CN109374878A - 一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶a2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，步骤一、准备所需药剂：HEPES溶液、1‑豆蔻酰基‑2‑(4‑对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液、氢氧化钠溶液、脂蛋白磷脂酶A2校准液和蒸馏水备用，以及若干份血样，步骤二、HEPES缓冲液调配：称取238.3gHEPES溶液溶解在800ml蒸馏水中，加入1‑2M氢氧化钠水溶液调节至所需pH值，取用蒸馏水定容至1000mL，用带有瓶塞的烧瓶在4摄氏度存放备用，涉及酶法检测技术领域。该酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，通过取用上层悬浮液、中层悬浮液和下层悬浮液进行三种液位的测量，相比于常规实验只取用上层悬浮液，测定的范围更广，可避免因为上层悬浮液测定物含量过少，导致测量不准确的问题。
Description
技术领域
本发明涉及酶法检测技术领域，具体为一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法。
背景技术
肝脏是LP(a)合成的主要场所，apo(a)在肝细胞内合成，能在肝细胞表面和apoB-100结合后分泌到血液中。脂蛋白(a)是一种富含胆固醇的特殊大分子脂蛋白，表面由胆固醇及磷脂包裹，嵌有亲水性载脂蛋白，LP(a)可以进入并沉积在血管壁上，有促进动脉粥样硬化的作用。并与纤溶酶原(PLG)结构同源，可以与纤维酶原竞争结合纤维蛋白位点，从而抑制纤维蛋白原水解作用，促进血栓形成。因此，LP(a)与动脉粥样硬化和血栓形成有着密切的相关性。脂蛋白与其相应的特异抗体作用，产生免疫复合物的浊度用透射法测定，其浊度高低与血清中LP(a)浓度成正比。
现有的生物化学实验中，对于蛋白的检测，通常在检测后会进行取样检测，且通常都取用静置沉淀后的溶液进行测定，但此方法会影响检测的准确性，且实验过程中易出现一些不被重视的影响因素，会造成实验数据的偏差。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，解决了取用静置沉淀后的溶液进行测定，检测不够准确，且实验过程中易出现一些不被重视的影响因素，会造成实验数据偏差的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，具体包括如下步骤：
步骤一、准备所需药剂：HEPES溶液、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液、氢氧化钠溶液、脂蛋白磷脂酶A2校准液和蒸馏水备用，以及若干份血样。
步骤二、HEPES缓冲液调配：称取238.3gHEPES溶液溶解在800ml蒸馏水中，加入1-2M氢氧化钠水溶液调节至所需pH值，取用蒸馏水定容至1000mL，用带有瓶塞的烧瓶在4摄氏度存放备用。
步骤三、血样配置，选取2mL血样，添加8mL蒸馏水，利用蒸馏水使细胞破裂，然后静置15分钟，使血样分层，分别取上层、中层和下层的悬浮液与三只试管中，贴标签备用，且三支试管样品均为1.1mL。
步骤四、脂蛋白磷脂酶A2测定：三种血样试剂均取用1mL、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液100mL和HEPES缓冲液25mL，将1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液与血样混合，置于漩涡振荡器上搅拌均匀，水浴5min，然后向样品中加入HEPES缓冲液，再次使用漩涡振荡器上混合均匀，然后加入脂蛋白磷脂酶A2校准液，调节pH值至7，将混合后的溶液放在恒温箱内恒温反应2min。
步骤五、光谱分析：恒温反应结束后，用光谱仪对反应后的溶液进行光谱分析，读取其初始吸光度，然后连续监测4分钟，将溶液的吸光度变化列表，分析脂蛋白内磷脂酶A2的活性和浓度。
优选的，所述药剂准备步骤中，各预备药剂应在所需基础上留有余量，便于不足时使用。
优选的，所述脂蛋白磷脂酶A2测定工序中，使用恒温箱保温时，温度保持在37℃，且需使用热风式恒温箱，避免加热管产生的热辐射影响反应。
优选的，所述脂蛋白磷脂酶A2测定步骤中，水浴15min时，采用恒温水浴锅，并保持在37℃，时刻用温度计测量温度。
优选的，所述整体实验测定，应同时进行2-3组实验，消除试验中的人为误差。
优选的，所述光谱分析步骤，各组数据应采用同一台光谱仪，消除仪器误差，且需制成对比表格。
优选的，所述整体实验过程应处于无尘环境中，实验人员及器具实验前应消毒杀菌。
(三)有益效果
本发明提供了一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法。与现有技术相比，具备以下有益效果：
(1)、该酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，通过选取2mL血样，添加8mL蒸馏水，利用蒸馏水使细胞破裂，然后静置15分钟，使血样分层，分别取上层、中层和下层的悬浮液与三只试管中，贴标签备用，且三支试管样品均为1.1mL，通过取用上层悬浮液、中层悬浮液和下层悬浮液进行三种液位的测量，相比于常规实验只取用上层悬浮液，测定的范围更广，可避免因为上层悬浮液测定物含量过少，导致测量不准确的问题。
