CN109337828B

CN109337828B - 一种水稻秸秆发酵处理工艺

Info

Publication number: CN109337828B
Application number: CN201811442123.5A
Authority: CN
Inventors: 闫志英; 刘杨; 许力山; 姬高升; 房俊楠; 曾勇; 宦臣臣; 佟欣宇; 赵琪琪
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2021-10-12
Anticipated expiration: 2038-11-29
Also published as: CN109337828A

Abstract

本发明属于生物发酵领域，涉及一种水稻秸秆预处理和干发酵产沼气工艺。技术方案为：一株伞枝犁头菌，保藏编号为CGMCC No.16486。利用所述伞枝犁头菌制备菌剂；按重量比为200:2:1，将干的水稻秸秆、菌剂和尿素混合，调整秸秆水分为60～75％，得发酵底物，装入两相发酵反应器中进行发酵；调整水分时获得的滤液为发酵液；发酵过程中，每天至少使用发酵液对所述发酵底物喷淋一次，单次喷淋所用发酵液的量为所述发酵底物体积的1/3；发酵40～50天，处理完成，根据需要获得发酵产物即可。本发明提供了一种新的伞枝犁头菌属菌株，该菌株可与物理法结合，应用于水稻秸秆处理和发酵，实现绿色环保的资源高效重复利用。

Description

一种水稻秸秆发酵处理工艺

技术领域

本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种水稻秸秆发酵处理工艺。

背景技术

近年来，由于化石燃料大量使用，CO₂等温室气体排放已经造成了强烈的温室效应和气候变化。而随着国家对环境保护和资源利用的关注加深，对再生能源的探索和开发显得越来越重要和急迫。沼气是一种比化石燃料更加稳定、清洁的可再生能源。利用农作物秸秆发酵产沼气不仅有效的处理秸秆，而且还能产生清洁的、便于利用的能源-甲烷，同时产生的副产物沼渣和沼液，因其富含氮和磷等植物营养元素，是优质的有机肥料，用于农业生产，能有效地提高作物产量。这种处理方式不仅能够提升农民生活水平、改善农村能源结构，还能减少污染、保护环境。

我国是农业生产大国，农作物秸秆资源非常丰富。然而，由于农作物秸秆中富含半纤维素、纤维素和木质素等物质，在利用秸秆发酵沼气时，存在发酵周期长、产气率低、秸秆利用率低等问题。目前，主要通过物理、化学和生物法对秸秆进行预处理，促进秸秆发酵产沼气过程、缩短发酵周期。但无论物理法还是化学法都有各自的局限和不足，物理法预处理秸秆成本较高，化学法预处理容易造成二次污染。相较物理法和化学法，生物法处理有成本低和环境友好等优点，但其缺点是处理时间较长。因此，有效的、新型的预处理方式的开发和利用变得更加重要。这些处理能破坏秸秆致密结构，降解其中纤维木质素，缩短处理时间，促进后续的发酵产沼气过程，解决秸秆产沼气的发酵周期长、产气率低、秸秆利用率低等问题。

沼气发酵根据底物浓度不同可分为湿发酵和干发酵。湿法酵具有发酵条件受控制、产气浓度高且稳定、能连续进料等优点，但也存在装置规模较大、秸秆易结壳、搅拌耗能大、沼液量大难处理等缺点。而干发酵虽有占地面积小、处理量大、无污排放、用水量下优势，但由于发酵原料的干物质浓度高，易导致进出料难、传热传质不均匀、易酸中毒等问题。两种处理方式各有优劣，结合两种处理方式的优势，开发出新型的沼气发酵技术对于作物秸秆处理不仅具有重大的社会效益，也具有重大的经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻秸秆发酵处理工艺。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株伞枝犁头菌，于2018年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.16486。

