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CN109207524A - 基于fto基因的人类肥胖症斑马鱼模型的建立与应用 - Google Patents

基于fto基因的人类肥胖症斑马鱼模型的建立与应用 Download PDF

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CN109207524A
CN109207524A CN201710545564.7A CN201710545564A CN109207524A CN 109207524 A CN109207524 A CN 109207524A CN 201710545564 A CN201710545564 A CN 201710545564A CN 109207524 A CN109207524 A CN 109207524A
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fto
zebra fish
gene
human obesity
screening
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董晓华
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Nanjing Yao Yu Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及基于FTO基因的人类肥胖症斑马鱼模型的建立与应用，具体步骤包括针对斑马鱼fto基因编码关键功能结构域的外显子设计CRISPR序列，筛选确认可有效引导Cas9切割目标基因的活性sgRNA，然后运用有活性的sgRNA，制备fto基因敲除的初建者，待初建者生长至性成熟，令其自由交配，产生F1代；通过对F1个体的基因型鉴定，筛选fto基因敲除的斑马鱼突变体；通过对fto基因纯合突变的分析，确立fto的功能缺失有益于斑马鱼仔鱼的脂肪累积的减少，建立基于fto基因的人类肥胖症的斑马鱼模型，进而可将fto作为标识基因应用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。

Description

基于FTO基因的人类肥胖症斑马鱼模型的建立与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及筛选确定可对斑马鱼fto基因进行基因组编辑的sgRNA序列、制备斑马鱼to基因靶向突变的优选方案，以及利用斑马鱼fto作为标志性基因筛选治疗人类肥胖症药物的斑马鱼模型的应用。
技术背景
肥胖是体内多余的脂肪堆积超过一定程度对人类健康造成困扰的能量代谢失衡的慢性疾病。人们通常用BMI(body mass index，体重指数)来判断个体是否肥胖。因体脂增加使体重超过标准体重20％或体重指数【BMI＝体重(Kg)/(身高)2(m2)】大于24者称为肥胖症。肥胖会增加其它疾病的患病几率，尤其是心脏病、II型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸窘迫、癌症和骨关节炎等疾病。近几十年来，肥胖症患者在全球范围内以惊人的速度增加。尤其是儿童、青少年肥胖增长日益迅猛(1，2)。在2014年约有600万成年人(13％) 和4200万5岁以下儿童患有肥胖症。肥胖被认为是21世纪最为严重的影响健康的疾病。
肥胖的病因主要分为外因和内因，外因以饮食过多，活动过少为主，热量摄入多余热量消耗，使脂肪合成增加(3，4)。而内因是要是由于遗传易感性引起的。类似于其它许多疾病，肥胖是遗传因素和环境因素之间相互作用的结果。人类的单纯性肥胖的发病有一定的遗传背景。许多基因存在的多态性控制着食欲和代谢从而在充足能量存在时更容易使体重增加从而易患肥胖症。在对家庭以及双胞胎的研究中表明， 40-70％的普通肥胖症患者属于遗传性肥胖(5，6)。截止到2006年，已经发现人类基因组上与肥胖症相关的多态性位点已经超过41个。2008年，人类筛选出第一个可导致人类肥胖症疾病的基因FTO(fat massand obesity associated gene)。Loos发现，FTO是一个肥胖易感基因，FTO基因第一个内含子的一些突变跟肥胖正相关。研究发现，FTO基因第一个内含子携带肥胖SNP的纯合人群的体重要比不携带SNP的人群平均重3-4kg，并且患肥胖的危险性要增加1.67倍(7)。在另外一篇关于FTO的报道中表明，FTO在第一个内含子内存在的一些SNP位点跟II型糖尿病疾病密切相关(8)。但通过控制病人BMI指数，发现这些病人的糖尿病表型消失，这说明，FTO的突变是通过影响体重来影响继发性的糖尿病疾病的。这些数据表明 FTO基因的突变跟肥胖症密切相关。
