CN109260211A - Mpla在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，具体是吡喃葡糖苷脂质A(MPLA)在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用。本发明提供的MPLA作为制备电离辐射致睾丸损伤防治药物具有毒副作用小、睾丸辐射损伤防治疗效显著、用药安全方便等优势。上述性能显示出MPLA防治电离辐射致睾丸损伤中的独特优势，旨在为睾丸辐射损伤的防治探索更有效的救治新途径、新技术；而目前国内外对男性生殖系统仍缺乏有效的辐射损伤防治技术手段，解决这一难题成为放射医学领域的一项关键需求。因此，MPLA作为制备电离辐射致睾丸损伤防治药物在我国医学领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物方面的应用。
背景技术
随着核科学技术的广泛应用，战时核辐射、核恐怖袭击、平时核反应堆事故及临床上恶性肿瘤放疗等都可导致电离辐射对睾丸的严重损伤，产生不育、致癌、致畸等严重后果。睾丸辐射防护也是核医学科、介入科、放疗科和影像科育龄男性医生辐射防护的重点。睾丸内精母细胞、精原细胞精子对电离辐射极为敏感，睾丸受到电离辐射损伤后会出现精子减少和(或)缺失、精子畸形增加及生精细胞变性、坏死和脱落等。电离辐射对睾丸的损害程度与性别、年龄、辐射剂量、暴露时间、射线种类等因素密切相关，照射剂量越大，损伤程度和精子数目下降水平越严重，Howell等(Howell SJ,Shalet SM.Spermatogenesis aftercancer treatment:damage and recovery.J Natl Cancer Inst Monogr 2005；12-17)认为低至0.1Gy的电离辐射就会导致精原细胞的改变，当接受<0.8Gy的辐射剂量可引起精子数量减少；2Gy-3Gy导致精母细胞明显受损，造成精子数量的减少；4Gy-6Gy导致精子数量明显减少。有国内学者认为(龚守良.电离辐射生殖遗传效应.Journal 2009)即使低至0.1Gy-0.15Gy的辐射剂量也可引起暂时性不育；2Gy以上剂量(一般5Gy-6Gy)则会引起永久性不育。本实验室发现，将野生型C57BL/6小鼠暴露于4Gy 60Coγ射线照射后，16h内即出现精原细胞明显凋亡，3天内即出现精子活力下降，精曲小管内精子数量减少，精原细胞大量凋亡；照后21天发现精曲小管明显萎缩坏死，睾丸内各类细胞明显减少。目前有含硫类(氨磷汀)、激素类、细胞因子类、中草药类等多类药物可对放射性损伤产生一定防护效应，但由于副作用较大、作用原理单一、药物疗效不确定等原因，这些药物的应用均受到较大限制。因此，寻找一种高效低毒的对男性生殖系统具有明显防护作用的药物就显得至关重要。LyudmilBurdelya等(Burdelya LG,Krivokrysenko VI,Tallant TC,Strom E,Gleiberman AS,Gupta D,Kurnasov OV,Fort FL,Osterman AL,Didonato JA,Feinstein E,Gudkov AV.Anagonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse andprimate models.Science 2008；320:226-230.)在2008首先报道了TLR5受体激动剂CBLB502可通过激活TLR5受体对机体产生辐射防护作用，随后，关于TLR2、TLR4，TLR9在辐射防护领域的报道相继出现。有文献报道指出，LPS作为TLR4受体激动剂可对机体产生明显辐射防护效果，但LPS为格兰阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖，对机体副作用较明显，过量使用易引发败血症等严重不良反应。因此，寻找高效低毒的TLR受体激动剂对于攻克机体辐射防护的难题显得至关重要。
MPLA(吡喃葡糖苷脂质A，Monophosphoryl lipid A)是沙门氏菌R595的突变体，是将LPS(R)-3-羟基十四烷酰基和1-磷酸盐基团经过连续水解后得到的解毒化学衍生物，它的lipid A部分可以与TLR4结合，MPLA高效激活TLR4及其下游信号通路，产生相应效果。我们发现照前给予MPLA可显著保护睾丸的辐射损伤，增加精子活力，减少辐射诱导的精原细胞凋亡，提示其很好的应用前景。MPLA作为TLR4靶向配体，不仅在前期基础毒理学分析中证明其毒性低，而且目前将它作为佐剂在疫苗研发领域也得到广泛的应用，文献报道MPLA在欧洲和美国有超过300,000人次的临床试验未发现明显毒副作用。(Schülke S,Flaczyk A,Vogel L,Gaudenzio N,Angers I,B,Wolfheimer S,Spreitzer I,Qureshi S,Tsai M,Galli S,Vieths S,Scheurer S.MPLA shows attenuated pro-inflammatoryproperties and diminished capacity to activate mast cells in comparison withLPS.Allergy.2015 Oct；70(10):1259-68.)