相应的，一株伞枝犁头菌，其18Sr DNA序列测试结果如SEQ ID NO 1所示。

相应的，所述伞枝犁头菌在处理水稻秸秆中的应用。

优选的，所述应用的温度为28～35℃，所述应用的pH为6～8。

相应的，一种水稻秸秆处理工艺，包括如下步骤：

(1)利用所述伞枝犁头菌制备驯化接种物；

(2)将驯化接种物按水稻秸秆发酵底物质量的25～45％进行接种、混匀，并调节水分至70～80％，35℃恒温条件下进行发酵；调节水分时获得的滤液为发酵液；

(3)发酵过程中，每天至少使用发酵液对所述水稻秸秆发酵底物喷淋一次，单次喷淋所用发酵液的量为所述发酵底物体积的1/3。

优选的，所述驯化接种物的制备方法为：将所述伞枝犁头菌按水稻秸秆质量25～45％接种至水稻秸秆上，在发酵池内进行发酵，发酵至发酵池内气体的甲烷体积分数超过60％后，再稳定发酵一周，取发酵池底部污泥，即得驯化接种物。

优选的，所述水稻秸秆经所述伞枝犁头菌预处理后得到水稻秸秆发酵底物，所述预处理的方法为：将所述伞枝犁头菌制备为菌剂，将所述水稻秸秆粉碎至粒径1～2cm，取质量为水稻秸秆干重1％的所述菌剂和质量为水稻秸秆干重0.5％的尿素，将所述水稻秸秆、菌剂和尿素混匀，调节水分至65％～70％，覆膜，35℃恒温条件下处理1～5天，即得水稻秸秆发酵底物。

优选的，所述菌剂的制备方法为：

将所述伞枝犁头菌接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃、120rmp，培养至培养基中长满微小毛球状菌丝体，得种子液；

按质量份数，将7份米糠、1.8份麸皮、1份稻壳、0.2份尿素混匀后调节水分至80％，121℃，6rpm/min条件下灭菌30min，冷却至30℃，得培养基；按种子液体积为培养基体积的10％接种所述种子液，30℃，4rpm/min,通气量1.5vvm，培养至培养基中基质70％～80％被菌丝缠绕包裹，取出培养基及菌丝混合物，即得菌剂。

优选的，发酵过程中，每天定时对水稻秸秆发酵底物喷淋3次，每次喷淋的间隔时间相同。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种新的伞枝犁头菌属菌株(又名伞枝犁头霉)，该菌株从四川成都市双流区永安镇农田中腐烂的水稻秸秆中筛选得到，不会对周围环境与生态平衡造成危害。该菌株可与物理法结合，应用于水稻秸秆处理和发酵，实现绿色环保的资源高效重复利用。

2、水稻秸秆与普通作物秸秆成分有所不同，非常难以发酵，具体成分(平均值)区别见下表1。

表1各类秸秆半纤维素、纤维素和木质素含量

秸秆种类	半纤维素/％	纤维素/％	木质素/％
				玉米秸秆	27.65	38.61	13.82
小麦秸秆	28.14	35.44	14.21
				水稻秸秆	24.28	36.13	23.64

从上表可以看出，水稻秸秆中木质素含量远高于其它秸秆，难以被普通的微生物所利用、降解。

本发明提供了一种利用特定菌种高效处理水稻秸秆产沼气的方法。物理法和生物法联合预处理后，能加快秸秆产沼气进程和提高产量，且预处理过程，受温度影响小，在常温条件下仍具有较好的预处理效果，适用范围广。

3、预处理后的秸秆利用两相厌氧发酵的方式进行产沼气试验，产气周期短、产气量高、甲烷浓度稳定、无污排放，整个工艺可操作性强、无需大型配套设备与技术、投资规模小。

附图说明

图1为伞枝犁头菌属的系统发育树；

图2本发明的流程示意图；

图3为本发明一种实施方式的结构示意图。

具体实施方式

一、筛选并鉴定菌株。

1、筛选菌株

(1)涉及的培养基

1)羧甲基纤维素钠培养基组分为：羧甲基纤维素钠2g、硫酸铵2g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、刚果红0.4g、琼脂18g、水1000mL、pH＝7.0。

2)土豆培养基(PDA培养基)：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000ml、不调pH，121℃灭菌20min。

