CN109136246A - 一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物 - Google Patents
一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体表达的多靶向miRNA海绵体序列以miR‑155和miR‑31成熟序列为靶标分子。本发明的质粒载体对miR‑155的抑制作用和对miR‑31的抑制作用存在协同效果；其对肿瘤细胞的抑制作用比单独靶向miR‑155或miR‑31的miRNA海绵序列质粒载体对肿瘤细胞的抑制作用都要显著提高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物技术医药领域，具体地，本发明涉及一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物。
背景技术
癌症是细胞中的基因日积月累发生突变的结果，肿瘤细胞通常积累了多个遗传和表观遗传异常，但是研究发现多种肿瘤的生存和发展仅依赖于某个或者几个激活的致癌蛋白或信号转导通路，如果一旦这些特定的基因或者信号通路被抑制、失活或者阻断，肿瘤细胞就会出现生长和转移被抑制以及凋亡增多的现象，这就是肿瘤细胞的癌基因成瘾。而当MicroRNA(miRNA)在肿瘤发生发展中的功能被越来越多地报道，肿瘤细胞对于起癌基因作用的miRNA的成瘾(oncomiR addiction)也被提出并直接证明，因此miRNA作为癌症治疗靶标分子的研究逐渐成为热点。
miRNA是在真核生物中发现的一类在进化上高度保守具有调控功能的小非编码RNA(18-24碱基)，它们主要通过抑制mRNA翻译或促进其降解参与基因表达水平的调控。在大量生理及病理过程中miRNA都发挥着重要的作用，例如发育、分化、细胞凋亡、癌症及糖尿病等。
miRNA不仅在多种肿瘤中被发现表达异常或者出现突变，而且其突变或者异位表达对肿瘤发生发展具有重要作用。在miRNA生物合成过程中任何步骤的缺陷均可能造成起抑癌作用的它的表达的下调，从而引起下游靶蛋白(癌基因)的表达上调，并最终导致细胞增殖及侵袭能力增强、凋亡减弱和血管生成增强，促进肿瘤的形成。反之起癌基因作用的miRNA(oncomiR)的过表达也是导致肿瘤发生的原因，由于oncomiR基因的扩增，持续性的启动子激活等原因引起表达增加，导致靶基因(抑癌基因)表达下降并引起肿瘤形成。FrankJ.Slacka等在小鼠体内中使用四环素诱导表达系统高表达miR-21后发现小鼠出现血液系统恶性肿瘤，而当撤回miR-21的表达时肿瘤出现消退，说明miR-21起始了小鼠体内肿瘤的形成并且对肿瘤的维持是必要的，也就是小鼠体内的肿瘤对miR-21成瘾。Frank J.Slacka等之后在小鼠淋巴组织中高表达miR-155得到相似的结果。这有力地证明了oncomiR成瘾理论，说明虽然肿瘤细胞中具有多种多样的基因突变，但是抑制特定一个或者几个miRNA的功能就可起到抑制甚至杀伤肿瘤细胞的作用。
因此，诱导特定oncomiR在肿瘤细胞中发生功能缺失从而达到抗肿瘤作用的靶向疗法也正成为一种新兴治疗策略。目前，使miRNA功能缺失的方法主要分为两大类，一是化学合成的寡核苷酸类似物类抑制剂，一是基于载体或病毒的克隆类抑制剂。
化学合成的寡聚核苷酸类miRNA抑制剂包括锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)、化学修饰的寡核苷酸(如antagomiRs)和多肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)等，它们可通过显微注射、静脉注射的方式进入组织及细胞内，瞬时或短期在细胞或体内抑制miRNA的功能。但是，它们进入体内后对于组织没有选择性，例如Jan Krützfeldt等通过尾静脉注射antagomir-16后，在心、肝、肾和骨骼肌等十几种组织器官中都检测到miR-16的沉默。于是Christopher J.Cheng等将靶向肿瘤酸性微环境的多肽pHLIP与miR-155抑制剂结合，使miRNA抑制剂在不引起系统毒性的基础上特异性地抑制肿瘤组织内miR-155功能并抑制肿瘤生长。
基于载体或病毒的克隆类抑制剂是2007年由麻省理工大学的Phillip Sharp等开发的一种长期稳定抑制miRNA的方法。其中起效果的miRNA海绵是一条人为改造的mRNA，其3’非翻译区(UTR)包含若干个在RISC切割位点有几个错配的miRNA靶位点，导致此mRNA在吸附miRNA的同时不会被降解，让miRNA远离其天然的mRNA靶点从而功能出现缺失。作为mRNA，它需由质粒(病毒)载体通过转(感)染进入细胞后介导其在细胞中的表达。相较于化学合成类抑制剂，miRNA海绵可稳定在细胞内表达发挥功能，具有作用效果更加长久的优势。这一方法现被广泛用于miRNA功能缺失转基因动物构建等基础研究领域以及肿瘤靶向治疗的探索研究。如Carlos M.Loya等将miRNA海绵序列置于果蝇UAS(upstream active sequence，UAS)上游激活序列下游，配合带组织特异性启动子的GAL4基因实现了miRNA在果蝇中组织特异性功能缺失，为在果蝇中研究内源miRNA的功能提供了有力工具。
多个研究分别揭示靶向miR-23b、miR-21和miR-10b的海绵序列在肿瘤细胞中高表达后，均表现出高效的肿瘤抑制作用，强烈提示miRNA海绵作为抗肿瘤疗法的潜力。
发明内容
