[go: up one dir, main page]

CN109161534A - 一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用 - Google Patents

一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109161534A
CN109161534A CN201811074355.XA CN201811074355A CN109161534A CN 109161534 A CN109161534 A CN 109161534A CN 201811074355 A CN201811074355 A CN 201811074355A CN 109161534 A CN109161534 A CN 109161534A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pedv
epidemic diarrhea
vaccine
hbxt
virus strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811074355.XA
Other languages
English (en)
Inventor
刘新生
王永录
方玉珍
周鹏
张永光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN201811074355.XA priority Critical patent/CN109161534A/zh
Publication of CN109161534A publication Critical patent/CN109161534A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一株猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018，属于病毒疫苗技术领域，所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16215。本发明提供了包括所述病毒毒株S蛋白的基因序列的重组载体以及所述重组载体的构建方法。本发明所述病毒毒株位于G2a亚群，与中国疫苗经典毒株CV777分属于不同的群，亲缘关系更接近2010年后爆发的猪流行性腹泻疫情中分离获得的猪流行性腹泻病毒毒株，与现有流行毒株存在的基因型差异较小，可应用于制备猪流行性腹泻疫苗，免疫效果好。

Description

一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性 腹泻疫苗中的应用
技术领域
本发明属于病毒疫苗技术领域，尤其涉及一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的急性、高度接触性的猪肠道传染病。PEDV可以感染各年龄段的猪，但哺乳仔猪更易感染，其死亡率和发病率接近100％。1971年该病首次在英国被发现，随后蔓延至欧洲及亚洲部分国家。2013年美国首次报道了PEDV感染，而后该病迅速蔓延至全美，造成了严重经济损失，从而使得PEDV受到世界各国的关注。我国2010年就曾爆发过严重的PED疫情。近年来，PED的流行更是越来越广泛，新的变异株不断出现，商品化疫苗与流行毒株的抗原性不匹配，免疫效果不佳，从而严重影响着我国养猪业的健康发展。目前市售猪流行性腹泻疫苗几乎全部使用的是经典毒株，与流行毒株存在基因型差异，进而导致疫苗免疫效果较差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株新的、有效候选疫苗的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018，所述病毒毒株PEDVCH/HBXT/2018保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16215。
本发明还提供了一种包括所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018结构蛋白S的基因序列的重组载体。
本发明还提供了所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：
1)从所述的病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018中提取获得RNA；
2)以步骤1)中获得的RNA为模板，用S基因特异性引物进行反转录PCR获得S基因序列；
3)将所述S基因序列与载体连接获得重组载体。
优选的，所述S基因特异性引物包括PEDV-20400F和PEDV-25103R，所述PEDV-20400F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PEDV-25103R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，步骤2)中所述反转录PCR的体系包括以下组分：
所述PEDV-20400F和PEDV-25103R的浓度为10μM。
优选的，步骤3)中反转录PCR的程序包括：
本发明提供了所述猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