3)固态发酵扩大培养基：按重量份数，7份米糠，1.8份麸皮，1份稻壳，0.2份尿素，混匀后调节水分至80％，装入固体发酵罐，121℃，6rpm/min条件下灭菌30min。

(2)从四川省成都市双流区永安镇农田中采集腐烂的水稻秸秆。将采集的腐烂的水稻秸秆与去离子水按质量比1:10混匀，稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6 5个梯度，每个稀释梯度下吸取0.05ml于羧甲基纤维素钠培养基平板涂布，30℃恒温培养，当平板上出现白色菌丝体时，挑取菌丝于新的羧甲基纤维素钠培养基平板，待菌丝再次生长起来，再重复上述操作3～5次，获得纯化后的菌株。

2、菌株鉴定

(1)生理生化特征：该菌在PDA培养基中，28～30℃培养，细胞为丝状。在30℃培养2～3天，产生大量菌丝，菌丝初期为纯白色，后期变为灰白色或浅白色。菌丝无隔、多核、分枝状，在培养基内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝，也不产生定形菌落。菌丝体上生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗，并于分枝顶端形成球形孢子囊，内有形状各异的囊轴，无囊托囊内产大量球形、椭圆形、壁薄、光滑的孢囊孢子。孢子成熟后孢子囊即破裂并释放孢子。孢子大小0.6～0.9×1～1.5μm，为椭圆形或球型；适宜生长pH为6～8。

(2)分子生物学鉴定：提取菌株全基因组DNA，PCR扩增18Sr DNA片段，进行测序。其18Sr DNA序列测试结果如SEQ ID NO 1所示。测序结果在NCBI中进行比对，比对结果显示该菌株为伞枝犁头菌属(Lichtheimia corymbifera)。其系统发育树如图1所示。

该菌已于2018年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种名称:伞枝犁头霉(Lichtheimia corymbifera)，保藏编号为CGMCC No.16486。

二、菌株可用于水稻秸秆发酵的定性验证

1、制备菌株种子液。将伞枝犁头菌从平板或斜面接种至10mL牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃恒温、120rmp条件下培养48h，培养基中出现长微小毛球状菌丝体，终止培养，得一级种子液。将所述种子液接种至200mL牛肉膏蛋白胨培养基，培养至培养基中长满微小毛球状菌丝体，终止培养，得二级种子液。

牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000g，pH7.0，121℃条件下灭菌30min。

2、制备发酵菌剂：按质量份数，7份米糠，1.8份麸皮，1份稻壳，0.2份尿素，混匀后调节水分至80％，装入固体发酵罐，121℃，6rpm/min条件下灭菌30min。随后将培养基冷却至30℃，按发酵体积8％接种二级种子液，30℃恒温，转速4rpm/min,通气量1.5vvm条件下培养48～72h，通过发酵罐透视窗观察，培养至培养基中基质70％～80％被菌丝缠绕包裹，则发酵完成，取出培养基及菌丝混合物，即得发酵菌剂。

3、发酵水稻秸秆：将水稻秸秆经粉碎机粉碎至粒径1～2cm。取水稻秸秆2kg，取质量为水稻秸秆干重1％的所述菌剂和水稻秸秆干重0.5％的尿素，将水稻秸秆、菌剂和尿素混匀，调节水分至65％，覆膜，35℃恒温条件下处理5天。(此步骤即为后文中的预处理)。每天定时取样，测定纤维素、半纤维素、木质素含量，其具体变化如表2所示。

表2伞枝犁头菌发酵水稻秸秆效果对比表

处理时间(天)	半纤维素含量	纤维素含量	木质素含量	总含量
					1	23.38％	37.32％	13.94％	74.64％
2	18.73％	35.24％	13.56％	67.03％
					3	14.23％	31.03％	13.11％	58.37％
4	11.42％	29.22％	12.88％	53.52％
					5	10.54％	27.98％	12.78％	51.30％

