CN109295126A - 一种具有免疫调节活性的植物乳杆菌胞外多糖及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物学中的多糖技术领域，具体涉及到一种微生物胞外多糖，特别是涉及一种植物乳杆菌来源的具有免疫调节活性的乳酸菌多糖及其制备方法。所述制备方法，包括通过该植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum DL7X）发酵获得胞外多糖、粗多糖的提取、胞外多糖的分离及纯化，得到具有免疫调节活性的胞外多糖均一组分。本发明采用离子交换和分子筛色谱分离纯化得到均一组分EPS3；以脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7构建炎症细胞模型，EPS3（20‑100μg/ml）能够剂量依赖性地抑制脂多糖诱导RAW264.7产生NO；且在转录水平上对iNOS和TNF‑αmRNA有负向调节作用，表明DL7X胞外多糖EPS3为有效的免疫调节活性多糖，这些结果为将该菌株更好地应用于发酵食品工业和制备功能性食品提供了新的选择。

Description

一种具有免疫调节活性的植物乳杆菌胞外多糖及制备方法

技术领域

本发明属于微生物学中的多糖技术领域，具体涉及到一种微生物胞外多糖，特别是涉及一种植物乳杆菌来源的具有免疫调节活性的乳酸菌胞外多糖及其制备方法。

背景技术

乳酸菌（LAB）胞外多糖（Exopolysaccharides, EPS）是乳酸菌在生长、代谢过程中分泌到细胞壁外的黏液或荚膜多糖的总称。自然界产胞外多糖的乳酸菌来源十分广泛，如乳制品、发酵食品、动物肠道等。近年来研究发现，乳酸菌来源的胞外多糖是食品级多糖的良好来源，LAB EPS具有重要的工艺学功能，可作为增稠剂、稳定剂、持水剂等应用到食品、医药及生化产品等领域，特别在发酵乳制品生产应用中，对酸乳、干酪及绝大多数发酵乳制品的流变、质构、口感及风味具有重要的影响。此外，研究表明EPS具有多种生理功能，包括抗氧化、降血压、抗肿瘤、改善肠道微生态环境和增强人体免疫力等。其中，乳杆菌常作为辅助发酵剂用于发酵食品工业中。乳杆菌在发酵过程中，EPS的原位生成既能改善产品质构和口感，也能赋予产品营养和保健功效。因此，近年来国内外针对高产胞外多糖乳酸菌的开发应用开展了大量的研究工作。

其中，关于具有免疫调节活性的乳酸菌胞外多糖的研究受到广泛关注，LAB EPS通常通过增强细胞介导的免疫反应，如促进T/B淋巴细胞增殖、单核细胞吞噬能力、释放细胞因子等，从而增强宿主的免疫防护作用。但研究发现，不同菌株产生的EPS的免疫活性差别很大，受到单糖组成、分子量、功能团、所带电荷等多方面因素的影响，如研究发现较小分子量和酸性多糖往往显示出免疫刺激活性，而较大分子量的中性多糖则显示出免疫抑制作用。由于LAB EPS具有菌株特异性，不同菌株产生的多糖差异性很大，不同的多糖具有各自特定的功能，因此研究新分离菌株的LAB EPS的免疫活性很有必要，能够为功能乳酸菌菌株的应用和功能性食品的开发等提供理论依据。

本发明中的植物乳杆菌DL7X，是从四川传统家庭自制泡菜中筛选获得的一株高产胞外多糖乳酸菌。菌株的分类名称：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 13331，保藏日期：2016年11月22日。

