CN109136159A

CN109136159A - 一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法和应用

Info

Publication number: CN109136159A
Application number: CN201810886485.7A
Authority: CN
Inventors: 杨锴; 石虎; 王振华; 马兴树; 陈淑芳; 杨广平
Original assignee: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明公开了一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法和应用，所述cam和ompA双基因共表达菌株构建方法，按照cam基因和ompA基因的PCR扩增、cam基因和ompA基因连接质粒以及转化表达菌和目的基因的共表达的步骤依次进行。本发明所提供的构建方法简单，过程易于控制，PCR扩增过程中所用引物特异性强，双基因与质粒连接的过程简单，共表达菌株中含有cam和ompA双基因，双基因表达的成功率高；双基因共表达的Camp蛋白和OmpA蛋白具有交叉免疫保护能力，在临床上能更好地预防鸭疫里默菌病。

Description

一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种双基因表达菌株的构建方法及其应用，具体地说是一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法和应用。

背景技术

鸭疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）能感染鸭、鹅、火鸡及猪和狗等多种动物，主要侵害 1-8 周龄特别是 2-5周龄的雏鸭。一旦感染鸭疫里默菌病，可造成鸭饲料转化率低、生长发育迟缓及高发病率和高死亡率等不良影响，因此鸭疫里默菌病已成为危害养鸭业最严重的疾病之一，给养鸭业带来严重的经济损失。

而该病呈全球流行，计有21个血清型。目前国内报道RA流行菌株的血清型有 1，2，3，4，5，6，7，8，10，11，13，14，15型，且各血清型之间没有交叉免疫保护作用，因此目前现有技术广泛应用的灭活疫苗、弱毒疫苗的治疗效果低，而亚单位疫苗即通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗，因其不含核酸，安全性好，可为多种血清型RA 提供交叉免疫保护，并且可与抗生素同用，所以成为预防RA最理想的疫苗，具有广阔的市场前景。

cam基因所编码的Camp蛋白是多数血清型RA共有的毒力因子，具有类似于溶血性巴氏杆菌唾液酸蛋白酶的功能，在细菌致病过程中起到关键作用。因此，鸭疫里默菌Camp蛋白亚单位疫苗也可被用于预防或治疗雏鸭的RA感染。ompA在菌株的毒力和诱导机体免疫应答方面有着重要的功能，且目前所报道的所有血清型RA中均含ompA基因，且OmpA蛋白具有较高的交叉保护能力。因此，构建表达cam和ompA基因工程菌株，制备高效共表达Camp蛋白和OmpA蛋白的亚单位疫苗具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的，是要解决现有技术中灭活疫苗与弱毒疫苗所存在的对鸭疫里默菌病治疗效果低的问题，旨在提供一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，以期能够实现高效共表达Camp蛋白和OmpA蛋白；

本发明的另外一个目的，是要提供前述方法所构建的cam和ompA双基因共表达菌株的应用。

本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：

一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，它按照如下步骤依次进行：

（1）cam基因和ompA基因的PCR扩增

提取血清Ⅰ型和Ⅱ型鸭疫里默菌Riemerella anatipestifer，RA基因组DNA，cam基因以血清Ⅱ型RA基因组DNA为模板进行PCR扩增，ompA基因以血清Ⅰ型RA基因组DNA为模板进行PCR扩增；

（2）cam基因和ompA基因连接质粒

将扩增纯化后的cam基因和ompA基因分别通过限制性内切酶酶切，所得ompA目的基因和cam目的基因依次连接至同样限制性内切酶酶切后的表达载体中，转化，筛选阳性克隆，提取质粒；

（3）转化表达菌及目的基因的共表达

将步骤（2）所提取的质粒，通过热激法转入表达菌株中，经PCR检测的阳性菌株进行冻存及目的蛋白诱导表达。

作为本发明的一种限定，步骤（1）中所述cam基因PCR扩增的引物序列为：

上游引物：5’-ACGCGTCGACATGAAACAATCTATTATCTTAGG-3’

下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACTTTACATTTAACTCATATC-3’。

作为本发明的第二种限定，步骤（1）所述ompA基因PCR扩增的引物序列为：

上游引物：5’-ACGCGACGTCATGGGTAAAGAATTTATGTTG-3’

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTTTCTTTTCTTTTTTACTAC-3’。

作为本发明的第三种限定，所述cam基因的PCR扩增体系为：5×Buffer：10μL，dNTPs：5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，Pfu酶：0.5μL，DNA模板：2μL，ddH₂O：30.5μL，共50μL；