由于申请人多年从事肺癌相关的基础研究，因此本专利申请以肺癌中发病率最高的肺腺癌为研究模型，选取两个在包括肺癌的多种肿瘤中发挥oncomiR功能的miRNA——miR-155和miR-31为靶标分子，研究此多靶向载体系统的效果。
本发明所要解决的技术问题是提供一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，该质粒载体能稳定表达以miR-155和miR-31为靶标分子的miRNA海绵。本发明的质粒载体对miR-155的抑制作用和对miR-31的抑制作用存在协同效果；其对肿瘤细胞的抑制作用比单独靶向miR-155或miR-31的miRNA海绵序列质粒载体对肿瘤细胞的抑制作用都要显著提高。
本发明所要解决的技术问题是还提供上述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法，该构建方法制备得到的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含8个串联重复的miR-155-sponge序列和8个串联重复的miR-31-sponge序列。
本发明所要解决的技术问题是还提供上述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法中使用到的引物组合物。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体表达的多靶向miRNA海绵体序列以miR-155和miR-31成熟序列为靶标分子。
进一步的技术方案中，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含4～8个重复miR-155-sponge序列和4～8个重复的miR-31-sponge序列；所述miR-155-sponge序列与has-miR-155互补并含若干个错配碱基；所述miR-31-sponge序列与has-miR-31互补并含若干个错配碱基。优选的，本发明所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含8个重复miR-155-sponge序列和8个重复的miR-31-sponge序列。
进一步的技术方案中，所述多靶向miRNA海绵体序列中，所述miR-155-sponge序列与has-miR-155的第9-11碱基错配，所述miR-31-sponge序列与has-miR-31的第9-11碱基错配。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案还包括提供一种引物组合物，所述引物组合物用于退火及延伸获得多靶向miRNA海绵体序列并且该多靶向miRNA海绵体序列包含4～8个重复miR-155-sponge序列和4～8个重复miR-31-sponge序列。
进一步的技术方案中，所述引物组合物为2个引物对，分别为获得miR-155-sponge的正、反向引物以及为获得miR-31-sponge的正、反向引物；所述miR-155-sponge和miR-31-sponge 5′端引入第一酶切位点，3′端引入第二酶切位点。所述第一酶和第二酶为质粒pCDH-CMV-EGFP-puro BclI与SalI之间的酶切位点，且两个酶之间的片段长度不能太短，才能顺利将4xmiRNA sponge接入pCDH-CMV-EGFP-puro以及合成后续的多靶向miRNA海绵体序列。
具体地，所述第一酶为EcoR I，所述第二酶为BamH I。
在某些实施方案中，所述引物组合物用于退火及延伸获得多靶向miRNA海绵体序列并且该多靶向miRNA海绵体序列包含4重复miR-155-sponge序列和4重复miR-31-sponge序列。所述引物组合物扩增获得的4重复miR-155-sponge序列如序列表中的序列5所示，4重复的miR-31-sponge序列如序列表中的序列6所示。
在某个实施方案中，所述引物组合物包括以下引物对：1)序列表中的序列1和序列2组成的引物对；2)序列表中的序列3和序列4组成的引物对。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案还包括一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法，包括：
步骤A，获得pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，酶切及测序鉴定质粒序列准确性；
步骤B，根据miRbase中miR-155和miR-31成熟序列设计4重复的海绵序列引物，构建pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒，酶切及测序鉴定质粒序列准确性；
步骤C，利用同尾酶串联4重复海绵序列，构建质粒pCDH-EGFP-8xmi155-puro质粒、pCDH-EGFP-8xmi31-puro质粒、和pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒，酶切鉴定准确性。
更具体地，所述的一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法，包括：
步骤1.多靶向miRNA海绵慢病毒载体系统的设计：根据miRbase中miR-155和miR-31成熟序列分别设计靶向两miRNA成熟序列且第9-11碱基错配的序列，设计一对含有四个错配序列、正反向重叠16个碱基的引物，分别在正、反向引物中引入酶切位点EcoR I和BamHI；
步骤2.构建pCDH-CMV-EGFP-puro质粒；