4、经表1计算可得，处理5天后，半纤维素平均降解率达54.92％，纤维素平均降解率达25.03％,木质素平均降解率达8.32％，木质纤维素平均降解率为31.27％。证明本发明提供的伞枝犁头菌可以有效破坏水稻秸秆致密的纤维结构。

申请人发现，在正式发酵前，先使用上述步骤对水稻秸秆进行预发酵、预处理，更有利于后续的发酵。但预处理发酵时间过长会造成原料的损失。从上表可以看出，秸秆预处理3天后的降解率占整个预处理过程降解率的65％以上，既达到预处理的效果，也不会损失很多原料，所以后续的实施例预处理时间都选择为3天。

三、水稻秸秆预处理及干发酵产沼气工艺步骤

1、按上述方法制备菌株二级种子液。

2、按上述方法制备发酵菌剂。

3、驯化接种物：取运行良好(产气中甲烷气体分数超过60％)的发酵池中污泥，于35℃恒温条件下密闭培养，测量产生气体中甲烷体积分数。气体中甲烷体积分数超过60％，并稳定一周，可作为接种物，即驯化完成。驯化接种物按发酵底物质量的25～45％接种至发酵底物中。

4、使用发酵菌剂对水稻秸秆进行预处理：将水稻秸秆经粉碎机粉碎至粒径1～2cm。取水稻秸秆2kg，取质量为水稻秸秆干重1％的所述菌剂和水稻秸秆干重0.5％的尿素，调节秸秆水分至60～70％，覆膜，35℃恒温条件下处理3～5天。

5、使用驯化物对预处理产物进行两相发酵：将预处理产物(发酵底物)与驯化好的接种物按7:3的比例(质量比)混匀，并调节水分至70～80％，装入两相发酵反应器，35℃恒温条件下运行40～60天，发酵期间使用发酵液对发酵底物进行喷淋，喷淋次数为3次/天，单次喷淋量为发酵底物体积的1/3。

下面结合具体的实施例，展示本发明提供的伞枝犁头菌具体用于水稻秸秆发酵的效果和发酵方法。

实施例一：发酵预处理对水稻秸秆产气的影响

1、伞枝犁头菌发酵预处理：按上述方法制备伞枝犁头菌的菌剂。将水稻秸秆经粉碎机粉碎，粒径1～2cm。取秸秆2kg，取质量为水稻秸秆干重1％的菌剂和水稻秸秆干重0.5％的尿素，调节秸秆水分至65％，覆膜，35℃恒温条件下，预处理3天，作为实验组。其余条件相同，添加相同质量经高温灭菌后的菌剂，作为空白组。

2、将实验组和空白组经预处理后的水稻秸秆发酵产物与驯化接种物混匀，所述驯化接种物的质量为总质量的30％～50％，并调节水分至75％，装入干发酵反应器，分别做三组平行。

空白组共运行62天，实验组运行54天。每天定时取样测定产气量和甲烷气体浓度。具体结果如表3所示，表3中的产气率指的是每千克挥发性固体物质产沼气体积。

表3实验室试验产气结果

组别	产气延滞期	发酵周期	平均产气率	平均甲烷浓度	平均产甲烷率
						空白组	12h	62d	234.91L/kg	44.86％	97.30L/kg
实验组	8h	54d	276.22L/kg	46.25％	114.40L/kg

备注：产气延滞期指的是从反应开始运行到开始产气的时间。平均产甲烷浓度指的是整个产气过程中甲烷体积分数的平均值。

3、从上表可以看出：预处理能促进产气量和产甲烷量。同时，实验组自装入反应器中8h后开始产气，共发酵54d；而空白组第12h才开始产气，发酵62d。空白组在发酵62天后才能勉强达到实验组发酵54天即达到的甲烷浓度，而且实验组的产甲烷率提高了17.5％。这表明预处理能加快发酵进程，缩短发酵周期。