所述ompA基因的PCR扩增体系为：5×Buffer：10μL，dNTPs：5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，Pfu酶：1.0μL，DNA模板：4μL，ddH₂O：28μL，共50μL。

作为本发明的进一步限定，所述dNTPs是dATPs、dTTPs、dCTPs和dGTPs中的一种或至少两种。

作为本发明的第五种限定，

①94℃预变性5min；

②94℃变性40s；

③56℃复性40s；

④68℃延伸2min；

②-④ 循环30次；

⑤72℃延伸10 min；

扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

本发明还有一种限定，所述共表达菌株为大肠杆菌BL21（DE3）。

本发明还提供了前述构建方法所构建的cam和ompA双基因共表达菌株的一种应用，它应用于预防鸭疫里默菌病。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的有益效果是：

（1）本发明提供的菌株中含有cam和ompA双基因，其中cam基因所编码的Camp蛋白是多数血清型RA共有的毒力因子，具有类似于溶血性巴氏杆菌唾液酸蛋白酶的功能，在细菌致病过程中起到关键作用。ompA在菌株的毒力和诱导机体免疫应答方面有着重要的功能，且目前所报道的所有血清型RA中均含ompA基因，且OmpA蛋白具有较高的交叉保护能力。因此，cam和ompA基因工程菌株，高效共表达Camp蛋白和OmpA蛋白可有效预防鸭疫里默菌病；

（2）本发明所提供的构建方法简单，过程易于控制，PCR扩增cam和ompA双基因过程中，所用的引物特异性强，能快速扩增出目的片段，cam和ompA双基因与pETDuet-1质粒连接的过程简单，克隆载体和表达载体选择合适，连接的成功率高，共表达菌株中含有cam和ompA双基因，双基因表达的成功率高。

本发明的构建方法适用于构建一种cam和ompA双基因共表达菌株，该菌株进一步地可应用于预防鸭疫里默菌病。

附图说明

图1 为pETDuet-1质粒图谱；

图2 为以RA基因组DNA为模板PCR扩增的cam基因和ompA基因的结果图中M为DNA分子质量标准，H₂O为阴性对照；

图3 PCR扩增后的cam基因和ompA基因切胶回收结果；M为DNA分子质量标准；

图4 Trans2-Blue/pEASY-Blunt Simple/ompA的鉴定结果图；M为DNA分子质量标准，左图为菌落PCR鉴定Trans2-Blue/pEASY-Blunt Simple/ompA两个AMP⁺阳性的结果，编号为O1和O2，其中O2菌落为假阳性，中图为O1菌落的质粒，右图为O1质粒经Aat Ⅱ和Xho Ⅰ内切酶酶切结果；

图5为pEASY-Blunt Simple/ompA质粒酶切结果，由左图可见酶切后有目的条带（ompA基因），成功回收到ompA基因； M为DNA分子质量标准，左图为切胶回收前，右图为切胶回收后；

图6为菌落PCR检测20个DH5α/pETDuet-1/ompA菌落结果，由图可见12个菌落为阳性，挑取4个菌落培养后，提取质粒，酶切鉴定，M为DNA分子质量标准，1～20为20个AMP⁺阳性菌落，其中3-7，9，12，16，17，19号菌落为PCR阳性，H₂O为未加模板的对照；

图7为图6中6，9，12和16号菌落的质粒经Aat Ⅱ和Xho Ⅰ内切酶酶切结果，由图可知四个菌落的质粒酶切后均为阳性，其中6号质粒样品处理可能存在一定问题，电泳后条带弯曲，其余三个质粒均有1161bp的ompA条带和5420bp的载体条带；M为DNA分子质量标准，6，9，12和16分别为图6中6，9，12和16号菌落的质粒；

图8 Trans2-Blue/pEASY-Blunt Simple/cam的鉴定结果图；M为DNA分子质量标准，左图为菌落PCR鉴定Trans2-Blue/pEASY-Blunt Simple/cam 24个AMP阳性的结果，编号为1-24，其中1，3-13，15，16，18，19，21，23，24号菌落为PCR阳性菌落，右图为1号菌落的质粒，大小符合预期；

图9为pETDuet-1/ompA和pEASY-Blunt Simple/cam经过Sal Ⅰ和Not Ⅰ酶切后及切胶回收后的电泳检测结果；M为DNA分子质量标准，左图为pETDuet-1/ompA（编号pET/ompA）和pEASY-Blunt Simple/cam（编号pEA/cam）经过Sal Ⅰ和Not Ⅰ酶切后结果，右图为切胶回收后检测结果1为回收的cam基因，2为回收的pETDuet-1/ompA；

