CN109097467A - 基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用，该分型检测试剂盒包括a）降解mRNA建库试剂、引物及磁珠模块；b）文库定量试剂模块；c）上机测序试剂模块；所述的引物包括Bio‑B‑TVN引物、Primer‑A随机引物、Primer‑A引物、Primer‑B引物，磁珠为包被有链霉素的磁性珠粒，Bio‑B‑TVN引物上的生物素可与磁珠包被的链霉素相结合。本发明通过3’端测序的方式使得获取的mRNA即便有部分降解亦可对样本的整个转录组进行精确定量。通过传统应用乳腺癌FFPE样本表达谱分析的微阵列及个别基因表达定量的荧光定量手段不能实现十分精准的分析，而通过3’末端测序的方法可以达到精确定量的目的。

Description

基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测FFPE样本乳腺癌基因表达谱对乳腺癌进行分子分型的检测试剂盒及应用。

背景技术

目前乳腺癌在临床仍以患者年龄、原发瘤大小、临床分期、组织学分级、腋窝淋巴结转移和激素受体状态等指标，预测乳腺癌预后和指导选择治疗方案。但乳腺癌个体差异性较显著，上述标准无法进一步精确地预测预后，难以满足乳腺癌治疗方案“个体化”。比较分析乳腺正常组织和肿瘤的基因表达谱，可以明确mRNA水平的基因表达差异，从而根据基因表达情况预测患者的临床转归，采取相应诊疗措施。基于基因表达谱的各种乳腺癌标签表现出更加客观、准确的预后预测能力，具有良好的发展前景。

自20世纪90年代中期基因芯片的出现，便被广泛用于癌症相关的基因表达谱分析，并用于预测人类癌症中复杂多样的生物学特征和临床特征。虽然基因表达谱分析被广泛应用于人类癌症的研究中，但在患者的临床治疗方面的应用却受到很大的局限。这是由于目前所获得的大部分临床病例肿瘤样本都是通过甲醛固定或石蜡包埋的方式储存，而很少通过低温冻存的方式保存。为了尝试利用这些丰富的肿瘤样本，研究者尝试通过RT-PCR或DASL等方式进行表达量的分析，但这些方法并不能够进行精确的定量，且只能对少数的已知转录本进行定量。

近些年，随着二代测序的出现以及测序成本的不断下降，可以通过二代测序的方式分析FFPE样本中mRNA的表达水平，从而克服微阵列技术对于FFPE样本检测的限制，并对功能基因组学产生革命性的影响。

传统的mRNA测序技术是通过oligo dT反转录引物将mRNA反转录成cDNA，然后打断建库或是通过将带有oligo dA尾的mRNA富集下来然后打断、逆转录、建库。这两个方法都需要获得高质量的RNA得以实现。

发明内容

有鉴于现有的关于乳腺癌的mRNA测序及定量手段主要是用新鲜组织进行的转录组测序，对于样本有较高的要求，无法适应临床诊断的需要。本发明的目的是提供一种不需要质量较好的mRNA，即便降解样本也可以得到较优结果的基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒。

本发明的另一个目的是针对现有临床诊断上的不足，提供了一种新的可用于乳腺癌分型的方法，通过高通量测序手段可以对乳腺癌患者的临床FFPE样本的mRNA进行的精确定量，从而通过对乳腺癌的表达谱分析癌症患者所患肿瘤的病理进程，进而为临床治疗提供更加精确的癌症分型手段及诊疗手段，同时也可为癌症研究的专家及学者在乳腺癌表达谱上的研究提供更加广泛的材料来源和分析数据。检测方法具体步骤为：(a)通过切片机切下20μm厚度的切片3张，然后通过二甲苯和酒精脱蜡(b)Recover All total Nucleic Acid组织切片试剂盒提取总RNA(d)通过SuperscriptⅡ逆转录酶(invitrogne)和带有生物素的、P5接头及oligo dT的引物将mRNA逆转录成带有接头序列的cDNA，随后合成cDNA的第二条链以及文库构建。(e)通过Ampure XP磁珠纯化二链合成产物。(f)通过带有index的扩增引物对文库进行扩增(g)扩增文库上机测序(h)下机数据质量控制reads过滤、align、mapping和定量。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒，其特征在于，该分型检测试剂盒包括a)降解mRNA建库试剂、引物及磁珠模块；b)文库定量试剂模块；c)上机测序试剂模块；所述的引物包括seq ID NO.1所示的Bio-B-TVN引物、seq ID NO.2所示的Primer-A随机引物、seq ID NO.3所示的Primer-A引物、seqID NO.4-6任意一个所示的Primer-B引物，磁珠为包被有链霉素的磁性珠粒，Bio-B-TVN引物上的生物素可与磁珠包被的链霉素相结合，Primer-B引物为带有8碱基index的接头序列。