在分子生物学水平上，小鼠、非洲爪蛙、斑马鱼、果蝇、和线虫等模式动物内的是生物学事件与人享有相同的分子机制。因此，利用模式动物可以制作人类疾病的有效在体模型。在所有模式动物中，斑马鱼是连接无脊椎动物和哺乳动物模型之间的桥梁，人类基因中的87％在其中能找到同源基因。目前，全球有超过1000家实验室选择以斑马鱼作为模式动物开展从基础生物学、环境毒理评价到药物研发等不同研究领域的研究，国内有超过100家实验室以斑马鱼为主要研究对象。斑马鱼饲养简单，饲养环境控制在一定产卵量多，每次一对鱼每周可产卵200-300枚，胚胎发育透明，且发育周期较短，是进行胚胎发育机理，基因组研究以及疾病机理研究的好材料。就与人类肥胖症密切相关的易感基因FTO而言，人FTO基因位于第16号染色体，FTO蛋白由505个氨基酸组成；而在斑马鱼中，跟人FTO同源基因fto位于斑马鱼7 号染色体，蛋白由579个氨基酸组成。生物信息学分析发现，fto基因和人FTO基因为直系同源基因(均分别与aktip以及AKTIP基因存在共线性关系)。在其表达产物蛋白质的氨基酸组成上，发现FTO与fto的相同性(identity)高，两个功能域(分别是FTO催化功能域和FTO C-末端功能域)相同性更高，进一步支持FTO基因在人和斑马鱼中高度保守。基于以上原因，我们采用斑马鱼为模型，采用基因组编辑技术，靶向突变fto基因。对突变体的分析发现，fto的纯合突变导致脂肪细胞在斑马鱼体内的堆积显著减少。结果表明fto是一个与肥胖相关基因，可以用作筛选治疗肥胖症的标识基因。
参考文献：
1.Weiss R，Dziura J，Burgert TS，Tamborlane WV，Taksali SE，et al.，Obesityand the metabolic syndrome in children and adolescents.N Engl J Med.2004，350(23)：
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6.Clement K，Sorensen TIA.Obesity：Genomics and Postgenomic.InformaHealthcare：New York，2008.
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8.Frayling TM，Timpson NJ，Weedon MN，Zeggini E，Freathy RM，et al.，Acommon variant in the FTO gene is associated with body mass index andpredisposes to childhood and adult obesity.Science 2007；316：889-894.
发明内容
为建立人类肥胖症的斑马鱼模型，我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术靶向敲除fto基因，确认fto 基因对以脂肪堆积为特征的肥胖症发生的影响。CRISPR/Cas9技术是否能成功编辑fto基因，实现斑马鱼 fto的基因敲除，关键在于是否能筛选到可以有效引导Cas9识别目标基因序列(CRISPR序列)的sgRNA。当sgRNA能够有效引导Cas9靶向识别目标基因，其中的Cas9就可以将CRISPR序列之PAM前的3至4 核苷酸间的3’-5’磷酸二酯键切断，从而形成基因组DNA的双链断裂(DSB)。一旦DSB形成，胚胎细胞将启动非同源末端连接修复或微同源末端连接修复机制，修复基因组的DSB，结果在DSB处引入插入缺失(Indel)突变。通过在F1代筛选携带具移码突变基因的突变体，就可以获得fto基因敲除的斑马鱼突变体，从而有望了解fto在肥胖症发生中的作用。