步骤3.使用步骤1中设计、合成的引物，将正、反向引物退火及延伸，将延伸出的DNA片段酶切后连接进pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，酶切、测序验证质粒，获得分别包含miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒；
步骤4.通过已有的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒获得pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒；通过已有的pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒获得pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒；
步骤5.构建靶向miR-155和miR-31的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro海绵慢病毒载体：
1)将所述步骤4获得的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒和pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒分别双酶切；
a)为获得插入片段8xmi155sp或8xmi31sp，SalI-HF及BclI双酶切pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒或pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒；
b)为获得载体，SalI-HF及BamHI-HF双酶切pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒或pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒；得到开环的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒或开环的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒；
2)将插入片段8xmi155sp与开环的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒连接；或者将插入片段8xmi31sp与开环的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒连接重组质粒转化感受态细胞，单克隆筛选并酶切验证pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒正确性，获得包含miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒。
本发明与现有技术相比，其具有以下有益效果：
(1)尽管通过靶向单一的oncomiR使其功能缺失而发挥抑制肿瘤细胞的效果，然而多靶向的治疗策略利用药物间的协同作用往往能够取得更好的效果。而在肿瘤细胞中同时使用多个miRNA抑制剂也有少数报道，例如H Matsubara等在肺癌细胞系中同时使用靶向miR-17-5p和miR-20a的LNA，发现肺癌细胞凋亡显著增高且增殖明显减慢，但是相较于单一靶向的实验组，双miRNA抑制剂组并没有更强效果，其原因首先可能是成熟miR-17-5p和miR-20a序列高度接近，在细胞中功能可能存在重叠；其次，靶向不同miRNA的寡聚核苷酸类miRNA抑制剂作为独立的分子，将其应用于细胞培养或者动物模型体内时，不能确保不同种类抑制剂同时进入一个细胞内，因此其效果有可能是不同分子在不同细胞里的作用的一个简单的叠加，并不能发挥它们可能存在的协同效果，而本项目所构建慢病毒载体解决了这一问题。
(2)本发明构建了多靶向miRNA海绵序列慢病毒载体系统，此慢病毒感染细胞后可稳定在细胞内发挥作用，并且通过序列串联可具有多靶向的作用。
(3)在载体构建过程中通过设计两条重叠16碱基的引物的退火延伸获得具有4个海绵的序列，兼顾了质粒克隆中需要解决的经济、便捷、准确的需求；同尾酶的应用有效地解决了多个、多种海绵序列在质粒载体中串联的问题。
(4)本发明构建方法制备得到的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含8个串联重复的miR-155-sponge序列和8个串联重复的miR-31-sponge序列；该质粒载体对miR-155的抑制作用和对miR-31的抑制作用存在协同效果；其对肿瘤细胞的抑制作用比单独靶向miR-155或miR-31的miRNA海绵序列质粒载体对肿瘤细胞的抑制作用都要显著提高。
(5)本发明研究了miRNA海绵在肿瘤个性化治疗中的潜能，预期可在检测特定肿瘤细胞特异性高表达的oncomiR后，构建相应的miRNA功能缺失海绵载体，通过慢病毒感染使海绵序列进入细胞抑制oncomiR功能，从而起到抑制肿瘤细胞的作用，为肿瘤治疗提供了新策略。
附图说明
图1为本发明多靶向miRNA海绵体序列质粒载体构建方法的流程示意图(包含病毒包装和感染)。
图2为靶向miR-155和miR-31的海绵序列慢病毒载体系统的引物设计示意图。
图3为7类质粒的酶切产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
