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CN109161576B - 促进枯草芽孢杆菌发酵生产n-乙酰神经氨酸的方法 - Google Patents

促进枯草芽孢杆菌发酵生产n-乙酰神经氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种促进枯草芽孢杆菌发酵生产N‑乙酰神经氨酸的方法，属于枯草芽孢杆菌发酵生产N‑乙酰神经氨酸领域。本发明提供的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N‑乙酰神经氨酸的方法，是将能够发酵生产N‑乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养过程中加入裂殖壶菌的菌粉。该促进枯草芽孢杆菌发酵生产N‑乙酰神经氨酸的方法能够有效的提高N‑乙酰神经氨酸的产率。

Description

促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸技术领域，且特别涉及一种促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法。
背景技术
N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid)Neu5Ac是细胞信息传递的第一接触位点，其分子结构具有多样性，因此Neu5Ac参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生、受精等多个生理过程，Neu5Ac还能调节IgG的抗炎活性，增强婴儿免疫力，影响神经细胞的完整性、渗透性及活性，促进婴儿大脑的发育，所以N-乙酰神经氨酸的生产引起了较多的关注和研究。
N-乙酰神经氨酸具有很大的经济价值，其生产方法有很多，如从天然原料中提取、化学合成等，但这些方法均均存在成本高、工艺苛刻、收率低等问题。微生物发酵法也是制备N-乙酰神经氨酸研究较多的方法，其具有成本低、操作简单等优点，目前主要是利用大肠杆菌工程菌发酵得到聚唾液酸和N-乙酰神经氨酸，芽孢杆菌属中的一些菌株，如枯草芽孢杆菌，是GRAS认证的安全菌株，由于不具有致病性、不易受噬菌体污染等优势，也是一种重要的宿主菌，被广泛应用于工业生产。因此，利用构建的芽孢杆菌工程菌生产食品、医药品等添加原料与材料，如N-乙酰神经氨酸，具有很高的安全性和很大的应用前景，但是枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌类基因工程菌发酵生产N-乙酰神经氨酸发酵产量较低，难以满足使用的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其能够有效的提高N-乙酰神经氨酸的产率。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，将能够发酵生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养过程中加入裂殖壶菌的菌粉。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述发酵培养基包括以下成分：甘油10-30g/L；胰蛋白胨2-6g/L；磷酸二氢钾4-8g/L；硫酸铵2-4g/L；七水硫酸镁0.5-2g/L；IPTG1-3mmol/L。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述在发酵培养的第0-72h之间加入裂殖壶菌的菌粉。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述裂殖壶菌的菌粉的添加量为每1L发酵培养基中加入1-4g。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述在发酵培养的第20-24h之间加入裂殖壶菌的菌粉，添加量为2-2.5g/L发酵培养基。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述裂殖壶菌的菌粉是将裂殖壶菌依次使用液体种子培养基和液体发酵培养基培养得到裂殖壶菌菌体，将裂殖壶菌菌体离心、干燥得到。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述液体种子培养基包含以下成分：葡萄糖30-50g/L、谷氨酸钠20-40g/L、酵母浸膏4-8g/L、氯化钠15-25g/L、磷酸二氢钾4-8g/L、硫酸镁6-10g/L。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述液体发酵培养基包含以下成分：葡萄糖50-70g/L、谷氨酸钠20-40g/L、酵母浸膏4-8g/L、氯化钠15-25g/L、磷酸二氢钾4-8g/L、硫酸镁6-10g/L。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述裂殖壶菌的保藏编号为CCTCC NO：M2012494。
进一步地，在本发明较佳实施例中，上述能够发酵生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌是通过将UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入枯草芽孢杆菌中进行外源表达而构建得到的。
本发明实施例的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法的有益效果是：本发明实施例提供了一种促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，将能够发酵生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养过程中加入裂殖壶菌的菌粉。该促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法能够有效的提高N-乙酰神经氨酸的产率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明对比例、实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、制备得到的N-乙酰神经氨酸的产量的柱形对比图；
图2为本发明对比例、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、制备得到的N-乙酰神经氨酸的产量的柱形对比图；
图3为本发明对比例、实施例9、实施例10、实施例11、实施例12制备得到的N-乙酰神经氨酸的产量的柱形对比图；
图4为本发明实施例2、实施例6、实施例10、实施例13制备得到的N-乙酰神经氨酸的产量的柱形对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法进行具体说明。
本发明实施例提供了一种促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其包括以下步骤：将能够发酵生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养过程中加入裂殖壶菌的菌粉。优选的，在发酵培养的第0-72h之间加入裂殖壶菌的菌粉；更优选的，裂殖壶菌的菌粉的添加量为每1L发酵培养基中加入1-4g；进一步优选的，在发酵培养的第20-24h之间加入裂殖壶菌的菌粉，添加量为2-2.5g/L发酵培养基。
