CN109136188A - 一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用 - Google Patents
一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用方法，通过对少量的活检肿瘤组织进行培养及传代，可培养出与其来源癌组织遗传背景高度一致，其遗传突变与对应组织标本中的突变高度匹配的类器官，同时培养的类器官还可以冻存和复苏，培养和药效测试时间较短，培养成本较PDTX模型经济，建立肿瘤类器官标本库可以实现高通量筛选药物，培养的类器官可以测试样本射线敏感性等等，应用广泛。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤类器官培养的方法，具体是一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用。
背景技术
在肿瘤研究中，特别是在新型药物的筛选，个体化治疗的评估研究上 PDTX模型(人来源肿瘤异种移植于免疫缺陷小鼠模型)取得一定的成效，移植肿瘤也保留了原代肿瘤的分化程度、形态特征、结构特点以及分子生物学基本特性和肿瘤微环境。但是，这种模型也有它的缺陷之处，PDTX模型虽然模拟了原代肿瘤的生物学特性，能为肿瘤的研究提供体内模拟环境，但这种模型的建立毕竟不是完全和原代肿瘤相同，而且成瘤模型时间长，建立模型相对困难，免疫缺陷动物成本高，同时也存在一定的伦理问题。PDTX 模型，在肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和神经胶质瘤的研究中均有报道。但我们可以看到，这种肿瘤移植模型的建立是比较困难的，特别是一些肿瘤位置例如消化道肿瘤，因其原位处于消化道腔内，其移植的成活率和成功率都是很低的，因此阻碍了其广泛应用，只限制于某些特殊肿瘤。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种活检肠道肿瘤类器官的培养、传代、冻存和复苏方法及其应用，以克服现有技术存在的缺陷。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种活检肠道肿瘤类器官的培养方法，包括如下步骤：
1)取米粒至黄豆大小的活检肿瘤组织并置于冰PBS(penicillin 100IU/ml+streptomycin 100μg/ml)缓冲液中；
2)采用预冷5-10分钟的PBS(penicillin100IU/ml+streptomycin 100μg/ml)缓冲液多次冲洗干净活检肿瘤组织；
3)无菌切碎肿瘤组织并移入预热至37℃的酶消化液中，震荡消化 30-60分钟；
4)消化完毕后使用移液枪反复吹打直至肿瘤碎片消失，并以 100g-300g转速离心5分钟；
5)去除上清，60gx 5分钟反复离心多次；
6)去除上清，加10ml预冷PBS(penicillin 100IU/ml+streptomycin 100μg/ml)缓冲液，取10ul显微镜下观察计数隐窝数量， 100-300g 5分钟离心，去干净上清，以100-300个隐窝/50ul Matrigel比例重悬3D培养类器官。
还提供一种活检肠道肿瘤类器官的传代方法，包括如下步骤：
1)取根据上述方法制备的原代类器官，去除培养基，1ml PBS 缓冲液清洗一遍去除液体，重新加入1ml冰PBS缓冲液，用枪头反复打碎Matrigel，移入50ml离心管；
2)100g-300g离心5分钟，去除上清，加冰PBS缓冲液重悬，反复吹打，此步骤重复3-5次至无凝胶存在，类器官被均匀打碎；
3)最后一次离心后，去干净PBS缓冲液，Matrigel重悬，按照 1∶3-1∶5比例接种培养。
还提供一种活检肠道肿瘤类器官的冻存和复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)冻存：传代类器官培养3-5天后，按照传代方法步骤1)-2) 中的清洗方式清洗至最后一次，去除PBS缓冲液后加入 95％FBS+5％DMSO制成的冻存液，将冻存盒放入-80℃冰箱，16小时后移入液氮存放；
2)解冻：冻存类器官从液氮中取出后37℃水浴迅速解冻并移入含10％FBS的DMEM中，100-300g离心得沉淀，按上述培养方法进行接种培养。
