CN109239029B

CN109239029B - 一种高效准确的高通量检测样本的质量评估方法

Info

Publication number: CN109239029B
Application number: CN201810858187.7A
Authority: CN
Inventors: 段飞蝶; 韩维; 汉雨生; 揣少坤
Original assignee: Guangzhou Burning Rock Dx Co ltd
Current assignee: Guangzhou Burning Rock Dx Co ltd
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2018-07-31
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2038-07-31
Also published as: CN109239029A

Abstract

本发明公开了一种评估DNA样本降解情况的方法，利用荧光染料法和紫外吸收法分别测量样品DNA浓度，并计算两种测量方法的比值。本发明提供的评估DNA样本降解情况的方法的准确性能满足后续NGS甚至其他需要进行片段评估的需求，与常规方法相比，节省时间、节省空间、经济性好、人为误差小。因此，本发明提出的方法可取代高通量测序DNA片段评估的常规方法，使得高通量测序的质控环节和检测周期大幅度缩短，在成本上带来很大的优势，值得大面积推广应用。

Description

一种高效准确的高通量检测样本的质量评估方法

技术领域

本发明涉及高通量测序技术领域，更具体地，涉及一种高效准确的高通量检测样本的质量评估方法。

背景技术

高通量测序技术又称"下一代"测序技术("Next-generation" sequencingtechnology NGS)，该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序，新一代测序（NGS）以其无以伦比的通量、扩展性和速度，让研究人员以前所未有的水平研究生物系统。NGS技术可以快速测序整个基因组、放大以深度测序目标区域。高通量测序技术已经广泛的应用在生命科学的方方面面。但是，NGS检测流程相对较长，从样本取材开始、病理评估、核酸提取、建库、上机、数据分析。为了确保每个临床检测的样本都能得到高质量的、准确的结果，需要在高通量检测的每个流程设置质控标准，尤其是最初的样本提取，以期达到最好的检测结果。

组织活检样本一直作为精准医疗NGS肿瘤分子检测金标准，但是为了便于组织的保存及后续取样的便捷，福尔马林固定、石蜡包埋（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE）的肿瘤组织样本是一种广泛用于分析基因表达的细胞组织的保存方法，福尔马林虽然能够长期保存样本，但对实验带来的系列影响也是不容忽视的。在FFPE组织标本的制备和贮存过程中，组织经福尔马林固定、石蜡包埋后很容易引起生物分子的交联、DNA降解等问题。分子交联、DNA降解带来的是核酸提取后DNA提取量低、片段化。

DNA片段化在NGS检测过程中是至关重要的因素，NGS-建库流程中对片段的要求严格，建库的第一步：DNA片段机械打断至200bp左右的片段，片段打断的参数选择需依赖对于样本DNA样本降解情况的结果。不合适的打断条件会导致NGS建库过程的DNA片段过长或过短（测序长度要求150bp*2），带来最终数据质量不合格。

目前，常规的DNA片段降解评估方法有琼脂糖凝胶电泳、QPCR方法，这两种方法普遍使用但均存在一定的弊端。（1）琼脂糖凝胶电泳-评估片段降解方法：污染风险：DNA电泳时，DNA暴露在电泳buffer中，随着电泳过程产生热，存在气溶胶污染的风险。因此需要电泳装置单独在一个房间中，且在NGS 流程的最下游，这是在PCR房间设置时也已明确规定；占用空间：电泳系统存在污染风险，必须单独在一个房间内，这也给空间上增加负担，特别是医院端搭建NGS平台中是个很致命的弊端-空间极其有限；耗时、人为误差大：DNA电泳流程：制备胶、加样、电泳、拍照、评估一个流程下来需要1.5h左右；且电泳评估时，因DNA条带都是存在一定降解的片段图像，需要一定的评估技术，也会存在人为差异。有毒：电泳的试剂特别时DNA染料对人体存在一定的毒性。（2）QPCR判断片段：操作复杂、耗时：QPCR方法是一个相对电泳更精准的方法，但因其操作要求高，操作复杂及需要的时间较长，3～4h，这个临床报告周期带来非常大的压力，因此也没有被普遍试用；经济性：QPCR的试剂成本较高。

因此，目前缺少一种简单、快捷、准确、无毒害、无污染的判断DNA降解程度的方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种高效准确的高通量检测样本的质量评估方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种评估DNA样本降解情况的方法，利用荧光染料法和紫外吸收法分别测量样品DNA浓度，并计算两种测量方法的比值。

