所述重组火鸡疱疹病毒在制备用于预防禽流感病毒和/或马立克病毒的疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
X3)上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白、或、上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因、或、上述任一所述特异DNA分子在预防禽流感病毒中的应用也属于本发明的保护范围。
X4)上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白、或、上述任一所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因、或、上述任一所述特异DNA分子在制备用于预防禽流感病毒的疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种预防禽流感病毒和/或马立克病毒的疫苗，其可含有上述任一所述重组火鸡疱疹病毒。
所述预防禽流感病毒和/或马立克病毒的疫苗具体是以上述任一所述重组火鸡疱疹病毒作为抗原制备的。
上述任一所述禽流感病毒可为H9N2亚型禽流感病毒。
实验证明，实验第1天，向1日龄SPF鸡颈部皮下接种本发明提供的重组火鸡疱疹病毒，接种剂量为3000PFU/只；实验第35天，鼻腔接种BJ/15病毒株，接种剂量为104ELD50；实验第38天(攻毒第3天)和第40天(攻毒第5天)，SPF鸡的口腔和泄殖腔均不排毒，BJ/15病毒株不能够在SPF鸡的脏器(如内脏器官、气管、肺、脾和肾脏)中有效复制。由此可见，本发明提供的重组火鸡疱疹病毒对H9N2亚型AIV具有优良的免疫保护效果。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为根据H9N2禽流感病毒HA基因的绘制的系统进化树。
图2为根据血凝抑制试验结果制作的抗原图谱。
图3为含有重组质粒HVT-BAC-H9的SW102菌的构建示意图。
图4为重组病毒rHVT-H9的构建示意图。
图5为间接免疫荧光鉴定结果。
图6为Western blot鉴定结果。
图7为血清HI抗体滴度检测结果。
图8为血清VN抗体滴度检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pcDNA3.1+载体为Invitrogen公司的产品，产品目录号为V790-20。pBeloBAC11质粒和pUC19质粒均为NEB公司的产品，产品目录号分别为E4154和N3041S。
HVT FC-126疫苗株保存于中国农业大学，公众可从中国农业大学(即申请人处)获得。下述实施例中，HVT FC-126疫苗株简称HVT。
下述实施例中涉及的引物的核苷酸序列具体见表1。
表1.构建所需引物名称及序列
Figure BDA0001858254270000041
Figure BDA0001858254270000051
实施例1、A/Chicken/Beijing/0701/2015(H9N2)(以下简称A/Chicken/Beijing/0701/2015、BJ/15病毒株或CK/BJ/1/15)的获得和鉴定
一、H9N2流感病毒的分离和鉴定
本发明的发明人在2014年和2015年间从我国北京、天津、河北和山东等地采集鸡的咽喉拭子样本，然后参考文献(Pu juan et al.Evolution of the H9N2influenzagenotype that facilitated the genesis of the novel H7N9virus.Proc Natl AcadSci U S A.2015.)中记载的方法，对样本的有关病毒进行分离和鉴定。其中分离到16株H9N2禽流感病毒。根据流感病毒的通用命名法，将分离得到的16株H9N2禽流感病毒进行命名，具体信息见表1-1。
表1-1. 2014-2015年分离的H9N2禽流感病毒的基本信息
Figure BDA0001858254270000052
Figure BDA0001858254270000061
下述实施例还用到本发明的发明人实验室保存的、分离自2014年以前的10株H9N2禽流感病毒，具体信息见表1-2。这10株H9N2禽流感病毒记载于如下文献中：秦志华，2016.2014-2015年我国北方地区家禽H9N2流感病毒的基因进化和抗原性分析.中国农业大学硕士学位论文。
表1-2.发明人实验室保存的H9N2禽流感病毒的基本信息
序号 毒株名称 简称 分离时间 分离地点
1 A/quail/Hong Kong/G1/97 G1 1997 香港
2 A/Chicken/Beijing/3/99 3/99 1999 北京
3 A/Chicken/Shandong/ZB/07 ZB/07 2007 山东
4 A/Chicken/Guangdong/01/11 GD/01/11 2011 广东
5 A/Chicken/Hebei/0617/07 0617/07 2007 河北
6 A/Chicken/HeB/YT/10 YT/10 2010 河北
7 A/Chicken/Shandong/qd1115/12 SD/1115/12 2012 山东
8 A/Chicken/Shandong/01/10 SD/01/10 2010 山东
9 A/Chicken/Jiangsu/TS/10 TS/10 2010 江苏
10 A/Chicken/Shandong/06/11 SD/06/11 2011 山东
二、H9N2禽流感病毒系统进化关系分析
为了系统分析研究分离的16株H9N2禽流感病毒的基因进化情况，本发明的发明人根据文献(Pu J，Wang S，Yin Y，Zhang G，Carter R A，Wang J，et al.Evolution of theH9N2influenza genotype that facilitated the genesis of the novel H7N9virus.Proc Natl Acad Sci U S A 2015；112：548-553)中的系统进化关系的分析方法，在NCBI数据库的Nucleotide中下载文献中H9N2禽流感病毒各个基因片段进化树的每个分支的代表毒株；另外在NCBI数据库的Influenza中下载2014年和2015年两年间发表的H9N2禽流感病毒的序列，结合步骤一分离的16株H9N2禽流感病毒的测序结果，共同绘制系统进化树。绘制系统进化树的方法为：首先用MEGA6软件对所有序列进行比对，将比对结果保存，并相应的核苷酸序列翻译成对应的氨基酸序列进行相应的统计和分析；然后在Phylogeny中选择Neighbor-Joining Tree，其它参数均为默认值进行进化树的制作。