为实现这一目标，我们根据Fto的功能域的分析，将CRIPSR 序列设计在第一个功能域所对应的第3外显子上。我们共设计了8个CRISPR序列(表一)。依据上述CRISPR 序列，我们制备了相应的sgRNA(sgRNA1至sgRNA8)。运用显微注射技术，将获得的8个sgRNA分成两组(sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5和sgRNA7为组1；sgRNA2、sgRNA4、sgRNA6和sgRNA8为组2) 分别与和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼受精卵中，对所述sgRNA进行活性验证。依据活性验证的结果，本发明首先提供了两个可以有效引导Cas9识别目标CRISPR序列的sgRNA1和sgRNA3。
将sgRNA1和sgRNA3与Cas9mRNA注射入斑马鱼受精卵(F0)，待注射胚胎发育至性成熟时，令其自由交配，获得F1个体，通过剪取尾鳍，对F1个体进行基因型鉴定。依据基因型鉴定的结果，本发明又提供了携带fto基因敲除突变的斑马鱼突变体的制备方案。
待F1杂合子生长至性成熟时，将F1自交，获得F2代胚胎。待胚胎发育至受精后4天(4dpf)，以油红对胚胎进行染色分析，依据分析结果，我们发现，当斑马鱼fto功能缺失时，胚胎的脂肪堆积量显著下降。由此，本发明再提供了基于斑马鱼fto基因的人类肥胖症模型，斑马鱼fto可作为筛选治疗肥胖症药物的标志基因，即能够使fto表达下降的任何物质将具备抑制肥胖症的作用。
附图说明
图1斑马鱼Fto蛋白质的保守结构功能域分析。Fto包含两个保守功能域，分别为FTO_NTD superfamily 和FTO_CTD superfamily。
图2可有效引导Cas9靶向切割fto基因的sgRNA活性验证分析。利用VectorNTI软件对重组子测序序列进行比对分析(共10个重组子)，表明sgRNA1和sgRNA3有活性，且sgRNA1活性率为20％，sgRNA3 活性率为10％。
图3sgRNA2/4/6/8活性验证分析。利用Vector NTI软件对重组子测序序列进行比对分析(共10个重组子) 表明sgRNA2、sgRNA4、sgRNA6、sgRNA8均无活性或活性较低。
图4斑马鱼F1代突变体3号携带的fto突变等位基因部分序列的测序峰图
图5斑马鱼F1代突变体3号携带的fto突变等位基因预测编码的截短蛋白结构示意图。WT：野生型Fto 蛋白质结构示意图，MUT1：其中一个fto突变等位基因预测编码的蛋白质结构示意图，MUT2：第二个 fto突变等位基因预测编码的蛋白质结构示意图。
图6斑马鱼F1代突变体11号携带的fto突变等位基因部分序列的测序峰图。
图7斑马鱼F1代突变体11号携带的fto突变等位基因预测编码的截短蛋白结构示意图。WT：野生型Fto 蛋白质结构示意图，MUT1：其中一个fto等位基因突变后预测编码的蛋白质结构示意图。
图8斑马鱼F1代突变体13号携带的fto突变等位基因部分序列的测序峰图。
图9斑马鱼F1代突变体13号携带的fto突变等位基因预测编码的截短蛋白结构示意图。野生型Fto蛋白质结构示意图，MUT1：其中一个fto等位基因突变后预测编码的蛋白质结构示意图。
图10携带fto纯合突变的斑马鱼突变体仔鱼内脂质储存量减少。油红O对发育到4天的斑马鱼仔鱼进行染色，发现与野生型斑马鱼相比较，fto突变体斑马鱼仔鱼体内脂肪含量明显减少。
具体实施方式
实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1活性sgRNA的筛选
(一)靶向突变斑马鱼fto基因的CRISPR的设计
1、基因信息分析
1.1编码斑马鱼fto基因的CDS