优选地，使用Nanodrop分光光度计利用紫外吸收法测量样品DNA浓度。

优选地，使用Qubit荧光计利用荧光染料法测量样品DNA浓度。

优选地，使用货号：Q32854的Qubit dsDNA HS Assay Kit结合Qubit荧光计进行DNA浓度检测。

优选地，所述计算两种测量方法的比值的方法为：

N/Q比值=使用Nanodrop分光光度计测量的样品DNA浓度/使用Qubit荧光计测量的样品DNA浓度。

优选地，当0<N/Q比值≤3.5时，样品DNA完整性好；当3.5<N/Q比值≤6.5时，样品DNA完整性较好；当N/Q比值>6.5时，样品DNA完整性不好。

优选地，当0<N/Q比值≤3.5时，样品DNA≥2500bp；当3.5<N/Q比值≤6.5时，样品DNA为1000～2500bp；当N/Q比值>6.5时，样品DNA≤1000bp。

优选地，所述计算两种测量方法的比值的方法为：

Q/N比值=使用Qubit荧光计测量的样品DNA浓度/使用Nanodrop分光光度计测量的样品DNA浓度。

优选地，当Q/N比值>0.29时，样品DNA完整性好；当0.15< Q/N比值≤0.29时，样品DNA完整性较好；当Q/N比值<0.15时，样品DNA完整性不好。

优选地，当比值>0.29时，样品DNA≥2500bp；当0.15<比值≤0.29时，样品DNA为1000～2500bp；当比值<0.15时，样品DNA≤1000bp。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的评估DNA样本降解情况的方法评估的准确性高，可以对样品的DNA片段长度进行整体的评估。其的准确性能满足后续NGS检测，及其他需要进行DNA片段降解情况或长度分布评估的需求，与常规方法相比，其优势/意义还体现在为：

1.节省时间：本发明提出的方法，不需要额外进行其他实验即可快速评估。很大程度上缩短了评估时间，这给临床检测周期带来较大优势。

2.节省空间：本发明提出的方法无需其他设备，更不需要额外独立的空间。会在空间上带来非常大的优势。

3.经济性：本发明提出的方法与常规方法电泳或QPCR方法下相比，无需任何试剂、耗材、设备，成本上会降低很多。

4.人为误差小，技术要求低：相对其他评估方法，本发明提出的方法直接根据具体数值进行评估，不存在人为评估的误差，而且技术要求极低。

综上，本发明提出的方法可取代高通量测序中DNA片段评估的常规方法（凝胶电泳法），使得高通量检测的质控和检测周期大幅度缩短，在成本上带来很大的优势，值得大面积推广应用。

附图说明

图1为核酸提取凝胶电泳评估标准。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例对照例中：

建库采用的是：SureSelectXT Target Enrichment System for IlluminaPaired-End Sequencing Library

上机测序平台为：Miseq、Nextseq 500、Miniseq、Novaseq 6000

待测样本为：日常临床检测FFPE样本

基因组DNA质量的评级标准：

A级：样本DNA片段平均长度在2500bp以上，即DNA≥2500bp；

B级：样本DNA片段平均长度在 1000～2500bp之间；

C级：样本DNA片段平均长度在500～1000bp之间；

D级：样本DNA片段平均长度在500bp以下；即DNA≤500bp。

实施例1 N/Q比值评价法

一、实验操作

1、样本DNA的提取

采用市售组织或细胞DNA提取试剂盒进行DNA的提取。

2、确定打断条件并进行机械打断

分别使用Nanodrop分光光度计和Qubit荧光计测量样本的DNA浓度，（使用货号Q32854的Qubit dsDNA HS Assay Kit结合Qubit荧光计进行DNA浓度检测），并按照以下公式计算其浓度的比值：

样本分级标注及打断条件见表1。

表1：

3、打断片段分析

之后进行正常NGS流程，将打断后得到的片段进行建库，进行上机测序，利用生物信息学方法对于下机数据进行QC（质量控制）分析，判断insert size（插入片段即打断后的片段）的大小，根据insert size 的大小来判断样本等级评估方法的准确性，即N/Q比值评价法的理论插入片段大小与实际insert size的对应关系（吻合度），以此来确定N/Q比值评价法评估的准确性。