根据HA基因绘制的系统进化树见图1。结果表明，H9N2禽流感病毒HA基因可以分为10个大分支，步骤一分离的16株H9N2禽流感病毒HA基因均属于clade 9分支的Major group亚分支。步骤一分离的16株H9N2禽流感病毒中，2014年分离毒株的基因进化关系较其它毒株近；2015年分离H9N2禽流感病毒的基因进化关系较近。整体而言，2014年之后(包括2014年，及少数的2013年的毒株)已经报道的和步骤一分离的H9N2禽流感病毒在clade 9分支之内形成了一个新的亚分支。用MegAlign软件的Neighbor-Joining方法比对后，步骤一分离的16株H9N2禽流感病毒的HA基因的核酸序列同源性在96.3％—99.9％。
三、H9N2禽流感病毒的抗原性分析
1、抗血清的制备
取步骤一分离的16株H9N2禽流感病毒和表1-2所示的10株H9N2禽流感病毒，进行抗血清的制备。制备抗血清的方法参考如下文献：秦志华，2016.2014-2015年我国北方地区家禽H9N2流感病毒的基因进化和抗原性分析.中国农业大学硕士学位论文。
2、血凝抑制试验
取步骤1制备的抗血清和其H9N2禽流感病毒，进行血凝抑制试验。具体实验方法和步骤参考如下文献：(Cox N，Webster R G，Krauss S，Guan Y，Hay A，Yu K，et al.WHOManual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance,2nd edition.2005)。
实验结果见表2。结果表明，H9N2禽流感病毒的抗原群F与抗原群A、C、E对应血清血凝抑制效价较低，抗原交叉反应较差；而与抗原群D、F对应血清血凝抑制效价较高，抗原交叉反应较好。步骤一分离的16株H9N2禽流感病毒中，分离自2014年的H9N2禽流感病毒，除个别毒株外，与抗原群A、C、E对应的血清的血凝抑制效价较低，抗原交叉反应较差；分离自2015年的H9N2禽流感病毒对A、C、D、E、F对应的血清的血凝抑制效价较低，抗原交叉反应较差，仅与抗原群D、F1的部分毒株对应的抗血清的血凝抑制效价较高，抗原交叉反应较好。2014年、2015年分离的H9N2病毒株对应的抗血清与抗原群A、C、D、E、F的毒株反应的血凝抑制效价均较低，抗原交叉反应较差；而与2015年的H9N2禽流感病毒的血凝抑制效价均较高，抗原交叉反应较好。综合以上结果，可以推断2015年分离的H9N2禽流感病毒形成了一个新的抗原群G。
表2-1.血凝抑制试验检测H9N2禽流感病毒抗原性变化结果
Figure BDA0001858254270000081
注：<表示抗体滴度小于16。
表2-2.血凝抑制试验检测H9N2禽流感病毒抗原性变化结果
Figure BDA0001858254270000082
Figure BDA0001858254270000091
注：<表示抗体滴度小于16。
将血凝抑制试验结果在网站(http://sysbio.cvm.msstate.edu/AntigenMap)制作相应的抗原图谱。抗原图谱见图2。结果表明，2015年分离H9N2禽流感病毒形成了一个新的抗原群，命名为G，它与其它抗原群没有交叉。
3、微量中和试验
取步骤1制备的抗血清和其H9N2禽流感病毒，进行MDCK细胞上的微量中和试验。
实验结果见表3。结果表明，抗原群F与抗原群A、C、E对应血清中和效价较低，抗原交叉反应较差；而与抗原群D、F对应血清中和效价较高，抗原交叉反应较好。2015年分离的H9N2禽流感病毒对应的抗血清与抗原群A、C、D、E、F中和效价较低，抗原交叉反应很差；同样地，2015年分离的H9N2禽流感病毒与抗原群A、C、D、E、F对应的抗血清同样中和效价很低，抗原交叉反应很差。由此更进一步验证了2015年分离的H9N2禽流感病毒形成了一个新的抗原群G。
表3-1.微量中和试验检测H9N2禽流感病毒抗原性变化结果
Figure BDA0001858254270000092
Figure BDA0001858254270000101
注：<表示抗体滴度小于10。
表3-2.微量中和试验检测H9N2禽流感病毒抗原性变化结果
Figure BDA0001858254270000102
注：<表示抗体滴度小于10。
综合上述实验结果，选择A/Chicken/Beijing/0701/2015(即BJ/15病毒株)进行后续实验。
实施例2、表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒(即重组病毒rHVT-H9)的制备
一、重组质粒pBAC-GFP-US的构建
1、人工合成GFP基因(NCBI序列号：LC336974.1)的核苷酸序列并插入到pUC19载体中构建质粒pUC-GFP。以质粒pUC-GFP为模板，采用GFP-F和GFP-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约720bp的DNA片段。
2、取步骤1得到的DNA片段，用限制性内切酶NheI和XbaI进行双酶切，回收酶切片段。
3、取pcDNA3.1+载体，用限制性内切酶NheI和XbaI进行双酶切，回收约5.4kb的载体骨架。
4、将步骤2得到的酶切片段和步骤3得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pcDNA-GFP。
5、以步骤4得到的重组质粒pcDNA-GFP为模板，采用GFP exp-F和GFP exp-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约1668bp的DNA片段。该DNA片段为含有CMV启动子和bGH终止子的GFP真核表达盒。
6、取步骤5得到的DNA片段，用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切，回收酶切片段。
7、取pBeloBAC11质粒，用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切，回收载体骨架。