图10为以cam基因引物通过菌落PCR检测20个DH5α/pETDuet-1/cam/ompAAMP阳性菌落，由图可知20个菌落均为PCR阳性（均有1026bp的cam基因条带）；M为DNA分子质量标准，1～20号为20个AMP⁺阳性的DH5α/pETDuet-1/ cam / ompA菌落的PCR结果，全部为阳性；

图11为图10中1、2、3、6、8、9和10号菌落的质粒，由图可见9号质粒较小，与预期不符，其余6个质粒大小符合预期大小，取1号质粒进行酶切鉴定；M为DNA分子质量标准，除9号质粒大小不符合预期外，其余均为预期大小；

图12为图11中1号质粒经sal Ⅰ和Not Ⅰ内切酶双酶切，sal Ⅰ、Not Ⅰ、Aat Ⅱ和XhoⅠ内切酶四酶切结果，由图可见双切后出现两条目的条带，即pETDuet-1/ompA质粒（6562bp）和cam片段（1026bp），四酶切后出现三条目的条带，即pETDuet-1（5394bp）质粒，ompA（1161bp）片段和cam片段（1026bp），由此可见1号质粒为pETDuet-1/cam/ompA阳性质粒；M为DNA分子质量标准，双切为sal Ⅰ和Not Ⅰ内切酶酶切结果，四切为sal Ⅰ、Not Ⅰ、Aat Ⅱ和Xho Ⅰ内切酶酶切结果；

图13为图12中鉴定为阳性的pETDuet-1/cam/ompA质粒转化BL21(DE3)感受态后，构建的BL21(DE3)/pETDuet-1/ cam /ompA菌落的质粒，由图可知转化后的菌落提取的质粒大小符合预期；M为DNA分子质量标准，1为BL21(DE3)/pETDuet-1/ cam /ompA菌落的质粒；

图14为图13中菌落培养后，37℃，180rpm条件下，通过IPTG诱导后的，经SDS-PAGE检测蛋白表达的结果，Camp蛋白约为37.6kDa（Camp蛋白加6个组氨酸标签），OmpA蛋白为44kDa（OmpA蛋白加15个S标签），图中箭头所指位置为目的蛋白条带；M为蛋白分子质量标准，其中对照泳道为BL21(DE3)/pETDuet-1/cam /ompA诱导前样品，诱导泳道为诱导后的样品，图中箭头所指位置分别为OmpA蛋白和Camp蛋白位置；

图15为实施例4到实施例12实验结果的SDS-PAGE 电泳检测图。M为蛋白分子质量标准，前为诱导前菌体；1-9依次为实施例4-12的条件下蛋白表达结果，10为终浓度1mM IPTG诱导蛋白表达结果。图中箭头所指位置分别为OmpA蛋白和Camp蛋白位置。

具体实施方式

本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。

以下实施例只用于说明本发明，而并不限定本发明。

下述实施例中所用试剂如无特殊说明，均为现有的本领域技术人员通用的试剂；所用的试验方法，如无特殊说明，均为现有的试验方法。

下述实施例中：快速质粒小提试剂盒（StarPrep Plasmid Miniprep Kit200rxn），购自北京康润诚业生物科技有限公司；

快速胶回收试剂盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit 200rxn），购自北京全式金生物技术有限公司；

pEASY -Blunt Simple载体购自北京全式金生物技术有限公司；

pETDuet-1载体购自Novagen公司，载体信息见图1。

表达菌株BL21(DE3)于2018年03月29日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.15529；建议的分类命名是：大肠埃稀氏菌（Escherichia coli）。

实施例1 鸭疫里默菌的分离鉴定

无菌采集病死鸭心、肝、脑病变组织，分别接种于含1.5%小牛血清的TSA培养基，于5%CO₂培养箱中37℃培养24h，挑取菌落分别接种于含有1.5%的TSA培养基、麦康凯培养基和巧克力琼脂培养基，检查生长情况；同时进行革兰染色，镜检，观察菌体形态及染色特性。

在TSA培养基和巧克力琼脂平板上，生长为乳白色、圆形、稍隆起、边缘整齐、表面光滑的中等大小菌落，菌落直径1-2mm，而在麦康凯培养基上不生长。取菌落涂片，革兰染色镜检，可见革兰阴性单个或成对的短小杆菌。瑞氏染色镜检呈蓝色，两极浓染。