ATGAAACCGAGGCAGCGTAAACAGTACTTCAGGAACATGAAAAGATCGGATGACAGTGAGAGGGAAAAGAGGAGAAAGAGGCGAAGGCTTCTACAGGAACTAGGAGAGCAGAGGATTCCATATCTTTCCCCAACAGACCCAGGATTTCAGGACCTGTGGGACTCCAGTTATGCGGGCCTGGCTTTGCGGCAGTCTGGTACCCTTCCAGAAGGTCTCCATGAGAAGGTTCAATCTGCTCTGTTAACTCTACAGCGGCATGGATGTCTCCTCCGAGATCTTGTCCGAGTTCGAGACCGGGACGTCTTCACGGCCGTTTCACGCGCTCTCGTGGGTCAGCCGGGCTACACGTACCGTTATCTGGACACTCGTCTGTTCACCATCCCCTGGCACTGTGAAGGAGAAGAGGGCCAGAAAGATGAGAAAGGCAAACCTTGCTGTGACTCCGACCTGAGGGACGCTTGTAAAGCATTATGGGAGCTCAATCAGTTCTTTTGCTCGGATGTAAAGCAGCAGACAAATGCAAGAGGTGTCAAGCGTACCCGCAGTGACACTGAAAACAGCGAAGATGCGCCAGGGGAGGGAATGTGCGAAGAAGAGAGTGTTAAGGACAGGTTAGTTGAGGAGAAAACCATAGAGGAGGAGGAGGAAGACAGTGGACAGGGCTGCTCTCATTCCTCACCTCCTTCATCCACTCCGCCAGCTGCTCAGGCCAGCCTGGTTCAGTTTAACGTCACGCTAATCAACTACATGAACCCTGCAGCCATGACCCAGCTGAAGGAAGAGCCATATTACGGCATGGGCAAAATGGCAGTCGGTTGGCATCATGATGAGAACCTGGTTCCTCTCTCACCAGTTGCCGTTTACAGCTATAGCTGCCCAGCAGAGCCAAAGAATGAAGGAGTTACTGAGAAAGACGGGGAGGGAAAGAGCAAAGAAAAAGAAAGAGAGGCCAAAGGTGAAGGAACAAGTACAGAAGAAGTGAAGAAAGAAGGAGAAGCTTCGGTGAAGGAGGACGTGGAAAAAGAGAAGACGTGTTGGCGAGTTGGTCTGAAGGTGGCCTGGGACATCCACACACCAGGTCTGGCTTTGCCTCTCCAATCTGGAGACTGCTACTATATGACAGATGATCTGAACCGGACACATCAGCACTGTGTACTGGCTGGTGACACAGCTAGATTCAGCTCAACTCACAGAGTCGCACAGTGTTGTACGGGTACACTGGACTACATACAGAAACGTTGCTCTGAGGCCTTGGAGAATTTACACAGCGACCCCGAGAAGAACGCCAAGAGCCTGATTTCCCTCCTGCCCTCCATCCTCCAACGCATTGAGGATATCCACAACGAGGTGGAGTTTGAGTGGCTGAGGCAGTACTGGTTCCAGGGCCGGCGTTACGCTCGATTCTGCAGCTGGTGGACTAAACCCATGGAGCAGATGGAGAAAGATTGGAAGGAAATGGAGAGAATGACTCAGCTGCTGTTGGTGGTGGTTGAGGATGAGGCCACGGCACAGGAGAACAGAAGAGAGATGGCAGACGTGTTACTAAATGCGCTGACCGACAGACAGCAGCACAGACAGACATGGAGAGACAGATGCCAGTCCAGCCTGGCGCAGACTTTGCCCCCTGAGGAAGCACCTGTGGACAGACCCTATTGGAGCAATGATGATCCTGACATGCCCCTCCCCTTTGACCTCTCTGACATCATCAACCGCGTTGAGTCGCTTCTATGGAGAATGTAA
1.2斑马鱼Fto蛋白质序列
1.3蛋白质的保守结构功能域
见图1。
2、CRISPR的设计
2.1斑马鱼fto基因的外显子3序列
黄色字体为设计的CRISPR。下划线的序列为PAM序列NGG(RC：CCN)。
表一、靶向突变斑马鱼fto基因之CRISPR设计
(二)靶向突变斑马鱼ucp1基因的sgRNA活性的鉴定
1、目标基因的基因型鉴定
1.1待扩增的目标基因组序列
黄色高亮标记为设计的CRISPR，带下划线的为PAM序列NGG(RC：CCN)，绿色高亮标记为引物序列。
1.2PCR扩增的引物设计
序列名称 序列 用途
F-Fto-1 caaaaaccagtaggtctgtgga PCR正向引物
R-Fto-1 Ggctgcagggttcatgtagt PCR反向引物