(2)、该酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，通过在脂蛋白磷脂酶A2测定工序中，使用恒温箱保温时，温度保持在37℃，且需使用热风式恒温箱，避免加热管产生的热辐射影响脂蛋白反应，整体实验测定，应同时进行2-3组实验，消除试验中的人为误差，光谱分析步骤，各组数据应采用同一台光谱仪，消除仪器误差，且需制成对比表格，整体实验过程应处于无尘环境中，实验人员及器具实验前应消毒杀菌，针对各种可能影响实验的，且容易被忽视的因素，如辐射等，以及常见的人为因素等，均做出了相应的对策，保证实验的准确性。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种技术方案：一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，具体包括如下步骤：
步骤一、准备所需药剂：HEPES溶液、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液、氢氧化钠溶液、脂蛋白磷脂酶A2校准液和蒸馏水备用，以及若干份血样，药剂准备步骤中，各预备药剂应在所需基础上留有余量，便于不足时使用。
步骤二、HEPES缓冲液调配：称取238.3gHEPES溶液溶解在800ml蒸馏水中，加入1-2M氢氧化钠水溶液调节至所需pH值，取用蒸馏水定容至1000mL，用带有瓶塞的烧瓶在4摄氏度存放备用。
步骤三、血样配置，选取2mL血样，添加8mL蒸馏水，利用蒸馏水使细胞破裂，然后静置15分钟，使血样分层，分别取上层、中层和下层的悬浮液与三只试管中，贴标签备用，且三支试管样品均为1.1mL，选用1.1mL是为了避免倒出血样后，因试剂管内有残留，导致使用的样品不足。
步骤四、脂蛋白磷脂酶A2测定：三种血样试剂均取用1mL、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液100mL和HEPES缓冲液25mL，将1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液与血样混合，置于漩涡振荡器上搅拌均匀，水浴5min，然后向样品中加入HEPES缓冲液，再次使用漩涡振荡器上混合均匀，然后加入脂蛋白磷脂酶A2校准液，调节pH值至7，将混合后的溶液放在恒温箱内恒温反应2min，脂蛋白磷脂酶A2测定工序中，使用恒温箱保温时，温度保持在37℃，且需使用热风式恒温箱，避免加热管产生的热辐射影响反应，脂蛋白磷脂酶A2测定步骤中，水浴15min时，采用恒温水浴锅，并保持在37℃，时刻用温度计测量温度。
步骤五、光谱分析：恒温反应结束后，用光谱仪对反应后的溶液进行光谱分析，读取其初始吸光度，然后连续监测4分钟，将溶液的吸光度变化列表，分析脂蛋白内磷脂酶A2的活性和浓度，整体实验测定，应同时进行2-3组实验，消除试验中的人为误差，光谱分析步骤，各组数据应采用同一台光谱仪，消除仪器误差，且需制成对比表格，整体实验过程应处于无尘环境中，实验人员及器具实验前应消毒杀菌。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤一、准备所需药剂：HEPES溶液、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液、氢氧化钠溶液、脂蛋白磷脂酶A2校准液和蒸馏水备用，以及若干份血样。
步骤二、HEPES缓冲液调配：称取238.3gHEPES溶液溶解在800ml蒸馏水中，加入1-2M氢氧化钠水溶液调节至所需pH值，取用蒸馏水定容至1000mL，用带有瓶塞的烧瓶在4摄氏度存放备用。
步骤三、血样配置，选取2mL血样，添加8mL蒸馏水，利用蒸馏水使细胞破裂，然后静置15分钟，使血样分层，分别取上层、中层和下层的悬浮液与三只试管中，贴标签备用，且三支试管样品均为1.1mL。
步骤四、脂蛋白磷脂酶A2测定：三种血样试剂均取用1mL、1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液100mL和HEPES缓冲液25mL，将1-豆蔻酰基-2-(4-对硝基苯酚丁二酸酐)磷脂酰胆碱溶液与血样混合，置于漩涡振荡器上搅拌均匀，水浴5min，然后向样品中加入HEPES缓冲液，再次使用漩涡振荡器上混合均匀，然后加入脂蛋白磷脂酶A2校准液，调节pH值至7，将混合后的溶液放在恒温箱内恒温反应2min。
步骤五、光谱分析：恒温反应结束后，用光谱仪对反应后的溶液进行光谱分析，读取其初始吸光度，然后连续监测4分钟，将溶液的吸光度变化列表，分析脂蛋白内磷脂酶A2的活性和浓度。
2.根据权利要求1所述的一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，其特征在于：所述药剂准备步骤中，各预备药剂应在所需基础上留有余量，便于不足时使用。
3.根据权利要求1所述的一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，其特征在于：所述脂蛋白磷脂酶A2测定工序中，使用恒温箱保温时，温度保持在37℃，且需使用热风式恒温箱，避免加热管产生的热辐射影响反应。
4.根据权利要求1所述的一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，其特征在于：所述脂蛋白磷脂酶A2测定步骤中，水浴15min时，采用恒温水浴锅，并保持在37℃，时刻用温度计测量温度。
5.根据权利要求1所述的一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，其特征在于：所述整体实验测定，应同时进行2-3组实验，消除试验中的人为误差。
6.根据权利要求1所述的一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，其特征在于：所述光谱分析步骤，各组数据应采用同一台光谱仪，消除仪器误差，且需制成对比表格。
7.根据权利要求1所述的一种酶法检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法，其特征在于：所述整体实验过程应处于无尘环境中，实验人员及器具实验前应消毒杀菌。
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