本发明人之前研究成果(专利申请号201710800212.1)提供了MPLA在制备电离辐射致肠道损伤防治药物中的应用，指出MPLA作为制备电离辐射致肠道损伤防治药物具有毒副作用小、肠道辐射损伤防治疗效显著、用药安全方便等优势。但目前针对肠道辐射损伤的辐射防护药物均不能用于电离辐射致睾丸辐射损伤的防治，如美国FDA唯一批准的辐射防护药物氨磷汀对肠道辐射损伤具有一定的防护作用，但由于其毒性较大，不能用于睾丸的辐射防护；目前在临床研究阶段的TLR5激动剂CBLB502，虽然对肠道损伤有防护作用，但没有对睾丸辐射防护研究的报道。电离辐射主要通过引起肠上皮细胞凋亡、通透性增加和肠道干细胞增殖抑制导致肠道的功能受损、恢复抑制，从而导致严重的肠型放射病，导致患者死亡；跟肠道相比，睾丸对电离辐射更为敏感，且应用更为广泛，低剂量辐射即可导致生精细胞凋亡、分化障碍和染色体畸变，造成不育或致畸的严重后果，更常见于医源性照射或事故性照射、或介入科或放射科工作人员。另外，肠道辐射损伤救治药物主要侧重于抢救重症辐射损伤患者，而睾丸辐射损伤防治主要在于保持男性生育能力、避免先天畸形等方面，二者对药物毒性的耐受也截然不同。因此用于肠道辐射损伤的药物不能简单的用于防治电离辐射对睾丸的损伤。
但是关于MPLA在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用现有文献及专利中均未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供吡喃葡糖苷脂质A(Monophosphoryl lipid A，以下简称MPLA)的新用途，即在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用。
MPLA作为一种高效低毒的TLR4受体激动剂在辐射防护领域有巨大的应用前景。本发明研究发现，MPLA对小鼠睾丸辐射损伤均有明显辐射防护效果，且用药安全，无明显毒副作用。
为达到上述发明目的，本发明的第一方面，提供MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用。
所述的MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)，其化学式为C96H181N2O22P.H3N。
进一步的，所述的MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)是TLR4的高效激活剂，是通过激活TLR4防治电离辐射致睾丸损伤。
进一步的，所述的药物包括口服和注射用药。
进一步的，所述的MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)的给药剂量为50μg/kg，且在电离辐射前12小时给药。
进一步的，所述电离辐射为γ射线或X射线照射。
进一步的，所述电离辐射为60Coγ射线照射。
本发明还提供MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)在制备减轻电离辐射致睾丸组织结构损伤的药物中的应用。
本发明还提供MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)在制备减轻电离辐射导致的睾丸内细胞凋亡，加强DNA损伤修复水平的药物中的应用。
本发明还提供MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)在制备减轻电离辐射导致的精子数量减少的药物中的应用。
本发明还提供MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)在制备抑制电离辐射导致的凋亡通路关键分子C-Caspase3激活，增加DNA修复通路关键分子DNA-pkcs表达的药物中的应用。
本发明的第二方面，提供一种电离辐射致睾丸损伤防治药物，其活性成分为MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)。
进一步的，所述的电离辐射致睾丸损伤防治药物还包括药学上可接受的辅料。
本发明所提供的MPLA(吡喃葡糖苷脂质A)作为制备电离辐射致睾丸损伤防治药物具有以下优点：
