CN109207567A

CN109207567A - 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法

Info

Publication number: CN109207567A
Application number: CN201811121430.3A
Authority: CN
Inventors: 周楠迪; 蔡蓉凤; 尹凡; 田亚平
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109207567B

Abstract

一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，属于分析化学及食品安全和发酵分析技术领域。本发明首先构建靶标识别体系，通过金黄色葡萄球菌与适配体之间的高度亲和力，可从双链中竞争释放cDNA；然后以cDNA为模板，在溶液中加入触发引物序列，扩增出大量具有特定序列的单链DNA；加入特定发夹结构后，单链DNA与发夹结构在溶液中自组装形成特定的六边形结构；最后加入荧光染料，染料与DNA双链特异性结合，释放荧光信号。利用荧光信号与金黄色葡萄球菌数量的线性关系来计算出样品中的金黄色葡萄球菌含量。本发明通过荧光共振能量转移原理，将荧光信号与金黄色葡萄球菌数量关联，实现了对牛奶等食物样品中金黄色葡萄球菌含量的直接测定。所建立的检测方法具有检测周期短，灵敏度高，成本低，特异性强等特点。

Description

一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法

技术领域

本发明涉及一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，可以对食品和发酵样品中金黄色葡萄球菌含量进行高灵敏的测定，属于分析化学及食品安全和发酵分析技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种常见的人类病原体，多见于生牛乳和生肉中，可产生多种内毒素，引起各种感染和食源性疾病，例如败血症，感染性心内膜炎（IE），以及骨关节炎，皮肤和软组织，胸膜肺等，严重威胁人类健康，人群中大约有30%的金黄色葡萄球菌携带者。同时金黄色葡萄球菌也常是发酵过程中的污染菌。因此研发对金黄色葡萄球菌的高灵敏、准确的检测方法，对于食品安全监测和发酵分析、临床预防及治疗金黄色葡萄球菌引起的多种感染具有重要的意义。

目前，检测金黄色葡萄球菌的方法包括传统培养，生化检测（如显色培养基），免疫学方法（如酶联免疫检测法），分子生物学方法（如多重PCR技术）等。其中，传统培养和生化检测方法检测时间长，容易受到杂菌菌落形态和数量以及变种金黄色葡萄球菌的影响，出现假阴性结果；免疫学方法试验周期长，步骤繁琐，各种非相关抗原易引起交叉反应，食物加热过程中产生的肠毒素蛋白凝集等会造成检测结果的假阳性或假阴性；分子生物学方法同样容易受到样品成分等因素的影响。这些常用的检测金黄色葡萄球菌的方法或需要长时间的处理、熟练的工作人员和昂贵的实验室设备，或具有不稳定、灵敏度低、准确性差等缺点。因此建立灵敏高效的金黄色葡萄球菌检测方法，对于食品安全监控和发酵过程监控等均具有重要的意义。

近年来，随着组合化学和生物传感技术的发展，多种基于适配体的生物传感器被用来检测病原微生物。这些生物传感器由检测元件和识别元件构成，通过信号转换来检测目标物质如电化学传感器，荧光传感器，比色传感器等。适配体通过SELEX筛选技术获得，是对特定靶标具有高亲和力和特异性的DNA或RNA分子。与抗体相比，适配体更易合成和储存，从而拓宽了它们的应用。更重要的是，许多基于核酸分子的信号放大方法进一步拓宽了适配体传感器的检测范围，如滚环扩增技术（RCA）、链置换扩增技术（SDA）和杂交链式反应（HCR）等，这些技术在DNA／RNA体外定性检测中得到了越来越广泛的应用。生物传感器具有检测快速，特异性高，灵敏度强，可重复使用等特点，其应用范围也日渐广泛。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，建立一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌进行高灵敏、高特异性、准确的测定方法。

本发明的技术方案，本发明关键技术包括cDNA与适配体结合后，金黄色葡萄球菌与适配体的亲和竞争问题；Nb.bpu10I切刻内切酶与Bsm DNA聚合酶双酶偶联体系的构建，扩增特定DNA序列；利用DNA序列设计，使DNA自组装形成特定的空间结构并进行表征；利用荧光染料将金黄色葡萄球菌的含量转化为荧光信号的变化。包含内容为：首先设计与金黄色葡萄球菌适配体部分互补的cDNA，使之与适配体形成部分杂交双链，并固定于磁珠表面，当溶液中存在金黄色葡萄球菌时，由于其与适配体间的亲和力，使cDNA被置换并释放；其次在触发引物存在时，释放的cDNA与触发引物结合，在存在Nb.bpu10I内切酶，Bsm聚合酶以及游离的dNTPs时，由两种酶的共同作用反复循环扩增产生大量的单链DNA；然后往检测系统中加入经设计的发夹结构序列，与扩增产生的单链DNA通过一定时间孵育，形成特定的六边形DNA自组装结构；最后以DNA自组装结构为模板，加入SYBR Green I荧光染料，通过荧光共振能量转移原理发射荧光信号，利用检测到的荧光强度与金黄色葡萄球菌含量的线性关系来测算样品中金黄色葡萄球菌含量（图1）。