文库定量试剂模块所用到的定量试剂盒为VAHTS Library Quantification Kitfor Illumina。

上机测序试剂模块所使用的测序试剂盒为NextSeq 500/550Mid Output Kit v2，所用到的试剂溶液为0.2N的NaOH、200mM PH7的Tris-Cl。

上机测序试剂模块所用的软件包为python package HTSeq、GSNAP aligner和DAVID工具包。

降解mRNA建库试剂、引物及磁珠模块具体组成为：

本发明还提供基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒作为乳腺癌的表达谱分析和乳腺癌分型的试剂的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：1.通过3’端测序的方式使得获取的mRNA即便有部分降解亦可对样本的整个转录组进行精确定量。2.通过传统应用乳腺癌FFPE样本表达谱分析的微阵列及个别基因表达定量的荧光定量手段不能实现十分精准的分析，而通过3’末端测序的方法可以达到精确定量的目的。3.本发明将为癌症领域的临床及科研专家在乳腺癌分子分型，表达谱分析，肿瘤异质性研究，病程进展及控制方面提供更加精确方便的分析、监控及研究手段。

附图说明

以下附图形成本发明书的一部分，并且用于进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过参考与本文提出的特定实施方案的详细描述结合的这些附图中的一个或多个来更好地理解。

图1为FFPE样本RNA提取流程示意图；

图2为磁珠纯化示意图；

图3为mRNA建库结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包括”、“已经”、“包含”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明属于生物诊断检测领域，涉及以高通量方式测序表达于乳腺癌FFPE样本中的多个基因。更具体地说，本公开涉及一种对于降解mRNA样本3’末端的测序的文库构建以及测序分析，对乳腺癌组织中与乳腺癌相关基因的表达谱差异进行分型及以及风险评估的方法。其中检测方法包括(1)肿瘤患者组织FFPE样本中总RNA的提取。(2)通过逆转录酶及引物逆转录RNA为带polyA尾的cDNA，通过链霉素亲和磁珠结合生物素标记的cDNA,然后通过Taq酶合成带接头的二链cDNA.(3)通过带barcode的PrimerB引物和primerA引物对文库进行扩增。(4)对扩增文库进行上机测序。(5)对测序数据进行reads mapping、基因表达量分析、以及乳腺癌基因表达谱分析及基因分型。

表1各引物序列

名称	序列
		Bio-B-TVN	Biotin-5′-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′
Primer-A-Random	5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNN-3′
		Primer A	5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′
Primer B1	5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-ATCACGTT-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′
		Primer B2	5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-CGATGTTT-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′
Primer B3	5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-TTAGGCAT-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′

FFPE样本由于甲醛变性的作用及在包埋过程中温度较高，很容易造成核酸分子的片段化以及化学修饰，从而难以从中提取出完整的RNA。

由于乳腺癌细胞存在高度的异质性，通过传统分型方法用于乳腺癌患者的治疗中，即便同种类型其治疗效果仍然存在很大的差异，而通过表达谱进行乳腺癌分型及预后风险评估为精确的乳腺癌精确分型，提供了可能。

在一方面，本实施方式的某些方面，FFPE样本经二甲苯和RNeasy FFPE Kit提取。

由于mRNA 3’末端存在polyA尾结构可以保证3’末端序列的相对稳定，因此通过此结构可以有效的从总RNA中筛选出mRNA的3’末端。

本试剂盒的Bio-B-TVN的5’末端有生物素标记，可以与链霉素亲和磁珠共价结合从而将带polyA尾的mRNA筛选出来。

优选的一链合成逆转录引物Bio-B-TVN的5’末端带有生物素标记，和illumina的P7测序引物序列相同；逆转录引物Bio-B-TVN的3’端为带有19个T的oligo引物，其与mRNA3’端的oligoA可进行互补配对，3’末端的V代表碱基A或C或G，N代表碱基A或T或C或G。