本发明实施例提供的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，是通过在能够发酵生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的过程中，加入促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的裂殖壶菌来提高N-乙酰神经氨酸的产率。
在发明一种优选的实施例中，裂殖壶菌的菌粉是将裂殖壶菌依次使用液体种子培养基和液体发酵培养基培养得到裂殖壶菌菌体，随后将裂殖壶菌菌体离心、干燥得到。优选的，液体种子培养基包含以下成分：葡萄糖30-50g/L、谷氨酸钠20-40g/L、酵母浸膏4-8g/L、氯化钠15-25g/L、磷酸二氢钾4-8g/L、硫酸镁6-10g/L。更优选的，液体发酵培养基包含以下成分：葡萄糖50-70g/L、谷氨酸钠20-40g/L、酵母浸膏4-8g/L、氯化钠15-25g/L、磷酸二氢钾4-8g/L、硫酸镁6-10g/L。通过配置合适成分的液体种子培养基和液体发酵培养基，能够促进裂殖壶菌快速的繁殖，从而促进枯草芽孢杆菌对发酵培养基进行发酵产生N-乙酰神经氨酸。
在发明一种优选的实施例中，发酵培养基包括以下成分：甘油10-30g/L；胰蛋白胨2-6g/L；磷酸二氢钾4-8g/L；硫酸铵2-4g/L；七水硫酸镁0.5-2g/L；IPTG1-3mmol/L。通过配置合适成分的发酵培养基，能够促进枯草芽孢杆菌对发酵培养基进行发酵产生N-乙酰神经氨酸。
在发明一种优选的实施例中，裂殖壶菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2012494。该裂殖壶菌已提交至湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号CCTCC NO：M 2012494，采用该裂殖壶菌能够更好的促进能够生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸，有效的提高产率。
在发明一种优选的实施例中，能够发酵生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌是通过将UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入枯草芽孢杆菌中进行外源表达而构建得到的。本发明实施例中优选采用申请号为2014101026333，专利名称为“一种产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法和应用”的中国专利申请中公开的枯草芽孢杆菌，其能够更有效的与本发明实施例提供的裂殖壶菌配合来高效的发酵生产得到N-乙酰神经氨酸。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其主要包括以下步骤：
S11、培养裂殖壶菌，从-80℃的冷藏室中取出使用甘油管保藏的裂殖壶菌菌种，待融化后，吸取0.3mL裂殖壶菌菌种的菌液转接于装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在28℃和180rpm的转速下培养48h得到一级种子液；将一级种子液按体积百分比为5％的接种量接种到装有100ml液体种子培养基的500mL的三角瓶中，在28℃和180rpm的转速下培养96h得到发酵液；将培养96h所得发酵液在5000rpm下离心5min，并用蒸馏水清洗离心三次，弃上清将菌体置于恒温干燥箱中干燥至恒重后，研磨成粉末状，再利用筛子过筛，得裂殖壶菌菌粉。
其中，液体种子培养基包含以下成分：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠30g/L、酵母浸膏6g/L、氯化钠20g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸镁8g/L。液体发酵培养基包含以下成分：葡萄糖60g/L、谷氨酸钠30g/L、酵母浸膏6g/L、氯化钠20g/L、磷酸二氢钾6g/L、硫酸镁8g/L。
S12、培养枯草芽孢杆菌；将保藏于-80℃的枯草芽孢杆菌的菌种接种至固体LB培养基上，于37℃下过夜培养，随后刮取一环平板菌种至具有10mL液体LB培养基的100mL三角瓶中，于37℃和200rpm的转速下恒温震荡培养5h得到种液。
其中，固体LB培养基包括以下成分：胰蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉20g/L；液体LB培养基包括以下成分：胰蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；氯化钠10g/L。
S13、将种液按体积百分比为4％的接种量接种到具有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于37℃和200rpm的转速下培养72h，在培养的第0h(即接种时)添加1g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
其中，发酵培养基包括以下成分：甘油10-30g/L；胰蛋白胨2-6g/L；磷酸二氢钾4-8g/L；硫酸铵2-4g/L；七水硫酸镁0.5-2g/L；IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)1-3mmol/L。
实施例2
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第0h(即接种时)添加2g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例3
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第0h(即接种时)添加3g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例4
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第0h(即接种时)添加4g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例5
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第24h添加1g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例6
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第24h添加2g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例7
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第24h添加3g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例8
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第24h添加4g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例9
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第36h添加1g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例10