将TSA培养基上的纯培养菌接种于细菌微量生化反应管，37℃培养24~48h，观察生化反应管颜色变化。根据表中生化反应结果，确定分离菌为鸭疫里默菌。

实施例2 鸭疫里默菌血清型鉴定

玻片凝集实验，用接种环挑取TSA培养基中培养物与1滴未稀释的抗血清混匀，为防接种物与血清不发生凝集，可来回倾斜玻片。注意观察结果，出现清晰的乳白色絮状凝集块者，即判定为阳性。

实施例3 一种cam和 ompA双基因共表达菌株的构建方法

本实施例按照以下步骤顺序进行：

1. cam基因和ompA基因的PCR扩增

以血清Ⅰ型和Ⅱ型鸭疫里默菌基因组DNA为模板，利用PCR分别对cam基因和ompA基因进行扩增，在PCR扩增过程中，cam基因扩增以血清Ⅱ型RA的基因组DNA为模板，ompA基因以血清Ⅰ型RA的基因组DNA为模板。具体步骤如下：

（1）cam基因和ompA基因引物序列的设计

根据GenBank上cam基因序列（登录号：AF202727.1）和ompA基因序列（登录号：AY606207.1），设计具体如下：

（2）cam基因和ompA基因的获得

1）模板DNA

将-75℃冻存的血清Ⅰ型和Ⅱ型RA菌株划线接种至TSA平板培养基，于37℃烛缸中培养48h后，挑取单菌落接种至含2.5%小牛血清的TSB培养基，37℃，180 rpm振荡培养48h后提取基因组DNA，cam基因以血清Ⅱ型RA的基因组DNA为模板进行PCR扩增，ompA基因以血清Ⅰ型RA的基因组为模板进行PCR扩增。

2）PCR扩增体系：

PCR扩增cam基因体系为：5×Buffer：10μL，dNTPs：5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，Pfu酶：0.5μL，DNA模板：2μL，ddH₂O：30.5μL，共50μL。

PCR扩增ompA基因的体系为：5×Buffer：10μL，dNTPs：5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，Pfu酶：1.0μL，DNA模板：4μL，ddH₂O：28μL，共50μL。

dNTPs为dATPs、dTTPs、dCTPs和dGTPs中的一种或几种。

3） PCR扩增cam基因和ompA基因的程序均为：

①94℃预变性5min；

②94℃变性40s；

③56℃复性40s；

④68℃延伸2min；

②-④ 循环30次；

⑤72℃延伸10 min；

扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

4）PCR扩增的产物分别经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒回收cam基因和ompA基因，具体结果见图2，图3。由图可知，cam基因和ompA基因条带大小符合预期，切胶纯化后用于克隆载体的连接。

cam基因经扩增后的产物序列经由华大基因公司测序后，结果如下：

atgaaacaatctattatcttaggtatagaatcctcttgtgatgatacttctgccgctattatttctggtagaaaaattctttctaatgtagccgctactcaagccattcataatgagtacggtggcgtggtgccagagctggcctctagggcacatcagcaaaatatcattcctgtcatagagcaatctatacaaaaagcaaatatacaacaaaatgagatttgtgccataggttttacgagaggtcctggacttttgggctctttactggtaggaacttcctttgcgaagtctttagcaatgagtttggaagctccattgatagaggttaatcaccttcaggctcatattttggctcattttatagaagatgccaatcctaatccgcccaagtttccttttttatgccttacagtaagtggtgggcatacaatgattgtcttggttaaagactattttgatatggaaattattgggaaaaccatagatgatgccgcaggtgaagcctttgataaaataggaaaaatatttgatttagattatcctgctggacctatcatagataagaaatctcaaaatggaagtcctaatgcatttacatttaataagcctaaactagagggctacgactattcttttagcggaattaaaacttcggtgttgtactttatacaaaaagaattaaagaaaaatcctcagtttgtcaatgaaaatatagatgatttgtgtgcatctgttcagaaaaatattattgaaatattgatgacaaaactagagaaagctgctagtgatttaggcattaaagaaatagcgatagctggtggggtttcggctaactctgccttgagacaagctatgagagaaaacgaacaaaagttaggttggaatatctatattcccaaatttgaatatactacggacaatgctgcaatgatagcaatggtagcccaactaaaatacgaaaggggagagtttgccaacctttctacaacggctactgcaagatatga gttaaatgtaaagtaa