1、毒副作用小，目前将MPLA作为佐剂在疫苗研发领域得到了广泛应用，文献报道MPLA在欧洲和美国有超过300,000人次的临床试验未发现明显毒副作用；
2、疗效显著，照射前12小时以50ug/kg浓度的剂量给药，能够显著增加4Gy 60Coγ射线腹部照射小鼠3周精子活力及精子数量，减轻精曲小管坏死程度；增加睾丸脏器指数，减少照射后16h睾丸内凋亡细胞数量，
3、本发明提供的MPLA作为制备电离辐射致睾丸损伤防治药物具有毒副作用小、睾丸辐射损伤防治疗效显著、用药安全方便等优势，显示出MPLA在防护电离辐射致睾丸损伤中的独特之处，旨在为睾丸辐射损伤的防治探索更有效的救治新途径、新技术；而目前国内外对睾丸放射损伤仍缺乏有效的防治技术手段，因此，MPLA作为制备电离辐射致睾丸损伤防治药物在我国医学领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明4Gy 60Coγ射线腹部照射后照射后第一天、第七天C57小鼠照射对照组和照射前MPLA给药组睾丸HE切片对比图。
图2为本发明4Gy 60Coγ射线腹部照射后7天TLR4敲除小鼠照射对照组和照射前MPLA给药组睾丸小鼠HE切片对比图。
图3为本发明4Gy 60Coγ射线腹部照射16hC57小鼠照射对照组和照射前MPLA给药组睾丸TUNEL染色对比图及TUNEL阳性细胞数量统计图。
图4为本发明4Gy 60Coγ射线腹部照射3周后未照射组、单纯照射组、照射前MPLA给药组精子计数量化图。
图5A-D为本发明4Gy 60Coγ射线腹部照射C57小鼠照后不同时间点睾丸内凋亡通路及DNA损伤修复通路关键分子激活情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
材料：野生型小鼠：中国科学院实验动物中心获得的6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠。TLR4缺陷型小鼠：从南京大学模型动物研究中心获得。
MPLA：购自美国INVIVOGEN公司。
其中，照射条件：辐射中心(第二军医大学海军医学院，中国上海)的60Coγ射线照射。所有辐射动物接受单次剂量4Gy，剂量率为1Gy/min，均为腹部照射。
统计学处理：实施例的所有实验均重复3次以上，结果采用±S表示。采用SAS统计软件对相关数据进行t检验，以P<0.05为有显著性差异。
实施例1：
首先建立辐射致睾丸损伤小鼠模型，选用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠18只，随机分为3组，每组6只：照射组(4Gy)3只和照射前12小时MPLA给药组(4Gy+MPLA)3只及对照组3只；用60Coγ射线对小鼠进行单次腹部照射，小鼠吸收剂量为4Gy。通过胃内给药将MPLA(给药剂量50μg/kg，以0.1ml生理盐水溶解MPLA)或生理盐水(0.1ml/小鼠)递送至相应组。在辐射暴露后第一天，第七天分别取每组8只小鼠睾丸，固定、蜡块包埋，切片后进行HE染色(如图1所示)。显微镜下观察发现，未照射组小鼠睾丸结构完整，细胞量大，精曲小管饱满，轮廓清晰，单纯照射组小鼠睾丸内细胞数量减少，精曲小管内空腔变大，并伴有萎缩，坏死，照射前给药组小鼠睾丸细胞数量相对较多，精曲小管结构相对完整，总体损伤程度较单纯照射组明显减轻，表明照射前使用MPLA可对照射后小鼠睾丸组织结构损伤产生明显减轻作用。
实施例2：
(1)辐射致睾丸损伤小鼠模型同实施例1；
(2)选用6-8周龄雄性TLR4敲除性小鼠，随机分为3组，每组3只：单纯照射组及对照组于照射前12h进行生理盐水灌胃(0.1ml/只)，照射给药组于照射前12h予以MPLA灌胃(给药剂量50μg/kg，以0.1ml生理盐水溶解MPLA)，照射后第七天处死小鼠，取睾丸组织，固定、蜡块包埋，切片后进行HE染色(如图2所示),显微镜下观察发现，未照射组小鼠睾丸结构完整，细胞量大，精曲小管饱满，轮廓清晰，与野生型C57BL/6小鼠无明显差别。单纯照射组及照射前给药组小鼠睾丸内均出现细胞数量减少，精曲小管内空腔变大，萎缩，坏死均较严重，表明照射前使用MPLA对TLR4缺失小鼠睾丸不产生明显辐射防护效果，提示MPLA通过TLR4依赖途径对小鼠睾丸产生辐射防护效果。
实施例3：
(1)辐射致睾丸损伤小鼠模型同实施例1；