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第36h添加2g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例11
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第36h添加3g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例12
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第36h添加4g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
实施例13
本发明实施例提供了一种使用裂殖壶菌促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其与实施例1中步骤大致相同，区别在于，本实施例中，在培养的第48h添加2g/L的上述裂殖壶菌菌粉。
对比例
本对比例提供了一种使用枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其主要包括以下步骤：
S21、培养枯草芽孢杆菌；将保藏于-80℃的枯草芽孢杆菌的菌种接种至固体LB培养基上，于37℃下过夜培养，随后刮取一环平板菌种至具有10mL液体LB培养基的100mL三角瓶中，于37℃和200rpm的转速下恒温震荡培养5h得到种液。
其中，固体LB培养基包括以下成分：胰蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉20g/L；液体LB培养基包括以下成分：胰蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；氯化钠10g/L。
S22、将种液按体积百分比为4％的接种量接种到具有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于37℃和200rpm的转速下培养72h。
其中，发酵培养基包括以下成分：甘油10-30g/L；胰蛋白胨2-6g/L；磷酸二氢钾4-8g/L；硫酸铵2-4g/L；七水硫酸镁0.5-2g/L；IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)1-3mmol/L。
将上所述实施例1至实施例13及对比例培养72h得到的发酵液进行N-乙酰神经氨酸检测，每组实施例均重复进行3次进行检测，对比例重复9次进行检测，得到的数据取平均值；检测方法是：将发酵液在100℃下水浴5min，离心，取上清液进行检测，检测采用高效液相色谱(HPLC)检测法：岛津Lc-15c；检测柱Bio-Rad AMINEX HPX 87H Organic AnalysisColumn(300×7.8mm)；柱温60℃；流动相是6mmol硫酸，流速是0.6ml/min；检测波长210nm。
如图1所示，在发酵培养的第0h(接种时)添加裂殖壶菌时，空白的对照组生产N-乙酰神经氨酸产量为0.78g/L；随着裂殖壶菌添加量逐步提高(0、1、2、3、4g/L)，N-乙酰神经氨酸产量也逐渐增高后保持稳定，当添加2g/L裂殖壶菌菌粉的时候，N-乙酰神经氨酸产量达到最高，为1.2g/L，相对于对照组提高了约58％。
如图2所示，在发酵培养的第24h添加裂殖壶菌时，空白的对照组生产N-乙酰神经氨酸产量为0.78g/L；随着裂殖壶菌添加量逐步提高(0、1、2、3、4g/L)，N-乙酰神经氨酸产量也逐渐增高后保持稳定，当添加2g/L裂殖壶菌菌粉的时候，N-乙酰神经氨酸产量达到最高，为1.41g/L，相对于对照组提高了约81％。
如图3所示，在发酵培养的第36h添加裂殖壶菌时，空白的对照组生产N-乙酰神经氨酸产量为0.76g/L；随着裂殖壶菌添加量逐步提高(0、1、2、3、4g/L)，N-乙酰神经氨酸产量也逐渐增高后保持稳定，当添加2g/L裂殖壶菌菌粉的时候，N-乙酰神经氨酸产量达到最高，为1.01g/L，相对于对照组提高了约33％。
如图4所示，在发酵培养的第0h、24h、36h、48h添加裂殖壶菌时，在发酵培养24h时添加2g/L裂殖壶菌菌粉，N-乙酰神经氨酸产量最高，随着添加时间的推后，N-乙酰神经氨酸产量增幅也逐渐降低。发酵24h添加2g/L裂殖壶菌菌粉，N-乙酰神经氨酸产量达到1.40g/L。
综上所述，本发明实施例提供了一种促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其采用的裂殖壶菌能够有效的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸，相比现有技术可以提高N-乙酰神经氨酸33-81％的产量。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，将能够发酵生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养过程中加入裂殖壶菌的菌粉；所述能够发酵生产N-乙酰神经氨酸的枯草芽孢杆菌是通过将UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因、N-乙酰神经氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入枯草芽孢杆菌中进行外源表达而构建得到的。
2.根据权利要求1所述的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下成分：甘油10-30g/L；胰蛋白胨2-6g/L；磷酸二氢钾4-8g/L；硫酸铵2-4g/L；七水硫酸镁0.5-2g/L；IPTG1-3mmol/L。
3.根据权利要求1所述的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，在发酵培养的第0-72h之间加入所述裂殖壶菌的菌粉。
4.根据权利要求1所述的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌的菌粉的添加量为每1L所述发酵培养基中加入1-4g。
5.根据权利要求1所述的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，在发酵培养的第20-24h之间加入所述裂殖壶菌的菌粉，添加量为2-2.5g/L发酵培养基。
6.根据权利要求1所述的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌的菌粉是将裂殖壶菌依次使用液体种子培养基和液体发酵培养基培养得到裂殖壶菌菌体，将所述裂殖壶菌菌体离心、干燥得到。
7.根据权利要求6所述的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述液体种子培养基包含以下成分：葡萄糖30-50g/L、谷氨酸钠20-40g/L、酵母浸膏4-8g/L、氯化钠15-25g/L、磷酸二氢钾4-8g/L、硫酸镁6-10g/L。
8.根据权利要求6所述的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基包含以下成分：葡萄糖50-70g/L、谷氨酸钠20-40g/L、酵母浸膏4-8g/L、氯化钠15-25g/L、磷酸二氢钾4-8g/L、硫酸镁6-10g/L。
9.根据权利要求1所述的促进枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2012494。
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