cam基因经过PCR扩增后，产物的长度为1026bp（去除保护碱基和酶切位点）。

ompA基因经扩增后的产物序列经由华大基因公司测序后，结果如下：

atgggtaaagaatttatgttgatgactggacttggtcttcagcttaaatttgcaggtcttctttttggcaacgaagatgcatggtttgacccttatgtaagagttggagccaactatttgagacacgactatacaggtcttacgttccctgtgactgatagctacaatgatgtaacttacgcggggtatagcgaaaataaaccatacactcaaggaagagcggatcattttgctttatcaacaggtttaggtacaaacatttggttaactaagaactttggtcttggtatccaaggggattatgtttctactccagtagataagtctagattggctaacttttggcaagcgtcagcttcattgaactttagatttggtaacagagataaggataaggatggagtgttagataaagacgatttatgttcagaaacaccaggtttacctgaattccaaggttgtccagatacagatggtgacggtgttccagataaagatgataactgtccagaagtagcaggaccagtagaaaacaatggttgcccttggccagatacagacaaagatggtgtattggataaagacgatgcttgtgttgatgtagcaggaccagctgaaaataacggttgcccttggccagatacagataatgatggagtattagataaagatgataagtgtcctaatgttccaggtcttccagaatacaaaggttgtcctaagcctcaggaagcgtatgcagttgaagcaacaggagcattaaagggtatattctttaactttaataaagcatctatcagatctgaatctaatactaagttagatcaagctgctgaagtgattaagtcttctaacggaggtactttcttagtagttggtcatacagatgttaaaggtaatgctaactataacttgaaactttctagagaaagagctgcatctgtagtagctgctttagaagctagaggtgttaacccatctcagttaaaatctaaaggagttggttctgctgaagctacagttcctgcatctgcttctaacgaagagagaatgaaagacagaaaagtggttgtagaagcaatcagcggatctgcttgggaagctcttcagaagtctgatcttccagtagtgaagaaaaaagtagtaaaaaagaaaagaaaa

ompA基因经过PCR扩增后，产物的长度为1161bp（去除保护碱基和酶切位点）。

cam基因和ompA基因连接质粒

（1）cam基因与pEASY -Blunt Simple载体连接

4μL cam基因与1μL pEASY -Blunt Simple质粒在25℃连接30min后，将5μL连接产物转化至Trans2-Blue感受态细胞。转化方法按照如下的步骤顺序依次进行：

1）将5μL连接产物中加入50μL的Trans2-Blue感受态细胞中，于冰盒中静置30min；

2） 42℃热激30s后，置冰盒中静置2min；

3）加入450μL不含抗生素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养60min；

4）预先将X-gal、IPTG均匀涂布于含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；

5）振荡培养后的菌液均匀涂布至上述平板培养基，37℃过夜培养；

6）挑取白色菌落，进行菌落PCR鉴定；

PCR扩增体系为：模板DNA：2μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，2×HIFI MIXⅡ：10μL，ddH₂O ：6μL；共20μL。

PCR扩增条件为：

①94℃预变性5min；

②94℃变性40s；

③56℃复性40s；

④72℃延伸1 min；

②-④ 循环35次；

⑤72℃延伸10 min；

扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图8，图9，由图可知，1，3-13，15，16，18，19，21，23，24号菌落为PCR阳性克隆菌。选取1号菌落提取质粒，并进行酶切回收cam基因。

（2）ompA基因与pEASY -Blunt Simple载体连接

4μL ompA基因与1μL pEASY -Blunt Simple质粒于25℃连接30min后，将5μL连接产物转化至Trans2-Blue感受态细胞。转化方法按照如下的步骤顺序依次进行：

2）42℃热激30s后，置冰盒中静置2min；

6）挑取白色菌落，进行菌落PCR鉴定；

PCR扩增体系为：DNA模板：2μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，2×HIFI MIXⅡ：10μL，ddH₂O：6μL；共20μL。

PCR扩增条件为：

①94℃预变性5min；

②94℃变性40s；

③56℃复性40s；

④72℃延伸1 min；

②-④ 循环35次；

⑤72℃延伸10 min；

扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4，由图可知，1号菌落为PCR阳性克隆菌。进一步对阳性质粒进行酶切鉴定。

酶切鉴定体系及方法：参照快速质粒小提试剂盒说明，提取上述步骤中PCR检测为阳性菌的质粒，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，结果显示目的条带大小符合预期。然后对该质粒进行双酶切鉴定；

双酶切鉴定体系10 μL：

37℃过夜酶切，65℃失活20min后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）ompA基因的酶切回收

ompA基因酶切体系：pEASY -Blunt Simple/ompA 质粒，39μL；Aat Ⅱ内切酶，3μL；XhoⅠ内切酶，3μL；10×Buffer，5μL；共50μL。37℃水浴加热过夜酶切。

酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，按照快速胶回收试剂盒操作说明，回收酶切后的ompA基因，结果见图5。