(2)选取选用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠6只，随机分为2组，每组3只，单纯照射组于照射前12h进行生理盐水灌胃(0.1ml/只)，照射给药组于照射前12h予以MPLA灌胃(给药剂量50μg/kg，以0.1ml生理盐水溶解MPLA)，照射后16h处死小鼠，取睾丸组织，固定、蜡块包埋，切片，切片后进行TUNEL(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediateddUTP nick end labeling，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法)染色，显微镜下观察，随机选取10个低倍镜视野进行TUNEL阳性细胞计数并计算平均值(如图3所示)，结果发现单纯照射组睾丸TUNEL阳性细胞明显多于照射给药组(p<0.05)，TUNEL染色法是检测细胞凋亡的敏感指标，此结果说明照射前予以MPLA可明显减轻辐射导致的睾丸内细胞凋亡。
实施例4：
(1)辐射致睾丸损伤小鼠模型同实施例1；
(2)选取选用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠9只，随机分为3组，每组3只，单纯照射组及不照射组于照射前12h进行生理盐水灌胃(0.1ml/只)，照射给药组于照射前12h予以MPLA灌胃(给药剂量50μg/kg，以0.1ml生理盐水溶解MPLA)，于照射后3周处死各组小鼠，取附睾组织，于37°生理盐水中剪碎并孵育10min，显微镜下观察精子并计数(如图4所示)；结果表明，照射前予以小鼠MPLA可明显减轻照射导致的精子数量减少，提示照射前使用MPLA处理小鼠可对电离辐射造成的生精能力下降产生防护作用。
实施例5：
(1)辐射致睾丸损伤小鼠模型同实施例1；
(2)选取选用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠10只，随机分为2组，每组5只，单纯照射组于照射前12h进行生理盐水灌胃(0.1ml/只)，照射给药组于照射前12h予以MPLA灌胃(给药剂量50μg/kg，以0.1ml生理盐水溶解MPLA)，于照射后0、0.5、4、8、12h每个时间点处死两组小鼠各1只，取睾丸组织，提取组织蛋白，使用western blot手段检测组织内DNA损伤修复通路及凋亡通路关键分子表达变化情况(如图5A-D所示)，结果表明，照射前予以小鼠MPLA可明显抑制照射后凋亡通路关键分子C-Caspase3激活，同时增加DNA修复通路关键分子DNA-pkcs表达，提示照射前使用MPLA减轻睾丸内细胞凋亡情况，加强DNA损伤修复水平。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.MPLA在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的MPLA在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用，其特征在于，所述的MPLA通过激活TLR4防治电离辐射致睾丸损伤。
3.根据权利要求1所述的MPLA在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用，其特征在于，所述的电离辐射致睾丸损伤防治药物包括口服和注射用药。
4.根据权利要求1所述的MPLA在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用，其特征在于，所述的MPLA的给药剂量为50μg/Kg，且在电离辐射前12小时给药。
5.根据权利要求1所述的MPLA在制备电离辐射致睾丸损伤防治药物中的应用，其特征在于，所述电离辐射为γ射线或X射线照射。
6.一种电离辐射致睾丸损伤防治药物，其活性成分为MPLA。
7.MPLA在制备减轻电离辐射致睾丸组织结构损伤的药物中的应用。
8.MPLA在制备减轻电离辐射导致的睾丸内细胞凋亡，加强DNA损伤修复水平的药物中的应用。
9.MPLA在制备减轻电离辐射导致的精子数量减少的药物中的应用。
10.MPLA在制备抑制电离辐射导致的凋亡通路关键分子C-Caspase3激活，增加DNA修复通路关键分子DNA-pkcs表达的药物中的应用。
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