优选的，所述猪流行性腹泻疫苗包括灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗。
本发明还提供了所述的重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018在转染细胞的盲传第三代即可使转染细胞表现出显著的细胞病变，说明本发明提供的病毒毒株毒力较强；经遗传进化分析，PEDV CH/HBXT/2018毒株位于G2a亚群，与中国疫苗经典毒株CV777分属于不同的群，亲缘关系更接近2010年后爆发的猪流行性腹泻疫情中分离获得的猪流行性腹泻病毒毒株，与现有流行毒株存在的基因型差异较小，可应用于制备猪流行性腹泻疫苗，免疫效果好。
附图说明
图1为PEDV CH/HBXT/2018毒株P10代细胞病变图；
图2为PEDV CH/HBXT/2018毒株系统进化树图谱；
图3为PEDV CH/HBXT/2018毒株的生长曲线；
图4为电子显微镜观察PEDV CH/HBXT/2018病毒粒子形态；
图5为CH/HBXT/2018毒株致病性分析，A为临床特征；B、C为剖检病变；D-F为HE染色病理检查，F为Mock；G-I为IHC免疫组化检查，I为Mock。
生物保藏说明
本发明提供的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018于2018年08月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.16215。
具体实施方式
本发明提供了一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018，所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.16215。
本发明中所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018来源于中国河北邢台PEDV阳性毒株的样品，所述样品优选为含有PEDV阳性毒株的腹泻仔猪粪便样品。本发明中分离和培养所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018的细胞优选为Vero细胞。本发明中，传代培养所述Vero细胞的培养基优选为DMEM培养基，所述DMEM培养基中优选的还包括体积百分含量为10％的FBS和体积百分含量为1％双抗。
本发明还提供了一种包括上述病毒毒株结构蛋白S的基因序列的重组载体。所述重组载体包括上述病毒毒株完整的S基因序列和载体。
本发明还提供了所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：
1)从所述的病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018中提取获得RNA；
2)以步骤1)中获得的RNA为模板，用S基因特异性引物进行反转录PCR获得完整的S基因序列；
3)将所述S基因DNA与载体连接获得重组载体。
本发明首先从上述的病毒毒株中提取获得RNA；本发明对所述RNA提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的病毒RNA提取方法即可。在本发明具体实施过程中，所述RNA提取优选的采用Viral RNA Mini Kit(Qiagen,Germany)RNA提取试剂盒。
本发明在获得所述RNA后，以步骤1)中获得的RNA为模板，用S基因特异性引物进行反转录PCR获得完整的S基因核苷酸序列；在本发明中，所述S基因特异性引物包括PEDV-20400F和PEDV-25103R，所述PEDV-20400F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PEDV-25103R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明中，所述反转录PCR的体系优选的包括以下组分：
所述PEDV-20400F和PEDV-25103R的浓度为10μM。
所述反转录PCR的程序优选的包括：
本发明在获得所述S基因DNA后，将所述S基因DNA与载体连接获得重组载体。在本发明中，所述载体优选为平末端连接载体，更优选为pCR-XL-2TOPO载体。本发明中所述连接的温度优选为15～17℃，更优选为16℃；所述连接的时间优选为28～32min，更优选为30min。
本发明在获得所述重组载体后，优选的还包括将所述重组载体转入大肠杆菌DH-5α感受态细胞中进行扩增，本发明在所述扩增后，利用酶切鉴定正确的重组载体，将所述正确的重组载体送至生物测序公司进行测序获得病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018的S基因序列。
本发明还提供了所述猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。在本发明中，所述疫苗优选的包括减毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗。在本发明中所述猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018通过减毒、灭活或者克隆其基因组中部分具有免疫原性的基因制备获得减毒疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗。