最后，还提供了一种活检肠道肿瘤类器官的应用，其用于化疗药物测试，步骤如下类器官传代不同代数以100-200个类器官/25μl接种48孔板， 24小时后加不同浓度5-氟尿嘧啶(5-FU)(1μm/L，10μm/L，100μ m/L，300μm/L)或者伊立替康(CPT-11)(0.1μm/L，1μm/L，10μm/L，100 μm/L)化疗药物，每三天更换培养液，6天后拍摄存活克隆及cck8方法测试存活率。其用于射线敏感性测试，步骤如下：类器官传代，不同代数以 100-200个类器官/25μl接种48孔板，24小时后X线不同剂量 (0Gy，3Gy，6Gy，9Gy，12Gy和15Gy)照射，每三天更换培养液，6天后拍摄存活克隆及cck8方法测试存活率。
本发明的有益效果是：通过对少量的活检肿瘤组织进行培养及传代，可培养出与其来源癌组织遗传背景高度一致，其遗传突变与对应组织标本中的突变高度匹配的类器官，同时培养的类器官还可以冻存和复苏，培养和药效测试时间较短，培养成本较PDTX模型经济，建立肿瘤类器官标本库可以实现高通量筛选药物，培养的类器官可以测试样本射线敏感性等等，应用广泛。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一、活检肠道肿瘤类器官的培养方法
1.米粒至黄豆大小的活检肿瘤组织置于冰PBS(penicillin 100IU/ml+streptomycin 100μg/ml)。
2.预冷PBS(penicillin 100IU/ml+streptomycin 100μg/ml) 5-10分钟清洗多次，按照样品干净程度。
3.无菌切碎肿瘤组织移入预热酶消化液中，37℃水浴消化30-60 分钟。
4.消化完毕后移液枪反复吹打直至肿瘤碎片消失，100g-300g离心 5分钟。
5.去除上清，60gx 5分钟反复离心多次。
6.去除上清，加10ml预冷PBS，取10μl显微镜下观察计数隐窝数量，100-300g 5分钟离心，去干净上清，Matrigel重悬3D 培养类器官(100-300个隐窝/50μl Matrigel)。
二、类器官的传代
1.原代隐窝培养5-10天，去除培养基，1mlPBS清洗一遍去除液体，重新加入1ml冰PBS，用枪头反复打碎Matrigel，移入50ml离心管。
2.100g-300g离心5分钟，小心去除上清，加冰PBS重悬，反复吹打，此步骤重复3-5次至无凝胶存在，同时类器官被均匀打碎。
3.最后一次离心后，去干净PBS，Matrigel重悬，1∶3-1∶5接种培养。
三、类器官冻存和复苏
1.传代类器官培养3-5天后，按传代方法清洗至最后一次，去除PBS 后加入适量冻存液(95％FBS+5％DMSO)，冻存盒放入-80℃冰箱，16小时后移入液氮存放。
2.冻存类器官从液氮中取出后37℃水浴迅速解冻并移入含 10％FBS的DMEM中，100-300g离心得沉淀，按原代接种方式接种培养。
四、类器官的化疗药物测试
类器官传代，不同代数以100-200个类器官/25μl接种48孔板， 24小时后加不同浓度5-FU(1μm/L，10μm/L，100μm/L，300μm/L)或者CPT-11(0.1μm/L，1μm/L，10μm/L，100μm/L)等化疗药物，每三天更换培养液，6天后拍摄存活克隆及cck8方法测试存活率。
五、类器官的射线敏感测试
类器官传代，不同代数以100-200个类器官/25μl接种48孔板， 24小时后X线不同剂量(0Gy，3Gy，6Gy，9Gy，12Gy和15Gy)照射，每三天更换培养液，6天后拍摄存活克隆及cck8方法测试存活率。
消化酶：1％FBS DMEM(Gibco)含
Collagenase IV(Sigma)，300-600IU/ml；
Ly27632(Sigma)，5-20μM
培养液：Advanced DMEM/F12 medium(Gibco)含
1x N2(Invitrogen)；
1X B27(Invitrogen)；
Nicotinamide(Sigma)，5-20mM；
human EGF(Peprotech)，50-100ng/ml；
Gastrin(Sigma)，10-30nM；
A83-01(Sigma)，300-500nM；
SB202190(Sigma)，3-10μM；
Prostaglandin E2(Peprotech)，10-50nM；