8、将步骤6得到的酶切片段和步骤7得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pBAC-GFP。
9、使用HVT感染鸡胚成纤维细胞(简称CEF细胞)，并在感染5天后提取HVT的基因组DNA。
10、以HVT的基因组DNA为模板，采用left arm-F和left arm-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约2061bp的DNA片段(即左同源臂)。以HVT的基因组DNA为模板，采用rightarm-F和right arm-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约2696bp的DNA片段(即右同源臂)。
11、取pUC19质粒，用限制性内切酶SalI和KpnI进行双酶切，回收载体骨架。
12、取步骤10得到的左同源臂，用限制性内切酶SalI和BamHI进行双酶切，回收酶切片段1。取步骤10得到的右同源臂，用限制性内切酶BamHI和KpnI进行双酶切，回收酶切片段2。
13、将步骤12得到的酶切片段1、酶切片段2和步骤11得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pUC-US。
14、取重组质粒pBAC-GFP，用限制性内切酶BamHI酶切，回收约9139bp的酶切片段。
15、取重组质粒pUC-US，用限制性内切酶BamHI酶切，回收约7400bp的载体骨架。
16、将步骤14得到的酶切片段和步骤15得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pBAC-GFP-US。
二、重组病毒HVT-BAC阳性克隆的获得
1、将纯化的HVT基因组DNA和重组质粒pBAC-GFP-US共转染CEF细胞，通过同源重组，获得能够发出绿色荧光(绿色荧光基因GFP作为筛选标记)的重组病毒HVT-BAC。
2、完成步骤1后，分别将重组病毒HVT-BAC进行纯化和富集。
3、完成步骤2后，分别提取重组病毒HVT-BAC的基因组DNA，然后使用BIO-RAD电转仪分别电转化至大肠杆菌DH10B感受态，经过2h复壮后涂布含有氯霉素(Cm)的LB固体平板，37℃倒置培养过夜。
能够在平板上生长的克隆即为重组病毒HVT-BAC阳性克隆。
三、重组质粒pcDNA-pec-H9的构建
1、人工合成pec启动子(NCBI序列号：AF428265.1)的双链DNA分子。
2、将步骤1合成的双链DNA分子和pUC57载体连接，得到重组质粒pUC-pec。
3、以重组质粒pUC-pec为模板，采用pec-F和pec-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约561bp的DNA片段。
4、取步骤3得到的DNA片段，用限制性内切酶NheI和KpnI进行双酶切，回收酶切片段。
5、取pcDNA3.1+载体，用限制性内切酶NheI和KpnI进行双酶切，回收约5.4kb的载体骨架。
6、将步骤4得到的酶切片段和步骤5得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pcDNA-pec。重组质粒pcDNA-pec中含有pec启动子和bGH终止子。
7、将BJ/15病毒株接种至SPF鸡胚(用于扩增病毒)，收集尿囊液并使用Roche RNA提取试剂盒提取RNA，再使用MLV反转录试剂盒将RNA反转录合成cDNA。
8、以步骤7得到的cDNA为模板，采用H9-F和H9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到约1697bp的DNA片段。该DNA片段中含有序列表中序列1所示的核苷酸序列(即H9基因)，编码序列表中序列2所示的H9蛋白。
9、取步骤8得到的DNA片段，用限制性内切酶KpnI和BamHI进行双酶切，回收酶切片段。
10、取重组质粒pcDNA-pec，用限制性内切酶KpnI和BamHI进行双酶切，回收载体骨架。
11、将步骤9得到的酶切片段和步骤10得到的载体骨架进行连接，得到重组质粒pcDNA-pec-H9。
重组质粒pcDNA-pec-H9中含有H9表达盒。H9表达盒包括pec启动子、H9基因和bGH终止子。pec启动子包含CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子。
H9表达盒的核苷酸序列如序列表中序列3所示。序列表中序列3自5’末端起，第1至274位为CMV增强子，第275至561位为鸡β-肌动蛋白启动子，第568至2250位为H9基因，第2350至2573位为bGH终止子。序列表中序列3自5’末端起第1至561位为pec启动子。
四、表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒的制备
SW102基因工程菌和peGFP-galk记载于如下文献中：Warming S，Costantino N，Court D L，Jenkins N A，and Copeland N G.Simple and highly efficient BACrecombineering using galK selection.2005；33：e36-e36.
1、将HVT-BAC阳性克隆导入SW102基因工程菌，得到重组菌，然后制备重组菌的电转化感受态。
2、以peGFP-galk为模板，采用homo galk-F(含有50bp同源臂)和homo galk-R(含有50bp同源臂)组成的引物对进行PCR扩增，得到约1331bp的DNA片段。
3、取步骤2得到的DNA片段，纯化，然后电转化至步骤1制备的重组菌的电转化感受态进行重组，之后涂布在含有半乳糖的LB固体平板，32℃倒置培养过夜。
能够在平板上生长的克隆即为含有重组质粒HVT-BAC-Galk的SW102菌。与HVT-BAC阳性克隆相比，重组质粒HVT-BAC-Galk仅在95322nt后插入含有em7启动子的galk序列。
4、以重组质粒pcDNA-pec-H9为模板，采用homo H9-F(含有50bp同源臂)和homoH9-R(含有50bp同源臂)组成的引物对进行PCR扩增，得到约2673bp的DNA片段。
5、取步骤4得到的DNA片段，纯化，然后电转化至含有重组质粒HVT-BAC-Galk的SW102菌的感受态进行重组，之后涂布在含有2-脱氧-半乳糖(DOG)的LB固体平板，32℃倒置培养过夜。