（4）ompA基因与pETDuet-1质粒连接

连接体系：pETDuet-1质粒，5μL；ompA基因，3μL；T4 DNA连接酶，1μL；10×Buffer，1μL，共10μL。16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至DH5α感受态细胞，转化方法按照如下的步骤顺序依次进行：

1）将10μL连接产物中加入100μL的DH5α感受态细胞中，于冰盒中静置30min；

2）42℃热激30s后，置冰盒中静置2min；

3）加入400μL不含抗生素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养60min；

4）预先将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h后备用；

6）挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定；

PCR扩增体系为：模板DNA：2μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，2×HIFI MIXⅡ：10μL，ddH₂O：6μL；共20μL。

PCR扩增条件为：

①94℃预变性5min；

②94℃变性40s；

③56℃复性40s；

④68℃延伸2 min；

②-④ 循环30次；

⑤72℃延伸10 min；

扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1、图6、图7，由图可知，3-7，9，12，16，17，19号菌落为PCR阳性克隆菌。进一步对阳性质粒进行酶切鉴定。

酶切鉴定体系及方法：参照快速质粒小提试剂盒说明，提取上述步骤（2）中PCR检测为阳性菌的6，9，12，16号质粒，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，结果显示目的条带大小符合预期。然后对该质粒进行双酶切鉴定；

双酶切鉴定体系20 μL：

37℃过夜酶切，65℃失活20min后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测

（5）cam基因的酶切回收

cam基因酶切体系：pEASY -Blunt Simple/cam 质粒，83μL；Not Ⅰ内切酶，3.5μL；SalⅠ内切酶，3.5μL；10×Buffer， 10 μL；共100μL。37℃水浴，过夜酶切。

酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，按照快速胶回收试剂盒操作说明，回收酶切后的cam基因，结果见图9。

（6）cam基因与pETDuet-1/ompA质粒连接

连接体系：pETDuet-1/ompA质粒，5μL；cam基因，3μL；T4 DNA连接酶，1μL；10×Buffer，1μL，共10μL。16℃过夜连接，将10μL连接产物转化至DH5α感受态细胞，转化方法按照如下的步骤顺序依次进行：

1）将10μL连接产物中加入50μL的DH5α感受态细胞中，于冰盒中静置30min；

2） 42℃热激60s后，置冰盒中静置2min；

4）预先将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h后备用；

6）挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定；

PCR扩增体系为：模板 2μL，上游引物 1μL，下游引物 1μL，2×HIFI MIXⅡ 10μL，ddH₂O6μL；共20μL。

PCR扩增条件为：

①94℃预变性5min；

②94℃变性40s；

③56℃复性40s；

④72℃延伸1 min；

②-④ 循环35次；

⑤72℃延伸10 min；

扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图10，由图可知，1-20号菌落为PCR阳性克隆菌。进一步对阳性质粒进行酶切鉴定。

酶切鉴定体系及方法：参照快速质粒小提试剂盒说明，提取上述步骤（2）中PCR检测为阳性菌的1，2，3，6，8，9，10号质粒，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，结果显示除9号质粒之外，其它质粒大小符合预期，见图11。然后对1号质粒进行双酶切和四酶切鉴定；

双酶切鉴定体系50 μL：

37℃过夜酶切，65℃失活20min后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测

四酶切鉴定体系50 μL：

37℃过夜酶切，65℃失活20min后，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图12。

3.转化表达菌株及目的基因的共表达

将鉴定后的pETDuet-1/cam/ompA质粒转入表达菌株BL21(DE3)中，形成BL21(DE3)/pETDuet-1/cam/ompA菌株（该菌株保藏于CGMCC；保藏号为CGMCC No.15529；建议的分类命名是：大肠埃稀氏菌），诱导表达蛋白，具体的转入过程按照如下的步骤顺序依次进行：

1）将10μL质粒加入100μL的BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min；

2）42℃热激40s后，置冰盒中静置2min；

4）将含100mM AMP的LB平板，37℃放置2h备用；

6）选取阳性菌落接种至含100mM AMP的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养16h，提取质粒，同时以1:100比例接入新鲜培养基后将其培养至对数期后，加入IPTG，于37℃的诱导温度下12h，诱导表达蛋白。用12%的SDS-PAGE凝胶电泳检测菌株的诱导表达产物，结果见图13，图14。

实施例4-12 cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法

实施例4-12分别为cam和ompA双基因共表达菌株的一种构建方法，它们的步骤与实施例3相似，不同之处仅在于：

每一实施例的步骤3转化表达菌及目的基因的共表达，将pETDuet-1/cam/ompA质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，将其在加有不同浓度的葡萄糖和乳糖的培养基中培养，诱导表达蛋白，诱导温度和时间不同，具体为：