2、sgRNA的体外合成
2.1sgRNA模板的制备(PCR法)
2.1.1PCR引物
正向引物序列如下：
注：灰色高亮部分为T7启动子部分，下划线部分为客户定制的CRISPR序列，小写字母为部分sgRNA骨架模板序列。
反向引物(为通用引物)R-Common：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
2.1.2预计获得的sgRNA体外转录模板序列
注：灰色高亮部分为T7启动子部分，下划线部分为客户定制的CRISPR序列，小写字母为sgRNA骨架模板序列。
2.2sgRNA的体外转录
2.2.1体外转录过程
将上述纯化后的模板用T7RNA聚合酶进行体外转录。使用RNA体外转录试剂盒(MAXIscript SP6/T7， Ambion，USA)，按试剂盒说明书要求依次加入10×TranscriptionBuffer 2μl、10mM ATP 1μl、10mM CTP 1μl、10mM GTP 1μl、10mM UTP 1μl、T7RNApolymerase mix 2μl、模板DNA 12μl，轻弹混匀离心后， 37℃水浴1h。
加入DNase I(Ambion，USA)1μl，37℃水浴15min，以去除模板。
之后加入30μl DEPC水扩大体积至50μl，同时加入5μl无核酸酶3M醋酸钠(pH5.2)和3倍体积的无水乙醇(国产分析纯)，-80℃沉淀过夜。4℃12，000g离心20min，去除上清后，沉淀在通风橱晾干，然后以15μl无核酸酶超纯水重悬后储存于-80℃冰箱备用。
2.2.2sgRNA序列
Fto-sgRNA1：
GGACUCCAGUUAUGCGGGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU
Fto-sgRNA2：
GAGCAGAUUGAACCUUCUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU
Fto-sgRNA3：
GAACUCGGACAAGAUCUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU
Fto-sgRNA4：
GGGCUACACGUACCGUUAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU
Fto-sgRNA5：
GAGGGCCAGAAAGAUGAGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU
Fto-sgRNA6：
GCUCAAUCAGUUCUUUUGCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU
Fto-sgRNA7：
GAAAACAGCGAAGAUGCGCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU
Fto-sgRNA8：
GGAGGAGGAAGACAGUGGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU
3、Cas9蛋白
将从商业公司(金丝瑞)购买的Cas9蛋白用DEPC水稀释为400ng/μl，分装后置于-20℃冰箱中保存。
4、斑马鱼受精卵的显微注射
按常规方法收取斑马鱼受精卵。将上述sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5、sgRNA7(终浓度为50ng/μl)/ sgRNA2、sgRNA4、sgRNA6、sgRNA8(终浓度为50ng/μl)和Cas9蛋白(终浓度为200ng/μl)混合后，显微注入斑马鱼受精卵，注射量为1nl每胚胎。
5、目标基因编辑子(Edits)的重组确认
5.1目标基因组片段模板的制备
待注射胚胎发育至24hpf时，各取5枚胚胎，使用本公司生产的《斑马鱼基因型鉴定试剂盒》制备基因组DNA模板，具体反应条件为：65℃30min，95℃5min，16℃1min，4℃
5.2PCR扩增反应体系(20μl)
2×Mastermix(Transgene)10μl、7μl的超纯水、1μl的正反向(F1-lgmn和R1-lgmn)引物(5μM)、和1μl的由1.6.5.1制备好的基因组DNA模板。