能够在平板上生长的克隆即为含有重组质粒HVT-BAC-H9的SW102菌。与重组质粒HVT-BAC-Galk相比，重组质粒HVT-BAC-H9仅将em7启动的galk序列替换为H9真核表达盒。
上述步骤1至5的示意图详见图3。
6、pX458-sgRNA载体的构建
(1)以步骤一中5中GFP真核表达盒之外的BAC序列为靶位点设计并人工合成sgRNA-F和sgRNA-R。
(2)配置退火反应体系。退火反应体系为10μL，由1μL sgRNA-F水溶液(浓度为100nM)、1μL sgRNA-R水溶液(浓度为100nM)、1μL10×T4ligase Buffer、1μLT4PNK和6μLddH2O组成。
(3)完成步骤(2)后，取所述退火反应体系，进行退火反应，形成DNA分子Ⅰ。
退火程序：37℃30min，95℃5min，PCR梯度降温至25℃、速度为每秒降低0.1℃，25℃5min，4℃5min。
(4)取pX458载体(Addgene公司的产品，产品目录号为48138；pX458载体上还有Cas9基因)，用限制性内切酶BbsI酶切，回收载体骨架。
(5)将步骤(3)得到的DNA分子Ⅰ和步骤(4)得到的载体骨架进行连接，得到pX458-sgRNA载体。
将pX458-sgRNA载体进行测序。根据测序结果，对pX458-sgRNA载体进行结构性描述如下：向pX458载体的限制性内切酶BbsI的识别位点插入DNA分子Ⅰ。DNA分子Ⅰ的核苷酸序列为5’-CACCGAATGCGGATCTCTACGATAAGTTT-3’。
7、提取含有重组质粒HVT-BAC-H9的SW102菌的质粒，得到重组质粒HVT-BAC-H9。
8、将重组质粒HVT-BAC-H9、重组质粒pX458-sgRNA和HVT US区同源序列donor基因(以HVT的基因组DNA为模板，采用donor-F和donor-R组成的引物对进行PCR扩增，得到的DNA片段(HVT的基因组DNA的139462nt-141036nt))共同转染CEF细胞，通过CRIPSR/Cas9诱导的同源重组，用donor基因替换BAC序列，从而获得仅插入H9表达盒的表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒(即重组病毒rHVT-H9)。由于重组病毒rHVT-H9不含有GFP，因此重组病毒rHVT-H9可以通过筛选不含有绿色荧光的蚀癍而被成功筛选。
上述步骤6至8的示意图详见图4。
由此可知，重组病毒rHVT-H9是对HVT基因组进行如下改造得到的：向HVT的基因组UL区的95322nt-95323nt之间插入了H9表达盒。H9表达盒包括pec启动子、H9基因和bGH终止子。
按照上述步骤，构建重组病毒rHVT-CMV-H9。重组病毒rHVT-CMV-H9是对HVT基因组进行如下改造得到的：向HVT的基因组UL区的95322nt-95323nt之间插入了CMV-H9表达盒。与H9表达盒相比，CMV-H9表达盒的不同之处仅在于将pec启动子(序列表中序列3自5’末端起第1至561位所示)替换为CMV启动子。CMV启动子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
实施例3、重组病毒rHVT-H9的鉴定
一、基因水平鉴定
提取重组病毒rHVT-H9的基因组DNA并以其作为模板，采用H9-F和H9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
结果表明，PCR扩增产物中含有约1683bp的DNA片段。由此可见，H9基因已完全插入HVT基因组。
二、间接免疫荧光鉴定
1、取24孔细胞培养板，加入500μL含有CEF细胞的培养液(约2.25×105个CEF细胞/孔)，37℃、5％CO2培养，直至CEF细胞生长成单层。
2、完成步骤1后，接种重组病毒rHVT-H9(接种剂量为100PFU/孔)，37℃、5％CO2培养72h。
3、完成步骤2后，弃培养基，先用pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液洗涤1次，然后每孔加入500μL预冷的固定液(由3体积份乙醇和2体积份丙酮混合而成)，固定20min。
4、完成步骤3后，弃液相，先用pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；然后每孔加入300μL鼠多克隆抗体稀释液(由1体积份鼠多克隆抗体和49体积份pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液混合而成；鼠多克隆抗体的制备方法为：将BJ/15病毒株鼻腔接种小鼠进行免疫，每隔两周加免1次，共计免疫3次后剖杀采集血清所得)，4℃过夜孵育。
5、完成步骤4后，弃液相，先用pH7.2、0.01mM的PBS缓冲液洗涤3次，每次5min；然后加入绿色荧光(FITC)标记的抗鼠二抗进行IFA染色，在倒置荧光显微镜下观察。
按照上述步骤，将重组病毒rHVT-H9替换为HVT，其它步骤均不变，作为对照。
实验结果见图5。结果表明，重组病毒rHVT-H9感染CEF细胞72h后能够产生明显的细胞病变，形成蚀癍，该蚀癍能够被鼠抗H9多克隆抗体特异性结合，经IFA染色后产生绿色荧光，而HVT对照能够形成蚀癍但是不能被鼠抗H9多克隆抗体特异性结合。
三、Western blot鉴定
1、取6孔细胞培养板，加入2nL含有CEF细胞的细胞培养液(约1×106个CEF细胞/孔)，37℃、5％CO2培养，直至CEF细胞生长成单层。
2、完成步骤1后，接种重组病毒rHVT-H9(接种剂量为500PFU/孔)，37℃、5％CO2培养72h。
3、取完成步骤2的细胞，使用胰蛋白酶消化后，离心，收集细胞。
4、完成步骤3后，取所述细胞，裂解，得到细胞裂解液。
5、完成步骤4后，将所述细胞裂解液进行SDS-PAGE和Western blot(采用鼠多克隆抗体(同步骤二中4的鼠多克隆抗体)作为一抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体作为二抗检测H9蛋白，采用β-actin蛋白作为内参)。
按照上述步骤，将重组病毒rHVT-H9替换为HVT，其它步骤均不变，作为对照。
实验结果见图6。结果表明，重组病毒rHVT-H9感染的CEF细胞裂解液能够在78KD大小位置检测H9特异性的条带，而HVT感染的CEF细胞没有该特异性条带。