发明内容

本发明公开了一种植物乳杆菌胞外多糖，其由植物乳杆菌L. plantarum DL7X菌株发酵而得。优选的方法为：将植物乳杆菌L. plantarum DL7X菌株在半合成化学培养基（SDM）中37 °C静置恒温培养，发酵液沸水浴灭活15 min，然后离心获得胞外多糖上清液，然后通过三氯乙酸除蛋白、乙醇沉淀、透析等步骤得到粗多糖，粗多糖经过DEAE SepharoseCL-6B离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱层析的方法纯化，即得。更优选的方法为：将植物乳杆菌DL7X （CGMCC No. 13331）在SDM培养基中37 °C恒温静置培养18~24 h，培养液首先通过沸水浴灭活15 min，然后离心除去菌体获得上清液，上清液经三氯乙酸法除蛋白，离心除去蛋白沉淀，然后用3-5倍体积的预冷乙醇沉淀，真空冷冻干燥后获得粗多糖；所述粗多糖经过DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析纯化，流动相为20 mM Tris-HCl (pH7.60)和0.2～1.0 M NaCl，流速为1.0 mL/min；洗脱组分透析、真空干燥等获得初步纯化的多糖组分，然后运用脂多糖诱导的巨噬细胞RAW264.7评价各组分的抗炎活性；以上述活性评价结果为依据，选择活性最强的组分进行Sephadex G-100分子筛层析，流动相为超纯水，流速为0.25 mL/min；洗脱组分经截留分子量为8000~14000 Da的透析袋透析3天，透析截留液经真空冷冻干燥，即得。

该菌株在1 L的SDM培养基中进行恒温静置培养，粗多糖产量可达到362.5 mg/L。培养后的粗多糖经DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析的方法纯化后得到一种带酸性离子基团的水溶性胞外多糖组分EPS3，其分子量为2.02×10⁴Da。体外活性实验表明，在以脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7构建的炎症细胞模型中，用Griess Kit检测炎症状态下细胞产生的NO，初步鉴定其抗炎活性；其次，进一步用PCR检测EPS3对炎症因子iNOS和TNF-α mRNA的抑制作用。结果显示本发明植物乳杆菌DL7X所产胞外多糖组分EPS3能够显著抑制脂多糖诱导巨噬细胞中NO产生和iNOS及TNF-α mRNA的表达，在作为免疫抑制剂，抗炎药物及相关功能食品开发方面具有广阔的应用价值。

体外巨噬细胞炎症模型的抗炎活性测试表明，本发明的植物乳杆菌胞外多糖EPS3具有显著抑制脂多糖诱导巨噬细胞中NO产生和抑制相关炎症因子（iNOS和TNF-α）mRNA表达的活性。所述的巨噬细胞为鼠源巨噬细胞RAW 264.7细胞。

下面是本发明多糖的体外活性试验及结果：

以脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7构建炎症细胞模型，评价胞外多糖的抗炎活性。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（37 °C、5% CO₂）培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7并对其分组。空白对照组：不用LPS处理也不加多糖干预；模型对照组：加入0.5 μg/mL的LPS干预；实验组：0.5 μg/mL的LPS与不同浓度的植物乳杆菌胞外多糖组分EPS3（终浓度分别25、50、100 μg/mL）共同处理。

NO 分泌水平测定：采用Griess法对NO₂定量间接检测NO生成。细胞接种于96孔培养板，各组细胞在不同处理因素作用24 h后，每孔取细胞培养液50 μL，用Griess试剂测试，酶标仪550 nm下测吸光值。根据NaNO₂制得的标准曲线计算培养基中NO的生成量。结果见附图2。

植物乳杆菌胞外多糖EPS3在25~100 μg/ml计量范围内对巨噬细胞活力在统计学上没有明显的影响。因此本实验选取的最大剂量100 μg/ml对巨噬细胞来说是安全的。由图2可以看出，正常状态下，巨噬细胞产生NO的量处于基础水平。在受到EPS刺激时，NO产生显著增加（与正常组相比，P＜0.01）。不同浓度EPS3孵育RAW 264.7巨噬细胞后剂量依赖性抑制LPS诱导的NO分泌，当在EPS3浓度为100 μg/ml时能够抑制约40%的LPS诱导的NO分泌。