在进行二链合成前通过链霉素磁珠与一链合成的cDNA共价结合，然后通过优选的二链合成引物进行二链合成，同时特异性的在mRNA 5’末端添加与illumina测序引物相同的二链合成引物，其3’末端为7碱基的随机序列。

优选的在文库合成以后通过不带条形码(barcode)的Primer A引物与带有8碱基标志(index)的Primer B引物对文库进行扩增，在文库两端加上P5，P7接头，该接头序列与流动池(flowcell)上的P5、P7寡核苷酸链(oligo)互补结合。同时可以在上机测序后通过index区分不同的样本。

优选的上机文库通过VAHTS Library Quantification Kit for Illumina定量试剂盒(诺唯赞)对上机前文库进行精确定量，从而使得每个样本的测序数据量符合分析要求。

优选的上机文库上机采用nextseq 500测序，文库变性方法及试剂参见《变性并稀释NextSeq系统的文库》(文档号15048776)，上机试剂为NextSeq 500/550Mid Output Kitv2(151循环)(illumina)。

样品可直接取自受试者或可获自第三方。样本可以是乳腺癌患者FFPE样本的癌症部位。

本试剂盒的组成最优选包括表2中所示组分：

表2试剂盒的组成

如图1所示，本发明参考RNeasy FFPE Kit(凯杰)肿瘤FFPE样本RNA提取的方法，其包括以下步骤：

a.首先切掉最外层的暴露空气的组织2-3片，然后切取10μm厚，面积250mm²的组织2片。

b.加入1ml二甲苯，混匀离心后弃上清，然后加入150μl buffer-PDK，涡旋混匀。

c.加入150μl bufferPKD，然后加入10μl蛋白酶K，56℃下孵育15min，80℃下孵育15min。

d.将无色下相转移到新的2ml离心管中，冰上孵育3min后，20000xg离心15min。上清转移至新的离心管中，不要碰到沉淀物。

e.加入1/10样本体积的DNase Booster Buffer(约16-25μl)以及10μl DNaseⅠstock solution。混匀液体，瞬离，室温孵育15min。

f.加入320μl Buffer RBC，彻底混匀。加入720μl无水乙醇混匀，转移样本至RNeasy MinElute spin column上，8000xg离心15s，弃液。

g.加入500μl Buffer RPE至RNeasy MinElute spin column中，8000xg离心2min，弃收集管。

h.将RNeasy MinElute spin column重新放回一新收集管中，开盖全速离心5min。

i.弃收集管，将RNeasy MinElute spin column放入新1.5ml收集管中，在spincolumn膜中央加入14-30μl无RNA酶水(RNase-free water)，全速离心1min，收集洗脱液。

对获取的总RNA进行纯化，文库构建，上机测序以及数据分析，其包括以下步骤:

a.取提取后的11μl总RNA 1-3μg，加入1μl 50μM的Bio-B-TVN引物，Bio-B-TVN引物5’端与illuminaflowcell上的P7引物一致，其中V代表(A、G或C，N代表随机碱基)，再加入1μl的dNTP(10mM)。在65℃孵育5min,然后置于冰上至少1min，加入4μl 5xFirst-strandbuffer、1μl 0.1M DTT、1μl RNase inhibitor(RNA酶抑制剂)(invetrogen)、1μlSuperscript IIIreverse transcriptase逆转录酶(200U/μl；Invitrogen)在50℃孵育60min进行逆转录反应，然后加入80μl水70℃15min灭活。

b.通过1.5X Ampure纯化磁珠室温孵育5min，置于磁力架上静置5min，待溶液澄清后弃上清，加入200μl新鲜配置的80％乙醇漂洗两次，并用50μl EB(10mM Tris-Hcl，PH8)洗脱，见图2。