图4为miRNA海绵慢病毒载体构建滴度测定荧光检测。
图5为病毒载体质粒包装慢病毒感染肺腺癌细胞系CRL-5810。
图6为miR-31、miR-155海绵体序列慢病毒感染肺癌CRL-5810细胞对细胞生长影响。
图7为inhibitor的对照实验。
附图3中，各个泳道分别为：
a.100bp ladder；
b.pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒酶切产物
c.pCDH-EGFP-8xmi31puro质粒酶切产物；
d.pCDH-EGFP-4xmi31puro质粒酶切产物；
e.pCDH-EGFP-puro质粒酶切产物；
f.pCDH-EGFP-4xmi155puro质粒酶切产物；
g.pCDH-EGFP-8xmi155puro质粒酶切产物；
h.pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒酶切产物；
i.100bp ladder
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1构建靶向8xmi155&31的miRNA海绵慢病毒载体
1.多靶向miRNA海绵慢病毒载体系统的设计：
根据miRbase中miR-155和miR-31成熟序列分别设计靶向两miRNA成熟序列且第9-11碱基错配的序列，设计一对含有四个错配序列、正反向重叠16个碱基的引物，分别在正、反向引物中引入酶切位点EcoR I和BamH I。
两对引物序列如表1所示：
表1
上述引物miR-155-sponge-EcoRI-F和miR-155-sponge-BamHI-R用于扩增获得4xmiR-155 sponge序列，4xmiR-155 sponge序列如序列表中序列5所示。miR-31-sponge-EcoRI-F和miR-31-sponge-BamHI-R用于扩增获得4xmiR-31 sponge序列，4xmiR-31 sponge序列如序列表中序列6所示。
2.验证pCDH-CMV-EGFP-puro质粒：
获得pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，通过酶切、验证等分子克隆技术手段鉴定出正确的质粒克隆。
3.分别构建靶向miR-155的4xmiRNA海绵慢病毒载体和靶向miR-31的4xmiRNA海绵慢病毒载体
使用表1中设计、合成的引物，将正、反向引物退火及延伸，将延伸出的DNA片段酶切后连接进pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，酶切、测序验证质粒，获得分别包含miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒。
1)PCR扩增4xmiR-155目的基因或者4xmiR-31目的基因
a)PCR反应体系如下：
b)变性与退火：将上述反应体系放入94℃的水浴中，使其自然降温至60℃，移至已预热好的PCR扩增仪中，在60℃的条件下反应30s，完成退火。
c)引物延伸：在72℃的条件下反应10min，在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，通过半保留复制得到目的miRNA海绵序列，反应结束后，体系温度维持4℃不变。
2)PCR产物纯化
使用PCR产物纯化试剂盒纯化PCR反应液。
3)PCR产物与pCDH-CMV-EGFP-puro质粒载体酶切
a)BamHI-HF及EcoRI双酶切步骤2中4xmiR-155 PCR产物和pCDH-CMV-EGFP-puro质粒；BamHI-HF及EcoRI双酶切步骤2中4xmiR-31 PCR产物和pCDH-CMV-EGFP-puro质粒。
4)回收4xmiR-155 PCR酶切产物与pCDH-CMV-EGFP-puro质粒载体酶切产物；回收4xmiR-31 PCR酶切产物与pCDH-CMV-EGFP-puro质粒载体酶切产物。
使用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收酶切产物。
5)4xmiR-155 PCR酶切回收产物与开环pCDH-CMV-EGFP-puro质粒载体连接；4xmiR-31 PCR酶切回收产物与开环pCDH-CMV-EGFP-puro质粒载体连接；
T4 DNA ligase连接4xmiR-155 PCR酶切回收产物和开环pCDH-CMV-EGFP-puro质粒载体。T4 DNA ligase连接4xmiR-31 PCR酶切回收产物和开环pCDH-CMV-EGFP-puro质粒载体。
6)重组质粒转化
Trans5α感受态细胞转化连接产物，转化所用LB固体培养基含1/1000100ng/ml浓度的氨苄。
7)单克隆筛选及扩增
单克隆摇菌扩增所用LB培养基含1/1000 100ng/ml浓度的氨苄。
8)质粒回收
使用质粒小提中量试剂盒回收扩增的大肠杆菌得到两种质粒，并测质粒浓度。
9)质粒酶切验证
用XbalI及BamHI-HF双酶切步骤8)中获得的两种质粒与pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，将获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，以pCDH-CMV-EGFP-puro质粒为对照组，步骤8)中两种质粒为实验组，得到三种酶切产物电泳图像，观察实验组电泳图像中小片段的电泳距离是否小于对照组。