本发明还提供了所述重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。本发明所述重组载体中包括所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018的S蛋白的基因序列，可应用于大量扩增繁殖所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018的S基因序列，从而在短时间内获得大量需要的病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018S基因序列。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018的分离、培养和鉴定
病料与细胞
病料采集自中国河北邢台，含有PEDV阳性毒株的腹泻仔猪粪便样品用于PEDV的分离鉴定。
Vero细胞由本实验室冷冻保存。该细胞由含体积比为10％的FBS和1％双抗的DMEM培养基进行传代培养。
具体培养过程如下：1、取0.5ml冻存含有PEDV阳性毒株的样品，加入2.5ml不含FBS的DMEM培养基(含1％双抗)及终浓度则为20μg/ml的胰酶，震荡混匀之后室温放置备用；2、取出生长状态良好且几乎铺满细胞瓶的单层细胞，用接近室温的DPBS洗涤3遍后，加入步骤1中准备的病毒液，然后置于含有5％CO2的37℃温箱孵育1h，每隔20min摇匀一次；3、孵育结束后补加5ml新鲜的不含FBS的DMEM培养基(含1％双抗)后置于温箱孵育培养；4、观察细胞是否出现CPE，当CPE达到90％即可收集病毒液。收集该样品培养获得的病毒液，并将所述病毒保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16215。
传代
1、取1.5ml冻存的病毒液，用0.22μm滤器过滤除菌。吸取1ml上述过滤的病毒液，加入2ml MMT(Trypsin终浓度则为20μg/ml)，震荡混匀之后室温放置10min备用。
2、取出生长状态良好且几乎铺满细胞瓶的单层细胞，用接近室温的DPBS洗涤3遍后，加入步骤2中准备的病毒液，然后置于含有5％CO2的37℃温箱孵育1h，每隔20min摇匀一次。
3、孵育结束后补加5ml新鲜的MMT(Trypsin浓度为20μg/ml)后置于温箱孵育培养。
4、每隔一段时间观察细胞是否出现CPE，若72h后仍未病变，收毒后继续盲传6代。若6代后仍未病变且未检测到PEDV，则证明该毒株传毒失败。
所述PEDV CH/HNPJ/2017病毒毒株在第三代就出现了典型CPE，选择该毒株继续进行传代培养，目前已经传至20代，正致力于毒株的致弱。该毒株在细胞中从HPI 6开始出现CPE，细胞皱缩且变圆，聚集成团，形成合胞体；随着感染时间增加，细胞病变面积增大，HPI36细胞已经完全病变，并且出现脱落现象，形成细胞空泡(见图1A-D)。
PEDV CH/HBXT/2018毒株IFA鉴定
免疫荧光检查(IFA)
1、在6孔板中接种毒液，待细胞出现CPE后，弃掉维持培养基；
2、每孔加入1ml固定剂即4％多聚甲醛，放置于4℃冰箱，固定30min；
3、弃掉固定液，每孔加入1ml通透剂即0.25％Tripon-100，室温通透10min，PBS洗板3次，每次5min；
4、5％BSA封闭60min，或10％BSA封闭30min，每孔1ml，封闭后，PBS洗板3次，每次5min；
5、每孔加入1ml以1:2000或1:5000稀释的抗PEDV N蛋白单克隆抗体，37℃孵育60min(或4℃过夜)。PBS洗板3次，每次5min；
6、在避光条件下，每孔加入1ml以1:2000稀释的488标记的抗鼠二抗，37℃孵育60min，
PBS洗板3次，每次5min；
7、每孔加入两滴DAPI(用少许PBS稀释)，室温5min,PBS洗板3次，每次5min，后荧光显微镜观察。
利用PEDV N蛋白单克隆抗体每隔10代鉴定PEDV病毒粒子在Vero细胞中的增殖情况，分不同时间段进行免疫荧光检测。由图1E-H结果显示，PEDV感染细胞后均检测到了特异性绿色荧光。同时，随着感染时间的增加，视野中绿色荧光越多，表明PEDV含量越高。
PEDV CH/HBXT/2018毒株病毒粒子电镜观察
1、收集400毫升病毒液，反复冻融三次，10000rpm于4℃离心1小时，收集细胞上清液。收集的细胞上清液过0.22μM滤膜。将50％PEG-8000加入病毒上清液中，使其终浓度为10％，过夜沉淀病毒，4℃温和搅拌过夜。
2、将上述病毒液-PEG8000混合液放入250ml离心管，12000rpm于4℃离心2h沉淀病毒。
3、TBS悬浮病毒沉淀，制备病毒-TBS混合液，4℃搅拌30min。
4、第一次蔗糖密度离心：将0.5M蔗糖溶液加到病毒上清液的底部，超速离心30000rpm 3小时，4度。弃掉上清，用pH 7.5TBS充分重悬沉淀，然后4℃3000rpm离心10min。
5、第二次蔗糖密度离心：将上述TBS重悬液加入到离心管中(提前加入40％和50％的蔗糖溶液)，30000rpm,4度，离心3小时。离心后吸取病毒带。
6、用尖头镊子夹取铜网置于封口膜上(铜网正面向上)，吸取约10uL毒液滴于铜网上，吸附约15min(操作过程要时刻注意不能混淆正反面)。
7、吸附时间到后用滤纸把铜网上面毒液吸干，然后风干约10min；
8、风干后吸取10μL 2％磷钨酸钠水溶液滴于铜网上负染约20min；
9、负染时间到用滤纸吸干铜网上的溶液，风干约10min，夹取铜网置于铜网盒里面送去电镜。
结果显示CH/BXT/2018病毒粒子形状大致呈椭圆形，直径约100nm左右，四周有明显的似皇冠状的纤突，为冠状病毒的典型特征(图4)。