c.50μl洗脱产物中加入15μl 10X terminal transferase buffer(NEB cat#M0315S)，3ul的130μM ddNTP mix,80μl的无菌水,和2ul的terminaltransferase末端转移酶(NEB cat#M0315S)在37℃孵育1h。然后加入6.25μl 500mM的EDTA溶液至终浓度20mM终止反应。

d.在156μl的产物中加入5μl的链霉亲和素磁珠(DyanabeadsMyOneStreptavidinC1，Cat#65001)，室温孵育20min。然后加入100μl NaOH(0.1M)吹打混匀，室温孵育5min。置于磁力架上待溶液澄清后弃上清，用无核酸酶水清洗两次。

e.加入1μl的Primer-A-Random(100μM)引物，再加入5μl 10X的TaqDNApolymerase buffer(NEB)，1μl 10mM dNTP，加水补足49μl。加入1μl的Taq DNA polymerase聚合酶(5μl，NEB)在25℃孵育1h，72℃延伸30s，75℃5min保持。加入1μl 500mM EDTA至终浓度10mM，终止反应。置于磁力架上待溶液澄清后弃上清，用150μl wash buffer(10mMTris-HCL，PH 7.5,1mMEDTA和0.1％Tween-80或Triton-X100)清洗两次，然后重悬于24μl水中。

f.加入25μl Phusion Master Mix(高保真酶混合液)2X(NEB)和0.5μl通用引物primer-B(10μM)引物和0.5μl primer A(10μM)引物进行扩增，扩增条件为96℃30s，18个循环(96℃10s，65℃10s，72℃10s),72℃5min。PCR产物用1.5x Ampure XP磁珠纯化，并用20μlEB洗脱。primer-B为Primer B1、B2、B3的一种。

g.洗脱后文库通过VAHTS Library Quantification Kit for Illumina(诺唯赞)定量试剂盒以及IQ 5荧光定量PCR仪进行定量。

h.最终文库按照3G的数据量通过nextseq 500进行测序。

下机数据的处理：

a.通过python package HTSeq对测序数据进行处理,去除adapter(接头)和polyA。

b.通过GSNAP aligner比对软件进行Read比对。

c.过滤掉低mapping质量(<30)和有>80％A或T的reads。

d.通过公式进行双样本t检验识别两类样本的差异表达基因。其中和分别为两类不同样本基因i的平均表达水平。s₀为一常数，s_(i)是重复表达量的标准偏差。

e.功能基因集分析通过DAVID工具进行实现。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 江苏苏博生物医学科技南京有限公司

<120> 基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用

<130> xhx2018080801

<141> 2018-08-08

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttttttt tttttttttt tttvn 55

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnn 40

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

caagcagaag acggcatacg agatcacgtt gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atct 64

<210> 5

<211> 64

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

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<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

caagcagaag acggcatacg agttaggcat gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60

atct 64

Claims (6)

1.基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒，其特征在于，该分型检测试剂盒包括a)降解mRNA建库试剂、引物及磁珠模块；b)文库定量试剂模块；c)上机测序试剂模块；所述的引物包括seq ID NO.1所示的Bio-B-TVN引物、seq ID NO.2所示的Primer-A随机引物、seq ID NO.3所示的Primer-A引物、seq ID NO.4-6任意一个所示的Primer-B引物，磁珠为包被有链霉素的磁性珠粒，Bio-B-TVN引物上的生物素可与磁珠包被的链霉素相结合，Primer-B引物为带有8碱基index的接头序列。

2.根据权利要求1所述的基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒，其特征在于，文库定量试剂模块所用到的定量试剂盒为VAHTS Library Quantification Kit forIllumina。

3.根据权利要求1所述的基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒，其特征在于，上机测序试剂模块所使用的测序试剂盒为NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2，所用到的试剂溶液为0.2N的NaOH、200mM PH7的Tris-Cl。

4.根据权利要求3所述的基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒，其特征在于，上机测序试剂模块所用的软件包为python package HTSeq、GSNAP aligner和DAVID工具包。

5.根据权利要求1所述的基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒，其特征在于，降解mRNA建库试剂、引物及磁珠模块具体组成为：

。

6.如权利要求1-5任意一项所述的乳腺癌分型检测试剂盒作为乳腺癌基因的表达谱差异分析和乳腺癌分型的试剂的应用。