对照组小片段是EGFP，若实验组电泳图像中小片段的电泳距离小于对照组，则说明该质粒有片段成功接入。若观察实验组电泳图像中小片段的电泳距离等于对照组，则说明质粒中没有片段接入。
10)质粒测序
若酶切初步判断有片段接入pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，则将菌液送检，测定质粒序列，若测序结果正确，即获得分别包含目的miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒。
11)质粒转化
BclI酶切位点甲基化会影响酶切，使质粒无法切开，所以需要用BMJM110感受态细胞转化连接产物或质粒。但BMJM110感受态细胞转化效率较低，连接产物一般无法直接转化。故先使用Trans5α感受态细胞转化连接产物获得pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒，再使用BMJM110感受态细胞转化质粒排除BclI酶切位点甲基化的影响。转化所用LB固体培养基含1/1000100ng/ml浓度的氨苄。
12)质粒回收
使用质粒小提中量试剂盒回收扩增的大肠杆菌得到两种质粒，并测质粒浓度。
13)酶切验证
用XbalI及BamHI-HF双酶切步骤12)中获得的两种质粒和pCDH-CMV-EGFP-puro质粒进行琼脂糖凝胶电泳，以pCDH-CMV-EGFP-puro质粒为对照组，步骤8)中两种质粒为实验组，观察实验组和对照组电泳图像中小片段的电泳距离，验证pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒的正确性。
4.构建靶向8xmi155和8xmi31的miRNA海绵慢病毒载体
1)pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒酶切。
通过已有的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒获得pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒。通过已有的pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒获得pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒。使用Bcl I和BamH I同尾酶及SalI，将两质粒中miRNA海绵序列进行串联，获得pCDH-EGFP-8xmi155puro质粒、pCDH-EGFP-8xmi31puro质粒和pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒。
为获得载体，使用SalI-HF和BamHI-HF分别双酶切pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒和pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒。
为获得插入片段，使用SalI-HF和BclI分别双酶切pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒和pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒。由于SalI-HF最适酶切温度为37℃，而BclI最适酶切温度为50℃，将酶切体系(不含BclI)先在37℃水浴中反应3h，后加入BclI在50℃水浴中3h。
2)酶切产物琼脂糖凝胶电泳产物回收
使用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收酶切产物。
a)开环pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒载体产物回收
为从酶切产物的琼脂糖凝胶电泳的胶块中回收得到载体，则回收的质粒片段应是电泳距离较短的片段，即质量较大的片段。
b)插入片段产物回收
为从酶切产物的琼脂糖凝胶电泳的胶块中回收得到载体，则回收的质粒片段应是电泳距离较长的片段，即质量较小的片段。
插入片段4xmi31sp与开环pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒载体连接。插入片段4xmi155sp与开环pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒载体连接。
T4 DNA ligase连接插入片段4xmi155sp酶切回收产物和开环pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro，T4 DNA ligase连接插入片段4xmi31sp酶切回收产物和开环pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro。
重组质粒的转化
Trans5α感受态细胞转化连接产物，转化所用LB固体培养基含1/1000100ng/ml浓度的氨苄。
5)单克隆筛选及扩增
单克隆摇菌扩增所用LB培养基含1/1000 100ng/ml浓度的氨苄。
6)质粒回收
使用质粒小提中量试剂盒回收扩增的大肠杆菌得到两种质粒，并测质粒浓度。
7)质粒酶切验证
