CN109336967A - 基于混合填料的抗体纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质分离技术领域，尤其是涉及一种基于混合填料的抗体纯化方法。所述基于混合填料的抗体纯化方法，包括如下步骤：利用混合填料层析柱对含目标抗体粗品进行纯化，混合填料包括阴离子交换层析介质和疏水层析介质。本发明的抗体纯化方法，通过将阴离子交换层析介质与疏水层析介质混合使用得到混合填料，采用混合填料一步法对抗体进行精纯处理，可以与蛋白产生多种相互作用，充分利用混合填料吸附容量大、选择性好等优点，分离效率高，简化分离步骤，降低分离成本，目标抗体回收率高，能有效的去除高聚体等杂质，解决了现有技术中无法兼顾目标抗体纯度和回收率的问题。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质分离技术领域，尤其是涉及一种基于混合填料的抗体纯化方法。
背景技术
抗体是能与抗原特异性结合的一类蛋白，参与了机体的免疫过程，在医药、食品、环境和农业等领域有着重要的应用。特别是医药领域，单克隆抗体具有专一性强、治疗效果显著和毒副作用小等优点，广泛应用于自身免疫性疾病、癌症等重大疾病的诊断和治疗。随着市场需求的显著增加，抗体制备生产的过程越来越受到关注。
抗体药物的下游制备工艺主要包括抗体捕获和精制纯化两个阶段。发酵液上清液经亲和层析后，产品纯度一般可达到90％的单体纯度。但是，药用抗体纯度要求高，抗体经捕获后，产品成分仍较复杂，含DNA、聚体和宿主细胞蛋白等多种杂质，一般需再经阴离子交换、阳离子交换层析和疏水作用层析进一步除杂。但是，精制纯化阶段需要各种柱层析法联用，遇到诸如纯化过程复杂、步骤多、或者成本高等问题。因此，需要研究抗体精制纯化的新方法。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于混合填料的抗体纯化方法，该方法通过将阴离子交换层析介质与疏水层析介质混合使用得到混合填料，采用混合填料一步法对抗体进行精纯处理，充分利用混合填料吸附容量大、选择性好等优点，分离效率高，简化分离步骤，降低分离成本。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
基于混合填料的抗体纯化方法，包括如下步骤：
利用混合填料层析柱对含目标抗体粗品进行纯化，混合填料包括阴离子交换层析介质和疏水层析介质。
本发明的抗体纯化方法，通过将阴离子交换层析介质与疏水层析介质混合使用得到混合填料，采用混合填料一步法对抗体进行精纯处理，充分利用混合填料吸附容量大、选择性好等优点，分离效率高，简化分离步骤，降低分离成本。
采用混合填料，可以与蛋白产生多种相互作用，较单一的阴离子交换作用或疏水作用，目标抗体回收率高，能有效的去除高聚体等杂质，解决了现有技术中无法兼顾目标抗体纯度和回收率的问题。
综上，与现有技术相比，本发明的抗体纯化方法，操作工序简单，通过一步法即可实现对目标抗体的精纯，且吸附容量大、处理量高，抗体纯度高，回收率高。
优选的，阴离子交换层析介质和疏水层析介质的体积比为5﹕1～1﹕5，优选3﹕1～1﹕3。
优选的，阴离子交换层析介质包括POROS 50HQ、Capto Q和Capto Q ImpRes中的任一种或多种，优选为POROS 50HQ。
优选的，疏水层析介质包括Capto Butyl ImpRes、Capto Octyl和POROS Ethyl中的任一种或多种，优选为Capto Butyl ImpRes。
POROS 50HQ介质是Thermo Fisher Scientific公司开发的一种强阴离子交换介质，以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球为基质，季铵化聚乙烯亚胺为配基。Capto ButylImpRes介质是GE公司开发的一种疏水层析介质，以琼脂糖微球为基质，丁基为配基。采用两种介质复配，能够充分发挥阴离子交换作用和疏水作用，进一步提高混合填料对杂质的吸附作用，提高杂质去除率，同时提高目标抗体的洗脱效率，保证回收率。
优选的，纯化采用的平衡缓冲液为Tris-醋酸缓冲液。更优选的，平衡缓冲液的pH为7.1-7.9，优选为7.3-7.6，更优选为7.5；平衡缓冲液的浓度为45-55mM，优选为50-55mM，更优选为50mM。
采用上述平衡缓冲液能够保证，高聚体等杂质吸附于层析柱，而目标抗体流穿，从而提高流穿液中目标抗体的纯度，提高收率，同时提高杂质去除率。
本发明的纯化方法主要适用于抗体的纯化，尤其是单抗的纯化，尤其是中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体的纯化。当目标抗体为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体时，平衡缓冲液为Tris-醋酸、pH7.1-7.9的缓冲液，优选浓度为50-55mM Tris-醋酸缓冲液。
优选的，混合填料的装柱高度为4.8-6.0cm，优选5.0-5.4cm，更优选5.2cm。