实施例二：发酵方法对水稻秸秆产气的影响

1、使用实施例一实验组的方法对实施例二的实验组和空白组进行相同的预处理。

2、将预处理后的实验组装入两相发酵反应器，将空白组装入干发酵反应器。空白组共运行55天，实验组运行45天。

实验组两相反应器包含滤液喷淋装置。将发酵底物装入反应器后，再加入体积为反应器溶剂体积1/3的去离子水。所述去离子水在重力作用下浸润全部发酵底物，随后浸出，即为发酵底物的水提取物，形成滤液，滤液进入滤液喷淋装置，通过循环系统对发酵底物进行喷淋。每天分别于8:00、14:00、20:00定时进行滤液喷淋(对全部发酵底物进行喷淋)。喷淋到发酵底物上的滤液再次浸润、经过发酵底物后，再次回到滤液喷淋装置，再进行第二天的喷淋，继而循环使用。当然，喷淋的时间并非只能选择上述时间，也可以根据实际情况进行选择。

所述滤液喷淋装置为现有技术，可以根据实际情况进行选择、组装。如图3所示，本发明提供一种可以实现发明目的的喷淋装置及与反应器的连接方式。将所述发酵底物2装在反应器1内部，从反应器1顶部注入去离子水，所述去离子水浸润发酵底物2后，形成滤液6，所述滤液6通过带开关4的管道进入滤液储存室5，所述滤液储存室5通过带抽水泵7的管道8与喷头3连接，所述喷头3设置在反应器1内部、顶部，从而对整个发酵底物进行喷淋。反应过程中产生的沼气通过沼气流量计9计量其体积，然后储存在储气罐10中(图3中只示意出与滤液储存室5相连的沼气流量计9和储气罐10，实际上，整个反应体系都在持续产气，沼气流量计9和储气罐10同时也通过管道与反应器1相连，并可以根据需要设置开关、阀门、抽气泵、止气阀等，技术人员可以根据实际情况和需要进行选择)。当然，这种方式只是一种示例，也可以通过其它等效装置、结构实现上述功能。

每天定时取样测定产气量和甲烷气体浓度。具体结果如表4所示。表中的产气率指的是每千克挥发性固体物质。

表4实验室试验产气结果

组别	产气延滞期	发酵周期	平均产气率	平均甲烷浓度	平均产甲烷率
						空白组	8h	55d	268.77L/kg	47.03％	117.52L/kg
实验组	5h	45d	274.54L/kg	49.22％	125.67L/kg

3、试验结果说明两相发酵方式能促进产气量和产甲烷量，但促进效果的不明显。实验组自装入反应器中5h后开始产气，共发酵45d；而空白组第8h才开始产，发酵55d。这表明：较干发酵方式，两相发酵方式能明显加快发酵进程，缩短发酵周期。

实施例三：不同菌种对水稻秸秆产气的影响

1、使用实施例二的实验组方法进行不同菌种对水稻秸秆产气效果实验。实验处理方式完全相同，仅所用菌种不同。其中，以添加等量经高温灭菌后的菌剂作为空白组。各组具体处理如表5所示。

表5各组具体处理表

2、将预处理后的各组装入两相发酵反应器，每天定时、同时对各组喷淋等量滤液(3次/天)，定时取样测定产气量和甲烷气体浓度。具体结果如表6所示。表中的产气率指的是每千克挥发性固体物质所产沼气的体积。

表6产气结果

组别	产气延滞期	发酵周期	平均产气率	平均甲烷浓度	平均产甲烷率
						空白组	12h	57d	276.42L/kg	46.03％	113.45L/kg
组1	5h	45d	285.54L/kg	51.43％	131.14L/kg
						组2	10h	54d	279.32L/kg	45.85％	117.51L/kg
组3	9h	54d	277.10L/kg	47.11％	117.78L/kg
						组4	10h	53d	281.42L/kg	47.25％	116.32L/kg

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种水稻秸秆发酵处理工艺

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1322

<212> DNA

<213> 伞枝犁头菌属(Lichtheimia corymbifera)