所述基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，首先构建靶标识别体系，由固定于磁珠上的金黄色葡萄球菌适配体和与之部分互补的序列cDNA形成双链结构，通过金黄色葡萄球菌与适配体之间的高度亲和力，从双链中竞争释放cDNA；然后以cDNA为模板，在溶液中加入触发引物序列，采用具有特殊切割位点的Nb.bpu10I限制性内切酶和具有强链置换效应的Bsm DNA聚合酶进行偶联反应，扩增出大量具有特定序列的单链DNA；加入特定发夹结构后，单链DNA与发夹结构在溶液中自组装形成特定的六边形结构；最后加入SYBR Green I荧光染料，染料与DNA双链特异性结合，释放荧光信号。利用荧光信号与金黄色葡萄球菌数量的线性关系来计算出样品中的金黄色葡萄球菌含量。

具体步骤如下：

（1）靶标识别体系：

a、适配体与cDNA双链结构的形成：根据文献提供的适配体序列，将适配体5'端标记上生物素，并设计与适配体部分互补的cDNA序列；将0.25μmol·L^-1 cDNA与0.25μmol·L^-1适配体加入0.1mol·L^-1 PBS、pH 7.4体系中混匀，95℃变性5min后缓慢冷却至37℃，孵育120min，使适配体与cDNA通过碱基互补配对原则形成双链结构；

其中适配体序列如SEQ ID NO.1所示；与适配体部分互补的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；

所述文献具体为Moon J, Kim G, Park S B, et al. Comparison of Whole-CellSELEX Methods for the Identification of Staphylococcus Aureus-Specific DNAAptamers[J]. Sensors, 2015, 15(4):8884-8897。

b、磁珠清洗与修饰：将链霉亲和素修饰的磁珠悬液用混匀器混匀，取100μL磁珠悬液，使用1mL PBS缓冲液清洗磁珠3次后磁性分离去除PBS缓冲液，加入100μL步骤a所得的混合液，置于37℃摇床，220r·min^-1 孵育45min，将双链通过链霉亲和素和生物素间的亲和力将双链固定至磁珠表面；

c、金黄色葡萄球菌的竞争结合和分离：将含有金黄色葡萄球菌的样品在3000r·min^-1离心5min，使用PBS缓冲液清洗沉淀3次；步骤b所得的磁珠悬液用1mL PBS缓冲液清洗磁珠3次，最后重悬于100 μL含有金黄色葡萄球菌的PBS缓冲液，混匀，在37℃摇床中，220 r·min^-1孵育45 min；使用磁珠分离系统将磁珠移除体系，保留含有游离cDNA的上清液；

（2）链置换扩增体系

d、cDNA与触发引物形成双链：将0.0125μmol·L^-1触发引物如SEQ ID NO.3所示，在95℃高温变性后加入步骤c上清液中缓慢冷却至37℃，孵育120min，使触发引物与上清液中cDNA通过碱基互补配对；

e、链置换剪切的扩增反应：往3μL上述步骤d溶液中加入7.5U Nb.bpu10I切刻内切酶，3U Bsm DNA聚合酶以及250 μmol·L^-1游离的脱氧核糖核苷三磷酸，10 mmol·L^-1 Tris-HCl，10 mmol·L^-1 MgCl₂，100 mmol·L^-1 KCl，0.1 mg·mL^-1 BSA，混匀后在37℃孵育100min，获得大量扩增的单链DNA；

（3）DNA自组装：0.715μmol·L^-1发夹结构经95℃变性5min后加入步骤（2）完成链置换扩增的反应溶液，缓慢冷却至37℃孵育120min；

（4）荧光信号检测和标准曲线绘制：将SYBR Green I荧光染料稀释10000倍，取30μL加入上述步骤（3）溶液中，染色120min，加入96孔酶标板，使用多功能酶标仪读取空白以及含有金黄色葡萄球菌溶液的荧光信号变化，采用的激发波长为497 nm，测定发射波长为520nm的荧光信号；通过摇瓶培养金黄色葡萄球菌溶液，逐倍稀释，根据传感器荧光值与金黄色葡萄球菌的浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线；