PEDV CH/HBXT/2018毒株的系统进化关系分析
根据多条PEDV序列比对结果选取保守区域，设计相应扩增引物进行PEDVS基因序列扩增，引物情况如表1所示。将CH/HBXT/2018毒株田间粪便样品以及细胞培养病毒液RNA提取后，利用S基因的特异性引物进行RT-PCR反应。选用平末端连接载体pCR-XL-2TOPO载体进行PCR片段的亚克隆，将酶切鉴定正确的质粒送至公司测序。
表1 PEDV CH/HBXT/2018S基因扩增引物
利用MEGA6.0软件与已知的PEDV毒株S基因序列比对且构建系统进化树。结果显示，该CH/HBXT/2018毒株位于G2a亚群(图2)。自从2010年后，分离到的PEDV流行毒株多数处于G2群，而与中国疫苗毒株CV777分属于不同的群，所以现有的PEDV疫苗未能提供有效的保护力，导致PED疫情的爆发。
实施例2 PEDV CH/HBXT/2018毒株的性能测定
生长曲线
将铺满单层细胞的60dish用PBS清晰3次，加入500μL病毒液(胰酶浓度20ug/ml)，37℃孵育1小时后，补加1.5mLMM，置于含有5％CO237℃培养。在感染后不同时间段收集毒液，置于-80℃冰箱内保存备用。运用qPCR测定病毒含量，绘制不同代次PEDV CH/HBXT/2018毒株的生长曲线，每隔10代测定一次。
用第10代接种单层细胞，测定CH/HBXT/2018毒株生长曲线，利用测定的Ct绘制生长曲线(如图3所示)。由图3可知，在0-30h时，随着感染时间增加病毒含量逐渐增多，病变细胞也同步增加。在接毒后30h培养基中PEDV病毒含量最高，相对应的正常细胞几乎90％病变；峰值过后，随着时间的延长细胞开始脱落从而毒粒子含量不再显著增长。
PEDV CH/HBXT/2018毒株TCID50的测定
1、将经冻融收集的病毒液室温融化，3500rpm离心2分钟，取上清；
2、用DMEM培养基(胰酶浓度20μg/ml)将病毒作连续10倍稀释，即10-1，10-2，……。根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。
3、弃掉细胞培养液，PBS清洗2次；再用维持培养基(MM)洗一次，弃掉(保证孔内无液体残留)。
4、每个稀释度取100μL加入96孔板，每个稀释度作8个重复。在补加100μL MM，终体积为200μL。并设置空白对照，即200μL MM。
5、置于含有5％CO237℃培养。逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数。一般需观察5-7天。结果的计算用Reed-Muench两氏法。
测定P4、P10代的TCID50，每代重复两次。随着培养代数的增加，病毒滴度逐渐增加，P4、P10代的TCID50为别为104.33TCID50/mL和105.33TCID50/mL。
实施例3 PEDV CH/HBXT/2018毒株对仔猪致病性分析
1实验动物的筛选
在规模化猪场采集血清及粪便样品，利用ELISA试剂盒检测仔猪血清是否存在PEDV抗体，且利用QPCR检测仔猪是否存在PEDV的感染。选取检测合格的7日龄仔猪提前在动物房饲养3天，确保实验动物适应周边环境，减少应激反应。
2实验动物的分组
将选取的7日龄仔猪随机分为2组，即G1、G2。每组4头仔猪，每组仔猪进行编号以便区分。G1为实验组，G2为对照组。
3攻毒方式及剂量
将PEDV CH/HBXT/2018毒株P4代毒液用PBS 10倍稀释(TCID50＝104.33/ml)，每头份2mL毒液，口服攻毒。对照组口服PBS。
4动物实验数据收集
自攻毒日起，观察仔猪精神状态、饮食是否发现变化，是否出现腹泻症状。每天分三个时间段(9:00、15:00以及21:00)棉签拭子采集粪便样品，采集的粪便样品用2mL含双抗的DMEM处理，3500rpm/min离心30min，吸取上清液置于-80℃保存备用。提取RNA，实时荧光定量PCR检测仔猪是否存在PEDV感染。在仔猪频临死亡时，心脏处死，立刻剖检，观察肠道宏观变化。将肠道按十二指肠、空肠、回肠、盲肠以及结肠分别取2-3cm，置于10％甲醛溶液固定保存，进行组织病理观察。
仔猪攻毒前毛色、采食、体重均正常，且好动。攻毒后24h仔猪开始发病，粪便样品变稀，个别仔猪精神萎靡，食欲减退，肛门处发红。攻毒后48h，实验组所有仔猪均发病，出现严重的黄色水样腹泻，呈喷射状，且气味恶臭；肛门部位出现肿胀发红，后肢粪便污染严重；部分仔猪食欲废绝，进食后出现不同程度的呕吐现象；所有仔猪出现严重的消瘦，被毛脏乱无规则，喜卧，后肢无力，站立不稳，严重者后肢瘫倒在地，只能靠前肢滑行(见图5)。对照组实验仔猪精神状态良好，饮食正常。
将频临死亡的仔猪心脏处死，进行剖检。如图5所示，肠粘膜充血肿胀，肠壁变薄变透亮，内含大量黄色水样内容物；肠系膜淋巴结出现不同程度的肿大。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaacactat gcatgccaat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctgccaata agtgtgcaac a 21

Claims (9)

1.一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018，其特征在于，所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.16215。