5.3PCR反应条件
95℃3min，30×(95℃30s，56℃30s，72℃1min)，72℃10min，4℃。
5.4目标基因PCR扩增产物的重组
将F1-fto和R1-fto的PCR扩增产物重组入pGEM-T Easy载体(5μl总体积的反应)，反应组成为：
1.5μl PCR扩增产物(取自5.5.2)
2.5μl 2×Ligation Buffer
0.5μl T4DNA连接酶
0.5μl pGEM-T Easy载体(Promega)
反应时间为：室温孵育60min
5.5重组子转化
将上述5μl连接产物用100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞(pfu≥108)进行转化。然后涂布于含氨苄(50 μg/ml)的LB板，37℃下倒置培养过夜。
5.6目标基因组DNA编辑子(Edits)的重组确认
依据条带大小，选取克隆直接送测序，测序引物为T7。组1(sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5、sgRNA7) 送测10个，测序结果反馈10个。具体序列比对见图2。目标基因组DNA编辑子(Edits)序列比对结果 表明sgRNA1、sgRNA3有活性，且sgRNA1活性率为20％，sgRNA3活性率为10％。组1(sgRNA2、sgRNA4、 sgRNA6、sgRNA8)送测9个，测序结果反馈9个。具体序列比对见图3。目标基因组DNA编辑子(Edits) 序列比对结果表明sgRNA2、sgRNA4、sgRNA6、sgRNA8均无活性或活性低于5％。
6、结论：
综合以上实验结果，可以确认所述的sgRNA1和sgRNA3可有效引导Cas9靶向切割目标基因。
实施例2斑马鱼fto基因敲除突变体制作方案
(一)初建者的制备
按实施例1中方案(二)之4描述的方法，按常规方法收取斑马鱼受精卵。将上述sgRNA1和sgRNA3 (终浓度为50ng/μl)和Cas9蛋白(终浓度为200ng/μl)混合后，显微注入斑马鱼受精卵(注射量为1nl 每胚胎)，制备fto基因敲除突变体之初建者(Founder)。
(二)F1突变体的筛选
1、F1代个体模板基因组DNA制备
1.1F1代斑马鱼的繁育与饲养
将注射了Cas9/sgRNA的F0胚胎饲养至性成熟，然后令其自由交配，获得F1胚胎。将F1胚胎按常规饲养至性成熟，进行基因型鉴定，筛选基因编辑突变体。
1.2组织无创取材
取3～4月龄的F1成鱼，剪取部分尾鳍组织，按顺序分别放入200μl PCR管中，然后置于冰上存放。
1.3基因组模板DNA制备
向含有尾鳍组织的200μl PCR管中加入南京尧顺禹生产的YSY buffer 10μl。快速离心后，将PCR管放入PCR仪中，进行如下反应：65℃30min，95℃5min，16℃1min，4℃。
2、目标基因组DNA的扩增
2.1含sgRNA识别位点的基因组序列
红色字体标识用于PCR扩增的引物序列，黄色高亮标识sgRNA识别位点序列。
2.2基因组片段扩增引物设计
F-fto-1：CAAAAACCAGTAGGTCTGTGGA
R-fto-1：GGCTGCAGGGTTCATGTAGT(RC：ACTACATGAACCCTGCAGCC)
2.3基因组DNA片段PCR扩增
2.3.1反应的组成
2×Mastermix(Vazyme)10μl、7μl的超纯水、1μl的正反向(F-phf8-1和R1R-phf8-1)引物(5μM) 和1μl的由1.3.2步骤获得的细胞基因组DNA模板。
2.3.2PCR反应条件
95℃3min，35×(95℃30s，56℃30s，72℃50s)，72℃10min，4℃。
3、携带fto突变等位基因的F1突变体的筛选鉴定
将fto突变体的PCR产物直接送测序，通过峰图读取确认其突变体携带的突变等位基因的基因型。
3.1突变体3基因型的确认
3.1.1突变体3基因型及预测的突变等位基因编码的截短蛋白序列
3.1.2测序峰图(部分)
见图4。
图4突变体3的目标基因组片段PCR扩增产物直接测序结果图(部分)
3.1.3预测的突变基因编码的截短蛋白结构示意图
见图5。
3.2突变体11基因型的确认
3.2.1突变体11基因型及预测的突变等位基因编码的截短蛋白序列
3.2.2测序峰图(部分)