二、实验结果

本评估方法与QC分析插入片段的吻合度的关系如表2所示。

表2：

本方法评级为A的样本共1114个，其中有1008个样本实际的插入片段200-250bp，可确认这1008个样本评估是准确的，即吻合率90.2%（1008/1114）。同样地，计算B和C的吻合率分别为36.1%和37.1%，吻合率能满足日常需求。

对比例凝胶电泳评价法

一、实验操作

1、样本DNA的提取

同实施例1。

2、凝胶电泳确定打断条件

将样品进行琼脂糖凝胶电泳。

目前根据凝胶电泳对于打断参数的判断标准为见表3和图1。

表3：

3、打断片段分析

之后进行正常NGS流程，将打断后得到的片段进行建库，进行上机测序，利用生物信息学方法对于下机数据进行QC（质量控制）分析，判断insert size（插入片段即打断后的片段）的大小，根据insert size 的大小来判断样本等级评估方法的准确性，即凝胶电泳评价法的理论插入片段大小与实际insert size的对应关系（吻合度），以此来确定凝胶电泳评价法评估的准确性。

二、实验结果

电泳评估与插入片段的吻合度的关系如表4所示。电泳评级为A的样本共1053个，其中有952个样本实际的插入片段200-250bp，可确认这952个样本评估是准确的，即吻合率90.4%（952/1053）。同样地，计算B和C的吻合率计算，目前电泳评估B和C与插入片段的吻合率相对较低。

表4：

一般认为造成这种情况的主要原因是：电泳评估时人为的因素、质量稍差的样本检测后差异性更明显。

综合以上结果，对于以上两种评价方法评价准确样本的数量进行了比较，结果见表5。

表5：

结果如表所示，N/Q评估法与凝胶电泳评估法在大片段质量好的样本（A级）中的评估的准确性相似，但是对于B级和C级样本的评价中，N/Q评估法的评价结果要远远优于凝胶电泳。

Claims

1.一种评估DNA样本降解情况的方法，其特征在于，利用荧光染料法和紫外吸收法分别测量样品DNA浓度，并计算两种测量方法的比值，

所述比值的计算方法为：N/Q比值＝使用Nanodrop分光光度计测量的样品DNA浓度/使用Qubit荧光计测量的样品DNA浓度；

当0＜N/Q比值≤3.5时，评估样品DNA片段平均长度≥2500bp；当3.5＜N/Q比值≤6.5时，评估样品DNA片段平均长度为1000～2500bp；当N/Q比值＞6.5时，评估样品DNA片段平均长度≤1000bp。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用货号Q32854的Qubit dsDNA HS AssayKit结合Qubit荧光计进行DNA浓度检测。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，根据DNA样本降解情况选择打断条件，当N/Q比值小于等于3.5时，机械打断60秒；当N/Q比值大于3.5时，机械打断30秒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，当0＜N/Q比值≤3.5时，评估样品DNA片段打断后的插入片段的预期大小为200～250bp；当3.5<N/Q比值≤6.5时，评估样品DNA片段打断后的插入片段的预期大小为170～200bp；当N/Q比值>6.5时，评估样品DNA片段打断后的插入片段的预期大小为<170bp。

5.一种评估DNA样本降解情况的方法，其特征在于，利用荧光染料法和紫外吸收法分别测量样品DNA浓度，并计算两种测量方法的比值，

所述比值的计算方法为：Q/N比值＝使用Qubit荧光计测量的样品DNA浓度/使用Nanodrop分光光度计测量的样品DNA浓度；

当Q/N比值>0.29时，评估样品DNA片段平均长度≥2500bp；当0.15<Q/N比值≤0.29时，评估样品DNA片段平均长度为1000～2500bp；当Q/N比值<0.15时，评估样品DNA片段平均长度≤1000bp。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，使用货号Q32854的Qubit dsDNA HS AssayKit结合Qubit荧光计进行DNA浓度检测。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，根据DNA样本降解情况选择打断条件，当Q/N比值大于0.29时，机械打断60秒；当Q/N比值小于等于0.29时，机械打断30秒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当Q/N比值>0.29时，评估样品DNA片段打断后的插入片段的预期大小为200～250bp；当0.15<Q/N比值≤0.29时，评估样品DNA片段打断后的插入片段的预期大小为170～200bp；当Q/N比值<0.15时，评估样品DNA片段打断后的插入片段的预期大小为<170bp。