（5）实际样品检测：将含有金黄色葡萄球菌的样品以步骤（1）~（4）所述操作，测定出相应的荧光值，从标准曲线中计算出相应的菌浓度。

步骤（1）所述磁珠为商品化链霉亲和素修饰的磁珠，购于天津均益佳科技有限责任公司。

步骤（1）所述适配体为5’端修饰生物素的金黄色葡萄球菌适配体，购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

步骤（4）所述不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液具体为7~7×10⁷ CFU/mL。

SEQ ID NO.1适配体:

biotin-(CH₂)₆-CACACCGCAGCAGTGGGAACGTTTCAGCCATGCAAGCATCACGCCCGT；

SEQ ID NO.2部分互补DNA(cDNA) :

TAATGCCTGATAATGCCTGATAATGCCTGATAATGCCTGATAATGCCTGATAATGCCTGAGCACGGGCGTGATGCTTGCA；

SEQ ID NO.3触发引物：TGCAAGCATC；

SEQ ID NO.4发夹结构(Hp) CGACTAATGCCTGAGTCG。

本发明的有益效果：本发明构建了一个基于链置换扩增术和DNA自组装结构的金黄色葡萄球菌适配体传感器。通过链置换扩增术扩增了关键序列的浓度，放大了荧光信号，使该传感器检测范围扩大，提高检测灵敏度。该方法相比于检测金黄色葡萄球菌的传统方法，特异性强，灵敏度高。

附图说明

图1是基于链置换扩增术和DNA自组装结构的金黄色葡萄球菌荧光检测原理图。

图2是金黄色葡萄球菌荧光检测标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明的应用原理作进一步的描述。

以下实施例中的Nb.bpu10I切刻内切酶和Bsm DNA聚合酶均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；SYBR Green I荧光染料购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

本发明实施例中所用的适配体及cDNA等的核酸序列：

表1

。

实施例1 金黄色葡萄球菌浓度标准曲线的绘制

取100μL链霉亲和素修饰的磁珠与100μL适配体-cDNA复合物于37℃摇床中220r·min^-1孵育45min。使用PBS缓冲液清洗磁珠，磁性分离后，分别在每个EP管中加入十倍梯度稀释的金黄色葡萄球菌菌液，浓度范围为7~7×10⁷ CFU·mL^-1。于37℃摇床220r·min^-1孵育45min，清洗磁珠，磁性分离后保留上清液。取3μL上清液，加入0.0125μmol·L^-1触发引物，0.1 U·μL^-1 Bsm DNA聚合酶，0.25 U·μL^-1 Nb.bpu10I切刻内切酶，250 μmol·L^-1游离的脱氧核糖核苷三磷酸，10 mmol·L^-1 Tris-HCl，10 mmol·L^-1 MgCl₂，100 mmol·L^-1 KCl，0.1mg·mL^-1 BSA，混匀后在37℃水浴孵育100 min，最后加入30μL SYBR Green I染色40min，测定样品荧光强度。用荧光强度对金黄色葡萄球菌浓度作图得标准曲线，如图2所示，荧光强度随着金黄色葡萄球菌浓度的增加而增加，其线性回归方程是y= 26561 x+12219，R²为0.9976，其中y表示荧光强度，x表示Log (c [金黄色葡萄球菌]/CFU·mL^-1)，该方法的检测限为1.69 CFU ·mL^-1。

实施例2. 实际牛奶样品中金黄色葡萄球菌含量的测定

为了进一步验证该方法在测定实际牛奶样品中金黄色葡萄球菌含量时的准确性，选用了市售某牛奶，12000 r·min^-1离心15min以沉淀蛋白，将上清液用0.22 μm水相滤膜过滤两次。将80 μL金黄色葡萄球菌在无菌环境下以10²至10⁶ CFU·mL^-1的逐倍稀释浓度接种到20μL处理过的乳样品中。取100 μL链霉亲和素修饰的磁珠与100 μL适配体-cDNA复合物于37℃摇床中220 r·min^-1孵育45 min。清洗磁珠，磁性分离后，加入预处理后的牛奶实际样品，于37℃摇床220 r·min^-1孵育45 min，清洗磁珠，磁性分离后保留上清液。取3 μL上清液，加入0.0125 μmol·L^-1触发引物，0.1 U·μL^-1 Bsm DNA聚合酶，0.25 U·μL^-1 Nb.bpu10I切刻内切酶，250 μmol·L^-1游离的脱氧核糖核苷三磷酸，10 mmol·L^-1 Tris-HCl，10 mmol·L^-1MgCl₂，100 mmol·L^-1 KCl，0.1 mg·mL^-1 BSA，混匀后在37℃水浴孵育100 min，最后加入30μL SYBR Green I染色40 min，测定样品荧光强度，代入标准曲线可计算出金黄色葡萄球菌浓度，具体结果如表2所示。