实施例4，葡萄糖浓度2g/L、乳糖浓度2g/L、诱导温度28℃，诱导时间4h，诱导表达蛋白。

实施例5，葡萄糖浓度2g/L、乳糖浓度6g/L诱导温度32℃，诱导时间8h，诱导表达蛋白。

实施例6，葡萄糖浓度2g/L、乳糖浓度10g/L诱导温度37℃，诱导时间12h，诱导表达蛋白。

实施例7，葡萄糖浓度6g/L、乳糖浓度2g/L、诱导温度32℃，诱导时间12h，诱导表达蛋白。

实施例8，葡萄糖浓度6g/L、乳糖浓度:6g/L诱导温度37℃，诱导时间4h，诱导表达蛋白。

实施例9，葡萄糖浓度6g/L、乳糖浓度10g/L诱导温度28℃，诱导时间8h，诱导表达蛋白。

实施例10，葡萄糖浓度10g/L、乳糖浓度2g/L、诱导温度37℃，诱导时间8h，诱导表达蛋白。

实施例11，葡萄糖浓度10g/L、乳糖浓度6g/L诱导温度28℃，诱导时间12h，诱导表达蛋白。

实施例12，葡萄糖浓度10g/L、乳糖浓度10g/L诱导温度32℃，诱导时间4h，诱导表达蛋白。

实施例4-12的结果见图15。

实施例13 免疫试验（实施例3-12所构建的cam和 ompA双基因共表达菌株的应用）

试验动物：樱桃谷肉鸭，每组20只；

试验材料：免疫用菌株为实施例3-12所提供的BL21(DE3)/pETDuet-1/cam/ompA工程菌（BPCO），10⁹CFU/mL；攻毒用菌株为血清Ⅰ型和Ⅱ型鸭疫里默菌（RA1和RA2）10¹⁰CFU/mL。

攻毒后发病雏鸭表现发呆、拉稀、卧地不起、眼鼻分泌物增多和拉黄绿色稀粪等临床症状。剖解病死鸭，可见特征性病理变化：心包膜表面有一层白色纤维素性渗出物，常与胸壁粘连；气囊混浊、囊壁增厚，有纤维素性渗出物附着；肝脏表面覆盖一层灰黄色的纤维素性膜，易剥离。自病死鸭分离细菌，经生化鉴定符合鸭疫里默菌生化特性。由表可见，血清Ⅰ型鸭疫里默菌不致死雏鸭，血清Ⅱ型鸭疫里默菌可致死雏鸭。再由死亡率来看，免疫BL21(DE3)/pETDuet-1/cam/ompA工程菌后，雏鸭对鸭疫里默菌病可起到一定的预防作用，免疫效果同自家灭活苗。可见，实施例3-12所构建的cam和ompA双基因共表达菌株能更好地预防鸭疫里默菌病。