细胞因子mRNA表达水平的测定：采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术分析植物乳杆菌胞外多糖EPS3对LPS诱导的iNOS，IL-6 mRNA表达的影响，取指数生长期细胞，加于24孔细胞培养板内，调整细胞悬液浓度为2.5×10⁵ cells/well，置37 °C、5%CO₂培养箱培养24 h，之后每孔加入25、50、100 μg/ml的EPS3并孵育2 h，然后加入LPS使其终浓度为0.5 μg/ml，置37 °C继续培养24 h。用Trizol试剂提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，采用特定引物，在荧光定量PCR仪上用相应的引物、cDNA等材料按步骤进行扩增，采用2^−ΔΔCt相对定量法进行基因表达分析。

EPS3对LPS诱导巨噬细胞中的细胞因子mRNA表达的影响：如图3所示，在正常情况下，iNOS、TNF-α mRNA的表达均很少，而经过LPS刺激之后，其表达量显著提高。而植物乳杆菌胞外多糖EPS3对iNOS mRNA表达具有明显的抑制，并具有浓度依赖性。EPS3在100 μg/ml剂量时对iNOS mRNA表达的抑制率约50%。此外，EPS3对TNF-α mRNA的表达也呈现一定程度的抑制，但并不具有浓度依赖性，抑制效果相比iNOS mRNA也更差，在100 μg/ml剂量时抑制率为28.6%。诸多研究表明，在巨噬细胞内，NO主要是在诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）催化下产生，高表达的iNOS以及过度产生的NO，参与了炎症性疾病的发生与发展。本研究以脂多糖刺激的RAW 264.7巨噬细胞为炎症细胞模型，探讨植物乳杆菌胞外多糖EPS3对LPS激活的巨噬细胞NO的释放。结果显示EPS3在25-100 μg/ml剂量范围内，剂量依赖性地抑制脂多糖诱导的巨噬细胞产生NO。进一步研究发现在转录水平上EPS3对iNOS和TNF-α mRNA有负向调节作用。

附图说明

图1是植物乳杆菌DL7X在DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱和EPS-3在Sephadex G-100凝胶柱层析上的洗脱曲线。

图2是EPS3抑制脂多糖诱导的巨噬细胞产生NO。

图3是EPS3抑制巨噬细胞iNOS和TNF-α mRNA的表达。

具体实施方式

具有免疫调节活性的植物乳杆菌DL7X胞外多糖EPS3的发酵制备

1、植物乳杆菌胞外多糖DL7X在2 L发酵瓶中发酵培养

（1）种子液的培养

将实验所需的菌株从-80 °C保藏的甘油管中划线至MRS平板活化，置于37 °C培养箱中培养24 h后，用接种环挑取单菌落至5 ml MRS液体培养基，置于37 °C培养箱中培养16 h后，转接至50 ml MRS液体培养基，置于37 °C培养基中培养16 h后，备用。

（2）发酵培养基的配制

配制2 L半合成化学培养基（SDM）：在MRS培养基础上进行改良，其中用酵母基础氮源（yeast nitrogen base，5 g/L）、蛋白胨（bacto casitone，10 g/L）替代MRS培养基配方中的牛肉膏提取物、酵母提取物、蛋白胨，其他组分及含量一致，于121 °C高压灭菌15 min，冷却后置于常温备用。

（3）SDM培养基发酵培养

将MRS液体培养基中16 h种子培养物以3%~5%接种量（v/v）接种至2 L SDM培养基中，置于恒温培养箱中37 °C培养24 h。

2、植物乳杆菌胞外粗多糖的提取

将2 L发酵液沸水浴加热15 min，灭活残余菌体。之后将2 L灭活菌体的发酵液取出冷却到室温，4 °C 12000 × g离心20 min去除沉淀。向上清液中加入质量分数为80%的三氯乙酸至终浓度为质量分数4%，放4 °C冰箱静置过夜，4 °C 12000 × g离心20 min收集上清液。加入3～5 倍体积预冷的95%乙醇于上清液，充分振荡，多糖呈絮状沉淀析出，4 °C冰箱静置过夜。待多糖呈絮状沉淀充分析出后，4 °C 12000 × g离心20 min收集多糖沉淀。将多糖沉淀用热水溶解后转移到透析袋中，放4 °C冰箱用去离子水透析3 d，间隔4 h换一次水。透析完成后将多糖溶液进行真空冷冻干燥后获得干燥的白色蓬松粗多糖。