表2

。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法

<141> 2018-09-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

cacaccgcag cagtgggaac gtttcagcca tgcaagcatc acgcccgt 48

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

taatgcctga taatgcctga taatgcctga taatgcctga taatgcctga taatgcctga 60

gcacgggcgt gatgcttgca 80

<210> 3

<211> 10

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

tgcaagcatc 10

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

cgactaatgc ctgagtcg 18

Claims

1.一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，其特征在于步骤如下：首先构建靶标识别体系，由固定于磁珠上的金黄色葡萄球菌适配体和与之部分互补的序列cDNA形成双链结构，通过金黄色葡萄球菌与适配体之间的高度亲和力，从双链中竞争释放cDNA；然后以cDNA为模板，在溶液中加入触发引物序列，采用具有特殊切割位点的Nb.bpu10I限制性内切酶和具有强链置换效应的Bsm DNA聚合酶进行偶联反应，扩增出大量具有特定序列的单链DNA；加入特定发夹结构后，单链DNA与发夹结构在溶液中自组装形成特定的六边形结构；最后加入SYBR Green I荧光染料，染料与DNA双链特异性结合，释放荧光信号；利用荧光信号与金黄色葡萄球菌数量的线性关系来计算出样品中的金黄色葡萄球菌含量。

2.根据权利要求1所述基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）靶标识别体系：

a、适配体与cDNA双链结构的形成：将适配体序列5'端标记上生物素，并设计与适配体部分互补的cDNA序列；将0.25μmol·L^-1 cDNA与0.25μmol·L^-1适配体加入0.1mol·L^-1PBS、pH 7.4体系中混匀，95℃变性5min后缓慢冷却至37℃，孵育120min，使适配体与cDNA通过碱基互补配对原则形成双链结构；

（2）链置换扩增体系

d、cDNA与触发引物形成双链：将0.0125μmol·L^-1触发引物在95℃高温变性后加入步骤c上清液中缓慢冷却至37℃，孵育120min，使触发引物与上清液中cDNA通过碱基互补配对；

触发引物如SEQ ID NO.3所示；

e、链置换剪切的扩增反应：往3μL步骤d溶液中加入7.5U Nb.bpu10I切刻内切酶，3UBsm DNA聚合酶以及250 μmol·L^-1游离的脱氧核糖核苷三磷酸，10 mmol·L^-1 Tris-HCl，10 mmol·L^-1 MgCl₂，100 mmol·L^-1 KCl，0.1 mg·mL^-1 BSA，混匀后在37℃孵育100min，获得大量扩增的单链DNA；

发夹结构如SEQ ID NO.4所示；

（4）荧光信号检测和标准曲线绘制：将SYBR Green I荧光染料稀释10000倍，取30μL加入步骤（3）溶液中，染色120min，加入96孔酶标板，使用多功能酶标仪读取空白以及含有金黄色葡萄球菌溶液的荧光信号变化，采用的激发波长为497 nm，测定发射波长为520 nm的荧光信号；通过摇瓶培养金黄色葡萄球菌溶液，逐倍稀释，根据传感器荧光值与金黄色葡萄球菌的浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线；

3.根据权利要求2所述基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，其特征在于：步骤（4）所述不同浓度的金黄色葡萄球菌溶液具体为7~7×10⁷ CFU/mL。

4.根据权利要求2所述基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法，其特征在于：

SEQ ID NO.1适配体:

biotin-(CH₂)₆-CACACCGCAG CAGTGGGAAC GTTTCAGCCA TGCAAGCATC ACGCCCGT；

SEQ ID NO.2部分互补DNA(cDNA) :

TAATGCCTGA TAATGCCTGA TAATGCCTGA TAATGCCTGA TAATGCCTGA TAATGCCTGAGCACGGGCGT GATGCTTGCA；

SEQ ID NO.3触发引物：TGCAAGCATC；

SEQ ID NO.4发夹结构：(Hp) CGACTAATGC CTGAGTCG。