优选的，纯化方法的操作线性流速为80-160cm/h，优选100-120cm/h，更优选110cm/h。
填料的装柱高度和流速是影响纯化效率和纯度的关键参数，经优化，采用以上条件纯化效率大幅度提高，单位时间单位填料体积的处理量显著提高，同时兼顾保证高的目标抗体纯度。
优选的，含目标抗体粗品的制备方法包括：含目标抗体的细胞发酵液，经深层过滤、蛋白A亲和层析，进行病毒灭活，调节pH至7.5±0.5后，进行深层过滤，得到含目标抗体粗品。蛋白A亲和层析的方法包括，通过蛋白A亲和捕获，然后用酸性缓冲液将目标抗体洗脱，收集得到含目标抗体的洗脱液。向含目标抗体的洗脱液添加酸性溶液，将洗脱液的pH调至3.5-3.7，于25℃保持约2h后，用碱性溶液中和洗脱液pH至7.0-7.5左右，进一步深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
优选的，制备含目标抗体粗品溶液时，采用的酸性缓冲液为pH为3.7±0.3的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，优选为3.7。
优选的，调节洗脱液pH至3.5-3.7采用的酸性溶液为醋酸溶液，中和洗脱液pH至7.0-7.5采用的碱性溶液为Tris溶液。
本发明采用的深层过滤，优选为两级深层过滤，包括初级深层过滤和二级深层过滤。进一步优选采用两个串联的过滤器进行两级深层过滤，含目标抗体的溶液经过初级深层过滤器过滤后，再经过二级深层过滤器进行过滤。初级深层过滤器可选用MilliporeD0HC，二级深层过滤器可选用Millipore A1HC。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的抗体纯化方法，通过将阴离子交换层析介质与疏水层析介质混合使用得到混合填料，采用混合填料一步法对抗体进行精纯处理，充分利用混合填料吸附容量大、选择性好等优点，分离效率高，简化分离步骤，降低分离成本；
(2)本发明采用混合填料，可以与蛋白产生多种相互作用，较单一的阴离子交换作用或疏水作用，目标抗体回收率高，能有效的去除高聚体等杂质，解决了现有技术中无法兼顾目标抗体纯度和回收率的问题；
(3)通过优化纯化方法中的其他工艺参数，进一步改善了对杂质的去除率，提高目标抗体纯度，并提高回收率。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的基于混合填料的抗体纯化方法，包括如下步骤：
样品来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体。
取含有单克隆抗体的细胞发酵液，经串联的Millipore D0HC和Millipore A1HC两级深层过滤器进行深层过滤去除细胞碎片及部分杂质，随后通过亲和树脂捕获，采用醋酸-醋酸钠、pH3.7的酸性缓冲溶液将目标抗体洗脱，收集洗脱液；
向洗脱液中加入醋酸溶液，调节洗脱液的pH至3.7，于25℃条件下保持2h后，用Tris溶液中和洗脱液pH至7.5，进一步通过两级深层过滤器进行深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
预装层析柱(Millipore Vantage)，内径1.1cm，填充5.2mL的体积比为3﹕1的POROS50HQ和Capto Butyl ImpRes混合填料介质，操作线性流速为110cm/h。用平衡缓冲溶液(50mM Tris-HAc，pH 7.5)平衡层析柱，然后上样，样品来源为上步得到的含目标抗体粗品溶液，待样品开始穿透，收集流穿液，得到单克隆抗体纯品，SEC分析纯度为99.6％，收率为95.7％，高聚体含量下降了50.8％。
实施例2
本实施例的基于混合填料的抗体纯化方法，包括如下步骤：
样品来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体。
取含有单克隆抗体的细胞发酵液，经串联的Millipore D0HC和Millipore A1HC两级深层过滤器进行深层过滤去除细胞碎片及部分杂质，随后通过亲和树脂捕获，采用醋酸-醋酸钠、pH3.7的酸性缓冲溶液将目标抗体洗脱，收集洗脱液；
向洗脱液中加入醋酸溶液，调节洗脱液的pH至3.7，于25℃条件下保持2h后，用Tris溶液中和洗脱液pH至7.5，进一步通过两级深层过滤器进行深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
预装层析柱(Millipore Vantage)，内径1.1cm，填充5.2mL的体积比为1﹕1的POROS50HQ和Capto Butyl ImpRes混合填料介质，操作线性流速为110cm/h。用平衡缓冲溶液(50mM Tris-HAc，pH 7.5)平衡层析柱，然后上样，样品来源为上步得到的含目标抗体粗品溶液，待样品开始穿透，收集流穿液，得到单克隆抗体纯品，SEC分析纯度为99.0％，收率为95.1％，高聚体含量下降了55.5％。
实施例3
本实施例的基于混合填料的抗体纯化方法，包括如下步骤：