3、植物乳杆菌胞外精制多糖的制备

将DEAE-Sepharose CL-6B离子胶装入层析柱（D2.6×30 cm）中，用Tris-HCl洗脱液（20mM，pH 7.60）平衡层析柱。粗多糖用Tris-HCl缓冲液溶解后上样，上样浓度为10 mg/mL，上样品70 mg，依次用Tris-HCl洗脱液和含0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl的洗脱液梯度洗脱，流速：2.5 mL/min，每管收集体积：5 mL。苯酚-硫酸法检测收集管中多糖含量，合并收集峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥得到多糖样品。结果见图1A，由图可见，植物乳杆菌DL7X胞外多糖主要由四个酸性多糖组分构成。然后以以免疫调节活性评价结果为依据，获得活性最强的多糖组分EPS-3。

将上述得到的组分再分别进一步在Sephadex G-100凝胶柱（D1.0×100 cm）上进行分离。洗脱液：超纯水；上样浓度：10 mg/mL，上样量：20~25 mg。流速：0.20 mL/min，每管收集体积：3.0 mL。苯酚-硫酸法检测收集管中多糖含量，合并收集各峰组分，经透析、浓缩、冷冻干燥得到多糖样品。结果见图1B，由图可见，DEAE Sepharose CL-6B 阴离子交换柱中NaCl洗脱出的盐洗组分EPS-3进一步通过Sephadex G-100凝胶柱层析进行纯化得到单一、对称的洗脱峰，说明植物乳杆菌胞外多糖EPS3是均一的单糖组分，该组分经检测不含蛋白。

透析冻干：选择截留分子量为8000-14000 Da的透析袋，加入上述分子筛洗脱得到的收集液，透析3天，真空冷冻干燥后得到纯化多糖EPS3，称量标记并保存。经理化特性分析，其分子量为2.02×10⁴ Da，多糖含量为85.36%，水分含量10.41%，不含蛋白质及磷酸根。

以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。

Claims (3)

1.一种具有免疫调节活性的植物乳杆菌胞外多糖，其由植物乳杆菌（L. plantarum）DL7X（CGMCC No. 13331）菌株发酵而得。

2.权利1要求的植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括：将权利要求1的植物乳杆菌菌株在半合成化学培养基（SDM）中37 °C静置恒温培养，发酵液沸水浴灭活15 min，离心获得胞外多糖上清液，然后通过三氯乙酸除蛋白、乙醇沉淀、透析等步骤得到粗多糖，粗多糖经过DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱层析的方法纯化，即得。

3.权利要求2的制备方法，包括：将植物乳杆菌DL7X（CGMCC No. 13331）在SDM培养基中37 °C恒温静置培养18~24 h，培养液首先通过沸水浴灭活15 min，然后离心除去菌体获得上清液，上清液经三氯乙酸法除蛋白，离心除去蛋白沉淀，然后用3~5倍体积的预冷乙醇沉淀，真空冷冻干燥后获得粗多糖；所述粗多糖经过DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析纯化，流动相为20 mM Tris-HCl (pH 7.60)和0.2~1.0 M NaCl，流速为1.0 mL/min；洗脱组分透析、真空干燥等获得初步纯化的固体，然后运用脂多糖诱导的巨噬细胞RAW 264.7评价各组分的抗炎活性；以上述活性评价结果为依据，选择活性最强的组分EPS-3进行SephadexG-100分子筛层析，流动相为超纯水，流速为0.25 mL/min；洗脱组分经截留分子量为8000~14000 Da的透析袋透析3天，透析截留液经真空冷冻干燥，即得具有免疫调节活性的均一多糖组分EPS3。