用XbalI及BamHI-HF双酶切步骤6)中获得的两种质粒与pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒、pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒，获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，以pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒和pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒为对照组，步骤6中两种质粒为实验组，得到四种酶切产物电泳图像，观察8xmiR-155(8xmiR-31)实验组电泳图像中小片段的电泳距离是否小于其对照组。
对照组小片段是EGFP-4xmi155(或EGFP-4xmi31)，若实验组电泳图像中小片段的电泳距离小于其对照组，则说明该质粒有片段成功接入。若观察实验组电泳图像中小片段的电泳距离等于对照组，则说明质粒中没有片段接入。
8)质粒转化
BclI酶切位点甲基化会影响酶切，使质粒无法酶切，所以需要用BMJM110感受态细胞转化连接产物或质粒。但BMJM110感受态细胞转化效率较低，连接产物无法直接转化，故先使用Trans5α感受态细胞转化连接产物获得pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒和pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒，再使用BMJM110感受态细胞转化质粒排除BclI酶切位点甲基化的影响。
转化所用LB固体培养基含1/1000 100ng/ml浓度的氨苄。
9)质粒回收
使用质粒小提中量试剂盒回收扩增的大肠杆菌得到两种质粒，并测质粒浓度。
10)酶切验证
用XbalI及BamHI-HF双酶切步骤9中获得的两种质粒和pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒、pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒，获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，以pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒和pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒为对照组，步骤9中两种质粒为实验组，观察实验组和对照组电泳图像中小片段的电泳距离，验证pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒的正确性。
5.构建靶向8xmi155&31的miRNA海绵慢病毒载体
1)pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒质粒酶切。
a)为获得插入片段，SalI-HF及BclI双酶切pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒质粒，将酶切体系(不合BclI)先在37℃水浴中反应3h，后加入BclI在50℃水浴中3h。
b)为获得载体，SalI-HF及BamHI-HF双酶切pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒。
2)酶切产物琼脂糖凝胶电泳产物回收
a)开环pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒载体产物回收
b)插入片段产物回收；
3)插入片段与开环pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒载体的连接
T4 DNA ligase将插入片段8xmi155sp与开环的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒连接
4)重组质粒的转化
Trans5α感受态细胞转化连接产物，转化所用LB固体培养基含1/1000 100ng/ml浓度的氨苄。
5)单克隆筛选及扩增
单克隆摇菌扩增所用LB培养基含1/1000 100ng/ml浓度的氨苄。
质粒回收
使用质粒小提中量试剂盒回收扩增的大肠杆菌得到质粒，并测质粒浓度。
7)质粒酶切验证
酶切产物琼脂糖凝胶电泳法验证验证pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒正确性，获得包含miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒。
8)菌种保存
6.酶切鉴定准确性
经过以上步骤，分别获得了pCDH-CMV-EGFP-puro质粒、pCDH-EGFP-4xmi155puro质粒、pCDH-EGFP-4xmi31puro质粒、pCDH-EGFP-8xmi155puro质粒、pCDH-EGFP-8xmi31puro质粒和pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒质粒。
1)酶切产物质粒
XbalI及BamHI-HF双酶切以上7种产物质粒。
2)琼脂糖凝胶电泳，结果见附图3；
附图3中，各个泳道分别为：
a.100bp ladder；
b.pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒酶切产物
c.pCDH-EGFP-8xmi31puro质粒酶切产物；