见图6。
图6突变体11的目标基因组片段PCR扩增产物直接测序结果图(部分)
3.2.3预测的突变基因编码的截短蛋白结构示意图
见图7。
图7突变体11携带的突变等位基因预测编码的截短蛋白结构示意图
3.3突变体13基因型的确认
3.3.1突变体13基因型及预测的突变等位基因编码的截短蛋白序列
3.3.2测序峰图(部分)
见图8。
图8突变体13的目标基因组片段PCR扩增产物直接测序结果图(部分)
3.3.3预测的突变基因编码的截短蛋白结构示意图
见图9。
图9突变体13携带的突变等位基因预测编码的截短蛋白结构示意图
4、结论：共筛选到3尾携带fto移码突变的F1突变斑马鱼。其中11号和13号斑马鱼突变体所携带的突变等位基因一致。
实施例3斑马鱼fto功能缺失降低脂肪的累积
1、胚胎准备
携带fto突变的F1代杂合子斑马鱼养殖在南京尧顺禹生物科技有限公司斑马鱼独立养殖单元中，待其性成熟时，令F1代个体自由交配，按常规收集受精卵，所有胚胎及幼鱼养殖在室温28.5℃，待胚胎发育至4天时用于实验。
2、油红O的配制
购于Sigma公司，母液配置为0.5％(w/v)，取0.5g油红O溶于100ml异丙醇中。
3、胚胎固定
取2g多聚甲醛在65℃水浴锅中溶于PBS中(76g NaCl，9.9gNa2HPO4，3.6gNaH2PO4，溶于10L水中， pH调至7.0)，配置为4％PFA，用于固定4dpf胚胎。
4、油红O染色
1)取4天斑马鱼幼鱼，4％多聚甲醛4℃固定12小时
2)PBST洗2次
3)0.5％油红O室温染色4-6小时
4)PBST洗3次，60％异丙醇洗2次，每次5分钟
5)PBST洗一次，解剖镜下观测，数码照相机拍照记录。
5、基因型鉴定及结果分析
对经油红O染色的ucp1斑马鱼突变体，提取基因组，按实施例2所列写的方案对每个胚胎逐一进行 基因型鉴定。结果发现ucp1纯合突变的胚胎脂肪的积累明显减少(图10)。
图10携带fto纯合突变的斑马鱼突变体仔鱼内脂质储存量减少。油红O对发育到4天的斑马鱼仔鱼进行染色，发现与野生型斑马鱼相比较，ucp1突变体斑马鱼仔鱼体内脂肪含量明显减少。

Claims (10)

1.基于FTO基因的人类肥胖症斑马鱼的建立与应用，其特征在首先提供了两个可有效引导Cas9识别斑马鱼fto基因的活性sgRNA，利用活性sgRNA制作了fto基因敲除的斑马鱼突变体，提供了作为人类肥胖症的斑马鱼模型，因而确立了斑马鱼fto基因可作为标识基因应用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。
2.如权利要求1所述的特征，可有效引导Cas9识别斑马鱼fto基因的活性sgRNA分别为sgRNA1和sgRNA3。
3.如权利1所述的特征，斑马鱼的突变体分别为携带了插入4bp和缺失4bp的fto无效等位基因的杂合子，性成熟的杂合子自交产生纯合子作为人类肥胖症的斑马鱼模型。
4.如权利3所述的斑马鱼模型，其斑马鱼仔鱼的年龄为受精后3天、4天、5天、6天和7天。
5.如权利3所述的斑马鱼模型，应用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。
6.如权利1所述的特征，fto基因作为人类肥胖症的标识基因，其纯合突变导致斑马鱼仔鱼脂肪积累受到抑制。
7.如权利6所述的特征，斑马鱼fto基因表达水平的降低指示治疗人类肥胖症的新药物与新方法的筛选与建立。
8.如权利6所述的特征，斑马鱼fto基因可以进行各种基因修饰，包括但不仅限于，在fto位点敲入荧光报告基因，以指示fto基因表达的减少，用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。
9.如权利6所述的特征，斑马鱼fto基因的调控序列可用于驱动包括但不限于荧光报告基因，以制备转基因斑马鱼，用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。
10.如权利要求1所述的特征，斑马鱼的fto基因可以是其它鱼类模式动物的fto基因作为标识基因，用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。
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