Normocin(Invitrogen)，100-300mg/ml；
Glutamax(Gibco)，10-50mM；
HEPES(Gibco)，10-50mM；
N-acetylcysteine(Sigma)，1-5μM；
R-spondin 1(Peprotech)，500-1000ng/ml；
Noggin(Peprotech)，100-500ng/ml；
本发明具有如下优点：
1.少量的活检肿瘤组织即可符合提取要求。
2.肠道癌组织经消化后可以非常方便的培养出肿瘤类器官。
3.培养的肠道肿瘤类器官遗传背景与其来源癌组织遗传背景高度一致，其遗传突变与对应组织标本中的突变高度匹配。
4.培养的肠道肿瘤类器官可以冻存和复苏。
5.培养和药效测试时间较短，培养成本较PDTX模型经济。
6.同一标本类器官可以测试不同种药物，不存在PDTX模型个体差异。
7.建立肿瘤类器官标本库可以实现高通量筛选药物。
8.培养的类器官可以测试样本射线敏感性。
9.不存在伦理问题。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种活检肠道肿瘤类器官的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取米粒至黄豆大小的活检肿瘤组织并置于冰PBS缓冲液中；
2)采用预冷5-10分钟的PBS缓冲液多次冲洗干净活检肿瘤组织；
3)无菌切碎肿瘤组织并移入预热至37℃的酶消化液中，震荡消化30-60分钟；
4)消化完毕后使用移液枪反复吹打直至肿瘤碎片消失，并以100g-300g转速离心5分钟；
5)去除上清，60gx5分钟反复离心多次；
6)去除上清，加10m1预冷PBS缓冲液，取10μl显微镜下观察计数隐窝数量，100-300g5分钟离心，去干净上清，以100-300个隐窝/50μl Matrigel比例重悬3D培养类器官。
2.根据权利要求1所述的一种活检肠道肿瘤类器官的培养方法，其特征在于：所述PBS缓冲液为penicillin 100IU/ml+streptomycin 100μg/ml混合制成，酶消化液为1％FBSDMEM+Collagenase IV300-600IU/ml+Ly27632 5-20μM混合制成。
3.一种活检肠道肿瘤类器官的传代方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取根据权利要求1方法制备的原代类器官，去除培养基，1ml PBS缓冲液清洗一遍去除液体，重新加入1ml冰PBS缓冲液，用枪头反复打碎Matrigel，移入50ml离心管；
2)100g-300g离心5分钟，去除上清，加冰PBS缓冲液重悬，反复吹打，此步骤重复3-5次至无凝胶存在，类器官被均匀打碎；
3)最后一次离心后，去干净PBS缓冲液，Matrigel重悬，按照1∶3-1∶5比例接种培养。
4.一种活检肠道肿瘤类器官的冻存和复苏方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)冻存：传代类器官培养3-5天后，按照权利要求2所述的步骤1)-2)清洗方法清洗至最后一次，去除PBS缓冲液后加入95％FBS+5％DMSO制成的冻存液放入冻存盒，将冻存盒放入-80度冰箱，16小时后移入液氮存放；
2)解冻：冻存类器官从液氮中取出后37℃水浴迅速解冻并移入含10％FBS的DMEM中，100-300g离心得沉淀，按权利要求1所述方法进行接种培养。
5.一种活检肠道肿瘤类器官的应用，其用于化疗药物测试，其特征在于：类器官传代，不同代数以100-200个类器官/25μl接种48孔板，24小时后加浓度分别为1μm/L、10μm/L、100μm/L、300μm/L的5-氟尿嘧啶或者0.1μm/L、1μm/L、10μm/L、100μm/L的伊立替康化疗药物，每三天更换培养液，6天后拍摄存活克隆及cck8方法测试存活率。
6.一种活检肠道肿瘤类器官的应用，其用于射线敏感性测试，其特征在于：类器官传代，不同代数以100-200个类器官/25μl接种48孔板，24小时后X线不同剂量0Gy、3Gy、6Gy、9Gy、12Gy和15Gy照射，每三天更换培养液，6天后拍摄存活克隆及cck8方法测试存活率。
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