实施例4、重组病毒rHVT-H9对H9N2亚型AIV的免疫保护评价
1、将30只1日龄SPF鸡随机分成重组病毒rHVT-H9组、重组病毒rHVT-CMV-H9组和对照组三组，每组10只。然后进行如下处理：
重组病毒rHVT-H9组：实验第1天，颈部皮下接种重组病毒rHVT-H9，接种剂量为3000PFU/只；实验第35天，鼻腔接种BJ/15病毒株，接种剂量为104ELD50；
重组病毒rHVT-CMV-H9组：实验第1天，颈部皮下接种重组病毒rHVT-CMV-H9，接种剂量为3000PFU/只；实验第35天，鼻腔接种BJ/15病毒株，接种剂量为104ELD50；
对照组：实验第1天，颈部皮下接种HVT，接种剂量为3000PFU/只；实验第35天，鼻腔接种BJ/15病毒株，接种剂量为104ELD50。
2、完成步骤1后，实验第38天(攻毒第3天)和第40天(攻毒第5天)，各只鸡采集口腔和泄殖腔拭子，鉴定是否排毒。
实验结果见表4。结果表明，对照组的鸡均通过口腔和泄殖腔排毒，而重组病毒rHVT-H9组和重组病毒rHVT-CMV-H9组的鸡均不排毒。
表4.免疫鸡攻毒后排毒检测
Figure BDA0001858254270000161
注：a，平均值±标准差，单位为EID50/mL。
3、完成步骤1后，实验第38天(攻毒第3天)和第40天(攻毒第5天)，各只鸡采集内脏器官、气管、肺、脾和肾脏，滴定脏器病毒滴度，从而检测BJ/15病毒株的复制情况。
实验结果见表5。结果表明，BJ/15病毒株能够在对照组的鸡中有效复制；接种重组病毒rHVT-H9的鸡和接种重组病毒rHVT-CMV-H9的鸡则能够完全阻止BJ/15病毒株在脏器中的复制。
表5.免疫鸡攻毒后排毒检测
Figure BDA0001858254270000162
Figure BDA0001858254270000171
注：a，平均值±标准差，单位为EID50/mL。
4、分别与实验第8天、第15天、第22天、第29天和第36天，采集静脉血并分离血清，然后使用血凝抑制(HI)的方法(记载于如下文献中：Cox N，Webster R G，Krauss S，GuanY，Hay A，Yu K，et al.WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance，2nd edition.2005)和病毒中和(VN)的方法(记载于如下文献中：Cottey R，Rowe C A，andBender B S.Influenza Virus.Current Protocols in Immunology 2001；42：Unit19.11)检测血清抗体的效价。
血清HI抗体滴度检测结果见图7(rHVT-pec-H9为重组病毒rHVT-H9，rHVT-CMV-H9为重组病毒rHVT-CMV-H9)。结果表明，重组病毒rHVT-H9免疫后2周能够检测到血清HI抗体，随着时间延长，HI抗体效果水平不断提高；免疫后4-5周，重组病毒rHVT-H9诱导的HI抗体略高于重组病毒rHVT-CMV-H9；免疫后5周、重组病毒rHVT-H9和重组病毒rHVT-CMV-H9诱导的HI抗体几何平均滴度分别为38.4和25.6。
血清VN抗体滴度检测结果见图8(rHVT-pec-H9为重组病毒rHVT-H9，rHVT-CMV-H9为重组病毒rHVT-CMV-H9)。结果表明，相同的血清VN抗体在免疫后两周也能够检测到H9特异的抗体；在免疫后5周，重组病毒rHVT-H9诱导的VN抗体略高于重组病毒rHVT-CMV-H9，重组病毒rHVT-H9和重组病毒rHVT-CMV-H9诱导的VN抗体几何平均滴度分别为120和92。
上述结果表明，重组病毒rHVT-H9对H9N2亚型AIV具有优良的免疫保护效果。
<110> 中国农业大学
<120> 一种表达H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的重组火鸡疱疹病毒
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1683
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
atggagacag tatcactaat aactatacta ctagtagcag cagtaagcaa tgcagataaa 60
atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagaaaac 120
aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180
gcaacaagct tgggacaacc tcttatttta gacacctgca ccattgaagg gctaatctat 240
ggcaatcctt attgtgatct atcgctggaa ggaagagaat ggtcctatat agtcgagaga 300
ccatcagctg ttaacggatt gtgttacccc gggaatgtag aaaatctaga agagttaagg 360
tcacttttta gttctgctag gtcttatcaa agaatccaga ttttcccaga cacaatctgg 420
aatgtatctt acgatgggac aagcgcagca tgctcaggtt cattctacaa aagcatgaga 480
tggttgactc aaaagaacgg cgattaccct atccaagacg cccaatacac aaataatcaa 540
gggaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcaaccac ccaccgatac tacgcagaga 600
aatctgtaca cgagaaccga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaatagggtc 660
ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattgattat 720
tattggtcgg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa aatctgatgg gaatctaata 780