d.pCDH-EGFP-4xmi31puro质粒酶切产物；
e.pCDH-EGFP-puro质粒酶切产物；
f.pCDH-EGFP-4xmi155puro质粒酶切产物；
g.pCDH-EGFP-8xmi155puro质粒酶切产物；
h.pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒酶切产物；
i.100bp ladder
实施例2靶向miR-155和miR-31的8xmi155&31miRNA海绵慢病毒包装及抑制肿瘤细胞生长效果检测
1)使用实施例1制备的质粒在HEK-293T细胞中包装慢病毒。
2)使用梯度病毒量感染HEK-293T细胞检测海绵慢病毒载体的滴度，获得最适感染肺腺细胞的病毒浓度。如图4所示，显示了293T细胞miRNA海绵慢病毒载体低度测定荧光表达情况。
3)检测得出20ul病毒为最适病毒量，确定用量后感染肺腺癌细胞系CRL-5810细胞。
4)使用实施例1中构建的病毒载体质粒包装慢病毒感染肺腺癌细胞系CRL-5810，如图5所示，检测miRNA海绵序列表达对细胞的生长的影响。
如图6所示，显示了单独靶向miR-155的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro慢病毒载体、单独靶向miR-31的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro慢病毒载体、靶向miR-155&31的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro慢病毒载体感染肺癌CRL-5810细胞对细胞生长影响。
图6显示，靶向miR-155&31的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro慢病毒载体对肿瘤细胞的抑制作用比单独靶向miR-155或单独靶向miR-31的miRNA海绵序列质粒载体对肿瘤细胞的抑制作用都要显著提高
实施例3化学合成的寡聚核苷酸类miRNA抑制剂inhibitor对照实验
目前，化学合成的寡核苷酸类似物类抑制剂是使miRNA功能缺失的主要方法之一。理论上通过靶向单一的oncomiR使其功能缺失而发挥抑制肿瘤细胞的效果，多靶向的治疗策略利用药物间的协同作用往往能够取得更好的效果。但一些实验表明相较于单一靶向的实验组，双miRNA抑制剂组并没有更强效果。因此，我们设计了一套基于miRNA海绵结构、同时靶向多个miRNA的慢病毒载体系统，将在此项目中研究靶向2个oncomiR的海绵对于肿瘤的抑制作用。
为检验miRNA海绵的联合靶向作用，设立inhibitor对照组，使用化学合成的寡聚核苷酸类miRNA抑制剂作对照，设置negative control、miR-31 inhibitor、miR-155inhibitor、miR-31 inhibitor&miR-155 inhibitor四组
1)购买靶向miR-155和miR-31的miRNA寡聚核苷酸类抑制剂。
2)使用X-tremeGene HP DNA transfection reagent试剂法分别将四组miRNAinhibitors转染入肺腺癌细胞系CRL-5810。
3)2天后使用步骤2)中已转染miRNA inhibitor的肺腺癌细胞系CRL-5810，如图7所示，使用相同的方法检测miRNA inhibitor对细胞生长的影响。
图7显示，miR-31 inhibitor、miR-155 inhibitor、miR-31 inhibitor&miR-155inhibitor三组对肺腺癌细胞的抑制作用接近于相同。miR-31 inhibitor&miR-155inhibitor组与miR-31 inhibitor组或miR-155 inhibitor组相比，并没有体现更强的效果。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
如上所述，便可以较好地实现本发明。
Claims (10)
1.一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其特征在于，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体表达的多靶向miRNA海绵体序列以miR-155和miR-31成熟序列为靶标分子。
2.如权利要求1所述的一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其特征在于，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含4～8个重复miR-155-sponge序列和4～8个重复的miR-31-sponge序列；所述miR-155-sponge序列与has-miR-155互补并含若干个错配碱基；所述miR-31-sponge序列与has-miR-155互补并含若干个错配碱基。
3.如权利要求2所述的一种多靶向miRNA海绵体序列，其特征在于，所述miR-155-sponge序列与has-miR-155的第9-11碱基错配，所述miR-31-sponge序列与has-miR-31的第9-11碱基错配。
4.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物用于退火及延伸获得多靶向miRNA海绵体序列并且该多靶向miRNA海绵体序列包含4～8个重复miR-155-sponge序列和4～8个重复miR-31-sponge序列。