样品来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体。
取含有单克隆抗体的细胞发酵液，经串联的Millipore D0HC和Millipore A1HC两级深层过滤器进行深层过滤去除细胞碎片及部分杂质，随后通过亲和树脂捕获，采用醋酸-醋酸钠、pH3.7的酸性缓冲溶液将目标抗体洗脱，收集洗脱液；
向洗脱液中加入醋酸溶液，调节洗脱液的pH至3.7，于25℃条件下保持2h后，用Tris溶液中和洗脱液pH至7.5，进一步通过两级深层过滤器进行深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
预装层析柱(Millipore Vantage)，内径1.1cm，填充5.2mL的体积比为1﹕3的POROS50HQ和Capto Butyl ImpRes混合填料介质，操作线性流速为110cm/h。用平衡缓冲溶液(50mM Tris-HAc，pH 7.5)平衡层析柱，然后上样，样品来源为上步得到的含目标抗体粗品溶液，待样品开始穿透，收集流穿液，得到单克隆抗体纯品，SEC分析纯度为99.7％，收率为93.8％，高聚体含量下降了64.3％。
实施例4
本实施例的基于混合填料的抗体纯化方法，包括如下步骤：
样品来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体。
取含有单克隆抗体的细胞发酵液，经串联的Millipore D0HC和Millipore A1HC两级深层过滤器进行深层过滤去除细胞碎片及部分杂质，随后通过亲和树脂捕获，采用醋酸-醋酸钠、pH3.7的酸性缓冲溶液将目标抗体洗脱，收集洗脱液；
向洗脱液中加入醋酸溶液，调节洗脱液的pH至3.7，于25℃条件下保持2h后，用Tris溶液中和洗脱液pH至7.5，进一步通过两级深层过滤器进行深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
预装层析柱(Millipore Vantage)，内径1.1cm，填充5.2mL的体积比为5﹕1的POROS50HQ和Capto Butyl ImpRes混合填料介质，操作线性流速为110cm/h。用平衡缓冲溶液(50mM Tris-HAc，pH 7.5)平衡层析柱，然后上样，样品来源为上步得到的含目标抗体粗品溶液，待样品开始穿透，收集流穿液，得到单克隆抗体纯品，SEC分析纯度为98.8％，收率为96.8％，高聚体含量下降了30.6％。
实施例5
本实施例的基于混合填料的抗体纯化方法，包括如下步骤：
样品来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体。
取含有单克隆抗体的细胞发酵液，经串联的Millipore D0HC和Millipore A1HC两级深层过滤器进行深层过滤去除细胞碎片及部分杂质，随后通过亲和树脂捕获，采用醋酸-醋酸钠、pH3.7的酸性缓冲溶液将目标抗体洗脱，收集洗脱液；
向洗脱液中加入醋酸溶液，调节洗脱液的pH至3.7，于25℃条件下保持2h后，用Tris溶液中和洗脱液pH至7.5，进一步通过两级深层过滤器进行深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
预装层析柱(Millipore Vantage)，内径1.1cm，填充5.2mL的体积比为1﹕5的POROS50HQ和Capto Butyl ImpRes混合填料介质，操作线性流速为110cm/h。用平衡缓冲溶液(50mM Tris-HAc，pH 7.5)平衡层析柱，然后上样，样品来源为上步得到的含目标抗体粗品溶液，待样品开始穿透，收集流穿液，得到单克隆抗体纯品，SEC分析纯度为99.5％，收率为90.2％，高聚体含量下降了71.6％。
比较例1
样品来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体。取含有单克隆抗体的细胞发酵液，经串联的Millipore D0HC和Millipore A1HC两级深层过滤器进行深层过滤去除细胞碎片及部分杂质，随后通过亲和树脂捕获，采用醋酸-醋酸钠、pH3.7的酸性缓冲溶液将目标抗体洗脱，收集洗脱液；
向洗脱液中加入醋酸溶液，调节洗脱液的pH至3.7，于25℃条件下保持2h后，用Tris溶液中和洗脱液pH至7.5，进一步通过两级深层过滤器进行深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
预装层析柱(Millipore Vantage)，内径1.1cm，填充5.2mL的POROS50HQ介质，操作线性流速为110cm/h。用平衡缓冲溶液(50mM Tris-HAc，pH 7.5)平衡层析柱，然后上样，样品来源为上步得到的含目标抗体粗品溶液，待样品开始穿透，收集流穿液，得到单克隆抗体纯品，SEC分析纯度为98.2％，收率为98.7％，高聚体含量下降了13.7％。
比较例2