gccccatggt ttggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaattct gaagactgat 840
ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaga aaggtggctt gaacacaaca 900
ttgccattcc aaaacataag taagtatgca tttggaaact gctcaaaata cattggcata 960
aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta 1020
tttggggcca tagcagggtt tatagaggga ggttggtcag gactagttgc tggttggtat 1080
gggttccagc attcaaatga ccaaggagtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140
aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataatatag tcgacaaaat gaacaagcag 1200
tatgaaatca ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta gacttaacat gatcaataat 1260
aagattgatg atcaaatcca ggatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt 1320
gaaaaccaga aaacactcga tgagcacgac gcaaatgtaa acaatctata taataaagta 1380
aagagggcgt tgggttccaa tgcggtggaa gatggaaaag gatgtttcga gctataccac 1440
aaatgtgatg accaatgcat ggagacaatt cggaatggga cctacaacag aaggaagtat 1500
cgagaggagt caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560
acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg 1620
tttgctgcct tcttgttctg ggccatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtata 1680
tga 1683
<210> 2
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met Glu Thr Val Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Ala Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu
50 55 60
Gly Gln Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Tyr Cys Asp Leu Ser Leu Glu Gly Arg Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn
100 105 110
Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Arg Ser
115 120 125
Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr
130 135 140
Asp Gly Thr Ser Ala Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Lys Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Leu Thr Gln Lys Asn Gly Asp Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr
165 170 175
Thr Asn Asn Gln Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn Gln
180 185 190
Pro Pro Thr Asp Thr Thr Gln Arg Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr
195 200 205
Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Val Phe Lys Pro Leu
210 215 220
Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Phe Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val
275 280 285
Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln
290 295 300
Asn Ile Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile
305 310 315 320
Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser
325 330 335
Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
340 345 350
Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln
355 360 365
Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
370 375 380
Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln
385 390 395 400
Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn
405 410 415
Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu
435 440 445
His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
465 470 475 480
Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu
500 505 510
Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr
515 520 525
Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Ile Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe
530 535 540
Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550 555 560
<210> 3
<211> 2573
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 60
gttacataac ttacggtaaa tggcccgccg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180
gggtggagta tttacggtaa actgcccatt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggatgcag tattttgtgc agcgatgggg 300
gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 360
gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 420
ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc 480
tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 540
ctgactgacc gcgtctagag gggtaccatg gagacagtat cactaataac tatactacta 600
gtagcagcag taagcaatgc agataaaatc tgcatcggct atcaatcaac aaactccaca 660
gaaactgtgg acacactaac agaaaacaat gtccctgtga cacatgccaa agaactgctc 720
cacacagagc ataatgggat gctgtgtgca acaagcttgg gacaacctct tattttagac 780
acctgcacca ttgaagggct aatctatggc aatccttatt gtgatctatc gctggaagga 840
agagaatggt cctatatagt cgagagacca tcagctgtta acggattgtg ttaccccggg 900
aatgtagaaa atctagaaga gttaaggtca ctttttagtt ctgctaggtc ttatcaaaga 960
atccagattt tcccagacac aatctggaat gtatcttacg atgggacaag cgcagcatgc 1020
tcaggttcat tctacaaaag catgagatgg ttgactcaaa agaacggcga ttaccctatc 1080
caagacgccc aatacacaaa taatcaaggg aagaacattc ttttcatgtg gggcataaat 1140
caaccaccca ccgatactac gcagagaaat ctgtacacga gaaccgacac aacaacgagt 1200
gtggcaacag aagaaataaa tagggtcttc aaaccattga taggaccaag gcctcttgtc 1260
aacggtttga tgggaagaat tgattattat tggtcggtat tgaaaccggg tcaaacactg 1320
cgaataaaat ctgatgggaa tctaatagcc ccatggtttg gacacattct ttcaggagag 1380
agccacggaa gaattctgaa gactgattta aaaaggggta gctgcacagt gcaatgtcag 1440
acagagaaag gtggcttgaa cacaacattg ccattccaaa acataagtaa gtatgcattt 1500
ggaaactgct caaaatacat tggcataaag agtctcaaac ttgcagttgg tctgaggaat 1560
gtgccttcta gatctagtag aggactattt ggggccatag cagggtttat agagggaggt 1620
tggtcaggac tagttgctgg ttggtatggg ttccagcatt caaatgacca aggagttggt 1680
atggcagcag atagagactc aacccaaaag gcaattgata aaataacatc caaagtgaat 1740
aatatagtcg acaaaatgaa caagcagtat gaaatcattg atcatgaatt cagtgaggta 1800
gaaactagac ttaacatgat caataataag attgatgatc aaatccagga tatatgggca 1860
tataatgcag aattgctagt tctgcttgaa aaccagaaaa cactcgatga gcacgacgca 1920
aatgtaaaca atctatataa taaagtaaag agggcgttgg gttccaatgc ggtggaagat 1980
ggaaaaggat gtttcgagct ataccacaaa tgtgatgacc aatgcatgga gacaattcgg 2040