5.如权利要求4所述一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物为2个引物对，分别为获得miR-155-sponge的正、反向引物以及为获得miR-31-sponge的正、反向引物；所述miR-155-sponge和miR-31-sponge 5′端引入第一酶切位点，3′端引入第二酶切位点。
6.如权利要求5所述一种引物组合物，其特征在于，所述第一酶为EcoR I，所述第二酶为BamH I。
7.如权利要求6所述一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括以下引物对：1)序列表中的序列1和序列2组成的引物对；2)序列表中的序列3和序列4组成的引物对。
8.一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法，其特征在于，包括：
步骤A，获得pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，酶切及测序鉴定质粒序列准确性；
步骤B，根据miRbase中miR-155和miR-31成熟序列设计4重复的海绵序列引物，构建pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒，酶切及测序鉴定质粒序列准确性；
步骤C，串联4重复海绵序列，构建质粒pCDH-EGFP-8xmi155-puro质粒、pCDH-EGFP-8xmi31-puro质粒、和pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒，酶切鉴定准确性。
9.一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法，其特征在于，包括：
步骤1.多靶向miRNA海绵慢病毒载体系统的设计：根据miRbase中miR-155和miR-31成熟序列分别设计靶向两miRNA成熟序列且第9-11碱基错配的序列，设计一对含有四个错配序列、正反向重叠16个碱基的引物，分别在正、反向引物中引入酶切位点EcoR I和BamH I；
步骤2.构建pCDH-CMV-EGFP-puro质粒；
步骤3.使用步骤1中设计、合成的引物，将正、反向引物退火及延伸，将延伸出的DNA片段酶切后连接进pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，酶切、测序验证质粒，获得分别包含miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒；
步骤4.通过已有的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒获得pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒；通过已有的pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒获得pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒；
步骤5.构建靶向miR-155和miR-31的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro海绵慢病毒载体：
1)将所述步骤4获得的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒和pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒分别双酶切；
a)为获得插入片段8xmi155sp或8xmi31sp，SalI-HF及BclI双酶切pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒或pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒；
b)为获得载体，SalI-HF及BamHI-HF双酶切pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒或pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒；得到开环的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒或开环的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒；
2)将插入片段8xmi155sp与开环的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒连接；或者将插入片段8xmi31sp与开环的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒连接重组质粒转化感受态细胞，单克隆筛选并酶切验证pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒正确性，获得包含miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒。
10.权利要求1所述的多靶向miRNA海绵体序列质粒载体在制备治疗或预防癌症药物中的应用。
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