2.一种包括权利要求1所述病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018结构蛋白S的基因序列的重组载体。
3.权利要求2所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：
1)从权利要求1所述的病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018中提取获得RNA；
2)以步骤1)中获得的RNA为模板，用S基因特异性引物进行反转录PCR获得S基因DNA；
3)将所述S基因DNA与载体连接获得重组载体。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述S基因特异性引物包括PEDV-20400F和PEDV-25103R，所述PEDV-20400F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述PEDV-25103R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述反转录PCR的体系包括以下组分：
所述PEDV-20400F和PEDV-25103R的浓度为10μM。
6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，步骤3)中反转录PCR的程序包括：98℃预变性15s；98℃变性，10s，56℃退火，20s，68℃延伸，20s；35个循环；68℃，2min。
7.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HBXT/2018在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述猪流行性腹泻疫苗包括灭活疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗。
9.权利要求2所述的重组载体或权利要求3～6任意一项所述构建方法构建获得的重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
CN201811074355.XA 2018-09-14 2018-09-14 一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用 Pending CN109161534A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811074355.XA CN109161534A (zh) 2018-09-14 2018-09-14 一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811074355.XA CN109161534A (zh) 2018-09-14 2018-09-14 一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109161534A true CN109161534A (zh) 2019-01-08

Family

ID=64879484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811074355.XA Pending CN109161534A (zh) 2018-09-14 2018-09-14 一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109161534A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941241A (zh) * 2021-04-16 2021-06-11 武汉科前生物股份有限公司 一种鉴别猪流行性腹泻病毒2a型与2b型的方法
CN116676340A (zh) * 2023-04-19 2023-09-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种包含猪流行性腹泻病毒免疫蛋白的重组腺病毒载体及其毒株、疫苗和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103301476A (zh) * 2013-04-25 2013-09-18 东北农业大学 猪流行性腹泻病基因重组疫苗及其构建引物和方法
CN104946686A (zh) * 2015-05-29 2015-09-30 广东大华农动物保健品股份有限公司 用于表达猪流行性腹泻蛋白中m蛋白、n蛋白和s1蛋白的重组质粒及其构建方法和应用
CN107073101A (zh) * 2014-04-03 2017-08-18 勃林格殷格翰动物保健公司 猪流行性腹泻病毒疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103301476A (zh) * 2013-04-25 2013-09-18 东北农业大学 猪流行性腹泻病基因重组疫苗及其构建引物和方法
CN107073101A (zh) * 2014-04-03 2017-08-18 勃林格殷格翰动物保健公司 猪流行性腹泻病毒疫苗