样品来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体。取含有单克隆抗体的细胞发酵液，经串联的Millipore D0HC和Millipore A1HC两级深层过滤器进行深层过滤去除细胞碎片及部分杂质，随后通过亲和树脂捕获，采用醋酸-醋酸钠、pH3.7的酸性缓冲溶液将目标抗体洗脱，收集洗脱液；
向洗脱液中加入醋酸溶液，调节洗脱液的pH至3.7，于25℃条件下保持2h后，用Tris溶液中和洗脱液pH至7.5，进一步通过两级深层过滤器进行深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
预装层析柱(Millipore Vantage)，内径1.1cm，填充5.2mL的Capto Butyl ImpRes介质，操作线性流速为110cm/h。用平衡缓冲溶液(50mM Tris-HAc，pH 7.5)平衡层析柱，然后上样，样品来源为上步得到的含目标抗体粗品溶液，待样品开始穿透，收集流穿液，得到单克隆抗体纯品，SEC分析纯度为99.4％，收率为87.5％，高聚体含量下降了75.7％。
比较例3
样品来源为中国仓鼠卵巢细胞表达重组抗体。取含有单克隆抗体的细胞发酵液，经串联的Millipore D0HC和Millipore A1HC两级深层过滤器进行深层过滤去除细胞碎片及部分杂质，随后通过亲和树脂捕获，采用醋酸-醋酸钠、pH3.7的酸性缓冲溶液将目标抗体洗脱，收集洗脱液；
向洗脱液中加入醋酸溶液，调节洗脱液的pH至3.7，于25℃条件下保持2h后，用Tris溶液中和洗脱液pH至7.5，进一步通过两级深层过滤器进行深层过滤，得到澄清的含目标抗体粗品溶液。
预装层析柱(Millipore Vantage)，内径1.1cm，分别填充5.2mL的POROS 50HQ和Capto Butyl ImpRes介质，串联使用，操作线性流速为110cm/h。用平衡缓冲溶液(50mMTris-HAc，pH 7.5)平衡层析柱，然后上样，样品来源为上步得到的含目标抗体粗品溶液，待样品开始穿透，收集流穿液，得到单克隆抗体纯品，SEC分析纯度为99.6％，收率为85.3％，高聚体含量下降了78.9％。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用混合填料层析柱对含目标抗体粗品进行纯化，所述混合填料包括阴离子交换层析介质和疏水层析介质。
2.根据权利要求1所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析介质和所述疏水层析介质的体积比为5﹕1～1﹕5；
优选的，所述阴离子交换层析介质和所述疏水层析介质的体积比为3﹕1～1﹕3。
3.根据权利要求1所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析介质包括POROS 50HQ、Capto Q和Capto Q ImpRes中的任一种或多种；
优选的，所述阴离子交换层析介质为POROS 50HQ。
4.根据权利要求1所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述疏水层析介质包括Capto Butyl ImpRes、Capto Octyl和Poros Ethyl中的任一种或多种；
优选的，所述疏水层析介质为Capto Butyl ImpRes。
5.根据权利要求1所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述纯化中，采用的平衡缓冲液为Tris-醋酸缓冲液；
优选的，所述平衡缓冲液的pH为7.1-7.9；
更优选的，所述平衡缓冲液的pH为7.3-7.6。
6.根据权利要求5所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为45-55mM Tris-醋酸缓冲液；
更优选的，所述平衡缓冲液为50-55mM Tris-醋酸缓冲液。
7.根据权利要求1所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述混合填料的装柱高度为4.8-6.0cm；
优选的，所述混合填料的装填高度为5.0-5.4cm。
8.根据权利要求1所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述纯化的操作线性流速为80-160cm/h；
优选的，所述纯化的操作线性流速为100-120cm/h。
9.根据权利要求1所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述含目标抗体粗品的制备方法包括：含目标抗体的细胞发酵液，经深层过滤、蛋白A亲和层析，进行病毒灭活，调节pH至7.5±0.5后，进行深层过滤，得到所述含目标抗体粗品。
10.根据权利要求9所述的基于混合填料的抗体纯化方法，其特征在于，所述深层过滤为两级深层过滤；
优选的，所述深层过滤包括分别通过Millipore D0HC和Millipore A1HC进行两级深层过滤。
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