<400> 1

atacagcgaa actgcgaatg gctcattaat tcagttatga tctacacggc atcaaatcta 60

ccacctggat aaccgtggta attctatagc taatacatgc gagagaaatg gcgacttcgg 120

aagccatgca gttattagat acaagccaac ttggggtaaa acccagtctt ggtgactcat 180

agtaacatgc cgatcgaatt gtgtcgacag cacgtttgat tttctgccct atcatggctc 240

tgtgtacggt agtggcgtac actggcagta acgggtaacg gggaataagg gttctattcc 300

ggagagggag cctgagagac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac 360

ccaatcccga catggggagg tagtgacaat acataacaat gcagggcctt tatggtcttg 420

caattggaat gagtacaatt taaatccttt aacgaggatc aattggaggg caagtctggt 480

gccagcagcc gcggtaattc cagctccaat agcgtatatt aaagttgttg cagttaaaac 540

gtccgtagtc gaacgtttgc ctgttgtcca ggcctctcat cattcagttg ttgagtttgg 600

tcttggactg ggcacaaagt ctagatggct tgagtctctc ggggcttgag tctattcact 660

aggcgtatta ccatgagcaa atcagagtgt taaagcaggc tttttaagct tgaacgtgtt 720

agcatggaat aatgaaatat gacccagggt ctatttcgtt ggttttgaga cccaaagtaa 780

tgatgaatag gagtggtcgg gggcatttgt atttcggcgc tagaggtgaa attcttggat 840

tgccggaaga caaactactg cgaaagcatt tgacccagga catctccatt gatcaagggc 900

taaagttgag ggatcgaaga cgattagata ccgtcgtagt cttaaccaca aacgatgccg 960

actagagatc gggcttggct attaaggctt gctcgggatc ttagcgaaag caaagttttt 1020

gggttctggg gggagtacgg ctcgcaaggc tgaaacttaa aggaattgac ggaagggcac 1080

caccaggagt ggagcctgcg gcttaatttg actcaacacg gggaaactca ccaggtccag 1140

acatacggag gattgacaga ttgaaagctc tttctagatt gtatgggtgg tggtgcatgg 1200

ccgttcttag ttcgtggagt gatttgtctg gttaattccg ataacgaacg agaccttatt 1260

ctgctaaata gacagactca ttttttaatg gggttgaaga cttcggtctt tactgtctct 1320

ag 1322

Claims

1.一株伞枝犁头菌(Lichtheimia corymbifera)，于2018年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.16486。

2.权利要求1所述伞枝犁头菌在处理水稻秸秆中的应用。

3.根据权利要求1所述的伞枝犁头菌在处理水稻秸秆中的应用，其特征在于：所述应用的温度为28～35℃，所述应用的pH为6～8。

4.一种水稻秸秆处理工艺，其特征在于：包括如下步骤：

(1)利用权利要求1所述伞枝犁头菌制备驯化接种物；

5.根据权利要求4所述的水稻秸秆处理工艺，其特征在于：所述驯化接种物的制备方法为：将所述伞枝犁头菌按水稻秸秆质量25～45％接种至水稻秸秆上，在发酵池内进行发酵，发酵至发酵池内气体的甲烷体积分数超过60％后，再稳定发酵一周，取发酵池底部污泥，即得驯化接种物。

6.根据权利要求4所述的水稻秸秆处理工艺，其特征在于：所述水稻秸秆经所述伞枝犁头菌预处理后得到水稻秸秆发酵底物，所述预处理的方法为：将所述伞枝犁头菌制备为菌剂，将所述水稻秸秆粉碎至粒径1～2cm，取质量为水稻秸秆干重1％的所述菌剂和质量为水稻秸秆干重0.5％的尿素，将所述水稻秸秆、菌剂和尿素混匀，调节水分至65％～70％，覆膜，35℃恒温条件下处理1～5天，即得水稻秸秆发酵底物。

7.根据权利要求6所述的水稻秸秆处理工艺，其特征在于：所述菌剂的制备方法为：

8.根据权利要求5～7任意一项所述的水稻秸秆处理工艺，其特征在于：发酵过程中，每天定时对水稻秸秆发酵底物喷淋3次，每次喷淋的间隔时间相同。