aatgggacct acaacagaag gaagtatcga gaggagtcaa aattagaaag acagaaaata 2100
gagggggtca agctggaatc tgaaggaact tacaaaatcc tcaccattta ttcgactgtc 2160
gcctcatctc ttgtgattgc aatggggttt gctgccttct tgttctgggc catgtccaat 2220
gggtcttgca gatgcaacat ttgtatatga ggatccacta gtccagtgtg gtggaattct 2280
gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat 2340
cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 2400
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 2460
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 2520
gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atg 2573
<210> 4
<211> 685
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420
agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480
tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540
aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600
gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660
ctggctagcg tttaaactta agctt 685

Claims (15)

1.一种重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述重组火鸡疱疹病毒是出发火鸡疱疹病毒的基因组进行如下改造得到的：增加了含有H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因的DNA分子；
所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白为如下a1）或a2）：
a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2）在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.如权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因为序列表的序列1所示的DNA分子。
3.如权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述改造的实现方式为：向出发火鸡疱疹病毒的基因组UL区的95322nt-95323nt之间插入特异DNA分子；所述特异DNA分子中含有启动子、所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和终止子。
4.如权利要求3所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述特异DNA分子中还含有增强子；所述增强子位于所述启动子的上游。
5.如权利要求4所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于：所述特异DNA分子自上游至下游依次含有所述增强子、所述启动子、所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和所述终止子。
6.特异DNA分子，所述特异DNA分子中含有启动子、H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和终止子；
所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白为如下a1）或a2）：
a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2）在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
7.如权利要求6所述的特异DNA分子，其特征在于：所述特异DNA分子中还含有增强子；所述增强子位于所述启动子的上游。
8.如权利要求7所述的特异DNA分子，其特征在于：所述特异DNA分子自上游至下游依次含有所述增强子、所述启动子、所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因和所述终止子。
9.H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白，为如下a1）或a2）：
a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2）在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
10.权利要求9所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因。
11.权利要求1至5任一所述重组火鸡疱疹病毒在制备用于预防禽流感病毒的疫苗中的应用。
12.权利要求9所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白在制备用于预防禽流感病毒的疫苗中的应用。
13.权利要求9所述H9N2亚型禽流感病毒H9蛋白的编码基因在制备用于预防禽流感病毒的疫苗中的应用。
14.权利要求6至8任一所述的特异DNA分子在制备用于预防禽流感病毒的疫苗中的应用。
15.一种预防禽流感病毒的疫苗，其含有权利要求1至5任一所述重组火鸡疱疹病毒。
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