实施例1-13，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

序列表

<110> 河北科星药业有限公司

<120> 一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法和应用

<141> 2018-08-02

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 1

atgaaacaat ctattatctt aggtatagaa tcctcttgtg atgatacttc tgccgctatt 60

atttctggta gaaaaattct ttctaatgta gccgctactc aagccattca taatgagtac 120

ggtggcgtgg tgccagagct ggcctctagg gcacatcagc aaaatatcat tcctgtcata 180

gagcaatcta tacaaaaagc aaatatacaa caaaatgaga tttgtgccat aggttttacg 240

agaggtcctg gacttttggg ctctttactg gtaggaactt cctttgcgaa gtctttagca 300

atgagtttgg aagctccatt gatagaggtt aatcaccttc aggctcatat tttggctcat 360

tttatagaag atgccaatcc taatccgccc aagtttcctt ttttatgcct tacagtaagt 420

ggtgggcata caatgattgt cttggttaaa gactattttg atatggaaat tattgggaaa 480

accatagatg atgccgcagg tgaagccttt gataaaatag gaaaaatatt tgatttagat 540

tatcctgctg gacctatcat agataagaaa tctcaaaatg gaagtcctaa tgcatttaca 600

tttaataagc ctaaactaga gggctacgac tattctttta gcggaattaa aacttcggtg 660

ttgtacttta tacaaaaaga attaaagaaa aatcctcagt ttgtcaatga aaatatagat 720

gatttgtgtg catctgttca gaaaaatatt attgaaatat tgatgacaaa actagagaaa 780

gctgctagtg atttaggcat taaagaaata gcgatagctg gtggggtttc ggctaactct 840

gccttgagac aagctatgag agaaaacgaa caaaagttag gttggaatat ctatattccc 900

aaatttgaat atactacgga caatgctgca atgatagcaa tggtagccca actaaaatac 960

gaaaggggag agtttgccaa cctttctaca acggctactg caagatatga gttaaatgta 1020

aagtaa 1026

<210> 2

<211> 1161

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 2

atgggtaaag aatttatgtt gatgactgga cttggtcttc agcttaaatt tgcaggtctt 60

ctttttggca acgaagatgc atggtttgac ccttatgtaa gagttggagc caactatttg 120

agacacgact atacaggtct tacgttccct gtgactgata gctacaatga tgtaacttac 180

gcggggtata gcgaaaataa accatacact caaggaagag cggatcattt tgctttatca 240

acaggtttag gtacaaacat ttggttaact aagaactttg gtcttggtat ccaaggggat 300

tatgtttcta ctccagtaga taagtctaga ttggctaact tttggcaagc gtcagcttca 360

ttgaacttta gatttggtaa cagagataag gataaggatg gagtgttaga taaagacgat 420

ttatgttcag aaacaccagg tttacctgaa ttccaaggtt gtccagatac agatggtgac 480

ggtgttccag ataaagatga taactgtcca gaagtagcag gaccagtaga aaacaatggt 540

tgcccttggc cagatacaga caaagatggt gtattggata aagacgatgc ttgtgttgat 600

gtagcaggac cagctgaaaa taacggttgc ccttggccag atacagataa tgatggagta 660

ttagataaag atgataagtg tcctaatgtt ccaggtcttc cagaatacaa aggttgtcct 720

aagcctcagg aagcgtatgc agttgaagca acaggagcat taaagggtat attctttaac 780

tttaataaag catctatcag atctgaatct aatactaagt tagatcaagc tgctgaagtg 840

attaagtctt ctaacggagg tactttctta gtagttggtc atacagatgt taaaggtaat 900

gctaactata acttgaaact ttctagagaa agagctgcat ctgtagtagc tgctttagaa 960

gctagaggtg ttaacccatc tcagttaaaa tctaaaggag ttggttctgc tgaagctaca 1020

gttcctgcat ctgcttctaa cgaagagaga atgaaagaca gaaaagtggt tgtagaagca 1080

atcagcggat ctgcttggga agctcttcag aagtctgatc ttccagtagt gaagaaaaaa 1140

gtagtaaaaa agaaaagaaa a 1161

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

acgcgtcgac atgaaacaat ctattatctt agg 33

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

atttgcggcc gcttacttta catttaactc atatc 35

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

acgcgacgtc atgggtaaag aatttatgtt g 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

ccgctcgagt tttcttttct tttttactac 30

Claims

1.一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于：它按照如下步骤依次进行：

（1）cam基因和ompA基因的PCR扩增

（2）cam基因和ompA基因连接质粒

（3）转化表达菌及目的基因的共表达

将步骤（2）所提取的质粒通过热激法转入表达菌株中，经PCR检测的阳性菌株进行冻存及目的蛋白诱导表达。

2.如权利要求1所述的一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述cam基因PCR扩增的引物序列为：

上游引物：5’-ACGCGTCGACATGAAACAATCTATTATCTTAGG-3’

下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTACTTTACATTTAACTCATATC-3’。

3.如权利要求1所述的一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述ompA基因PCR扩增的引物序列为：

上游引物：5’-ACGCGACGTCATGGGTAAAGAATTTATGTTG-3’

下游引物：5’-CCGCTCGAGTTTTCTTTTCTTTTTTACTAC-3’。

4.如权利要求1所述的一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于：

所述cam基因的PCR扩增体系为：5×Buffer：10μL，dNTPs：5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，Pfu酶：0.5μL，DNA模板：2μL，ddH₂O：30.5μL，共50μL；

5.如权利要求4所述的一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于：所述dNTPs是dATPs、dTTPs、dCTPs和dGTPs中的一种或至少两种。

6.如权利要求1所述的一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于：所述cam基因和ompA基因的PCR扩增程序为：

①94℃预变性5min；

②94℃变性40s；

③56℃复性40s；

④68℃延伸2min；

②-④ 循环30次；

⑤72℃延伸10 min；

扩增完成后，扩增产物于4℃保存。

7.如权利要求1所述的一种cam和ompA双基因共表达菌株的构建方法，其特征在于：所述共表达菌株为大肠杆菌BL21（DE3）。

8.一种cam和ompA双基因共表达菌株的应用，其特征在于：它应用于预防鸭疫里默菌病。