CN104946686A (zh) * 2015-05-29 2015-09-30 广东大华农动物保健品股份有限公司 用于表达猪流行性腹泻蛋白中m蛋白、n蛋白和s1蛋白的重组质粒及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAO-WEI HUANG ET AL.: "Origin, Evolution, and Genotyping of Emergent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strains in the United States", 《MBIO》 *
张月 等: "山东省2012年～2016年猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及对其ORF3基因分析", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941241A (zh) * 2021-04-16 2021-06-11 武汉科前生物股份有限公司 一种鉴别猪流行性腹泻病毒2a型与2b型的方法
CN116676340A (zh) * 2023-04-19 2023-09-01 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种包含猪流行性腹泻病毒免疫蛋白的重组腺病毒载体及其毒株、疫苗和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Isolation and characterization of a highly pathogenic strain of Porcine enteric alphacoronavirus causing watery diarrhoea and high mortality in newborn piglets
CN107619822B (zh) 一种猪流行性腹泻病毒弱毒株、其培养方法及应用
CN106636012B (zh) 一种猪盖他病毒毒株、疫苗组合物及其制备方法和应用
Batten et al. Bluetongue virus serotype 26: Infection kinetics and pathogenesis in Dorset Poll sheep
CN105412921B (zh) 一种ⅰ群4型禽腺病毒疫苗
CN110144332B (zh) 一株猪德尔塔冠状病毒毒株及其应用
Takano et al. Molecular characterization and pathogenicity of a genogroup GVI feline norovirus
CN101864447A (zh) 草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白原核表达载体构建及多克隆抗体制备方法
CN107988170A (zh) 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用
CN102221618B (zh) 猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建及疫苗的制备方法
Wang et al. Isolation and characterization of a G9P [23] porcine rotavirus strain AHFY2022 in China
CN107137704A (zh) 一种鸭2型腺病毒灭活疫苗
CN109161534A (zh) 一株基因型2a的猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用
Barril et al. Correlation between rotavirus A genotypes detected in hospitalized children and sewage samples in 2006, Córdoba, Argentina
CN111073862B (zh) 一种牛病毒性腹泻2型减毒毒株及应用
CN109913423A (zh) 一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系及应用
CN109022371A (zh) 一株猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用
CN109402065A (zh) 一种番鸭c亚型禽偏肺病毒弱毒株及其制备和应用
CN107304416A (zh) 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用
CN101186902B (zh) 伪狂犬病病毒sa215和伪狂犬病毒多基因缺失疫苗及其制备方法
CN107722110A (zh) 一种新型的猪轮状病毒疫苗的vp6抗原
CN102876809B (zh) 一种草鱼呼肠孤病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN102533798B (zh) 表达a型口蹄疫病毒空衣壳重组腺病毒及其应用
CN118667772B (zh) 一株g9p[23]基因型猪轮状病毒毒株及其应用
CN103773740A (zh) 猪呼吸与繁殖综合征病毒复制缺陷性病毒疫苗株的构建及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190108

RJ01 Rejection of invention patent application after publication