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CN109078617A - Gst纯化材料、制备方法和产品及其应用 - Google Patents

Gst纯化材料、制备方法和产品及其应用 Download PDF

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CN109078617A CN201811097050.0A CN201811097050A CN109078617A CN 109078617 A CN109078617 A CN 109078617A CN 201811097050 A CN201811097050 A CN 201811097050A CN 109078617 A CN109078617 A CN 109078617A
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agarose
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王育臣
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Biological Engineering (shanghai) Ltd By Share Ltd
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种GST纯化材料、制备方法和产品及其应用。本发明提供的GST纯化材料，由固相载体、连接臂和通过连接臂与固相载体连接的配基组成，其中，连接臂包括己二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的至少一种。该GST纯化材料是经过反复试验优化，精心筛选原料得到。因连接臂具有合适的分子链长度及性能，使得GST更有利于与配基进行特异性结合，提高了材料的纯化效率。该GST纯化材料不仅质优，而且价廉，可以重复利用多次，与目前市面上销售的同类产品相比，具有更高的载量，吸附载量大，非特异性吸附少，纯化效果好，同时适用范围广，适合大规模装置应用。制备方法也简单可控，可以广泛应用。

Description

GST纯化材料、制备方法和产品及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种GST纯化材料、制备方法和产品及其应用。
背景技术
蛋白质是构成生命的物质基础，也是机体生命活动的主要承担者，不可或缺。随着生命科学研究的不断深入，对蛋白质的结构和功能开展研究正成为科研的热点之一。
获得一定量的高纯度蛋白是对其开展研究的前提条件，某些蛋白在科研或生产中的应用也需要其具有较高的纯度。利用基因工程的方法获得人们想要的蛋白质日渐成为一种方便而有效的方法。基因工程是将目的基因构建到表达载体上，然后导入到相应的宿主细胞中诱导表达该蛋白质。在进行蛋白质重组表达时，外源蛋白高水平表达往往导致形成不可溶的包涵体，要获得有活性的目标蛋白需要经过复杂的变、复性过程。一些蛋白能够形成可溶的表达产物，但要从混有大量菌体自身蛋白和其它大分子物质的混合物中分离出高纯度的目标蛋白仍是件困难的事情。
很多时候，将目标蛋白与一些生物大分子或短肽进行融合表达对于解决表达和纯化的难题是行之有效的。这些生物大分子或短肽一般称之为融合标签，其中，有些标签可以促进目标蛋白以可溶性的形式表达；有些标签能与其它物质特异性结合，从而为后续的分离与纯化提供便利。
谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase，GST)是常用的蛋白融合表达标签之一。GST融合表达不仅可以提高目标蛋白的表达水平，而且对于提高目标蛋白的可溶性表达也有一定帮助。目前，GST标签在基因工程领域已经广泛作用。
综上所述，生产一种可以纯化GST融合蛋白的亲和层析材料显得十分重要。但是，目前市面上销售的GST亲和层析材料要么吸附载量低，非特异性吸附多，导致纯化效果差；要么价格昂贵，生产工艺复杂，不利于大规模化生产。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种GST纯化材料，以缓解现有技术中材料要么吸附载量低，非特异性吸附多，导致纯化效果差；要么价格昂贵，生产工艺复杂，不利于大规模化生产的技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种GST纯化材料的制备方法，以缓解现有技术中制备工艺复杂，生产成本大或产品质量差的技术问题。
本发明的第三目的在于提供一种GST纯化产品，以缓解现有技术中缺少一种GST纯化效果好、简便易操作同时成本低产品。
本发明的第四目的在于提供上述材料或制备方法制备得到的材料或产品在分离、纯化、分析或鉴定GST蛋白或GST融合蛋白中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种GST纯化材料，包括固相载体、连接臂和通过连接臂与固相载体连接的配基；
所述连接臂包括己二醇二缩水甘油醚、戊二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的至少一种。
进一步地，所述固相载体包括硅胶、可控孔径玻璃、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或纤维素中的至少一种，优选为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中至少一种，进一步优选为agarose4FF、agarose 6FF、agarose CL-4B或agarose CL-6B中的至少一种，更进一步优选为agarose 4FF。
进一步地，所述配基为GSH蛋白。
一种GSH纯化材料的制备方法，所述制备方法包括将配基偶联到连接臂上的步骤，其中，所述连接臂与固相载体连接。
进一步地，所述偶联的步骤包括：将配基、催化剂和带有连接臂的固相载体在PBS溶液中进行孵育偶联；
优选地，所述孵育偶联的条件包括：在温度为45-55℃条件下，100-150rpm/min孵育12-20h；
优选地，所述PBS溶液的浓度为10-30mM；
优选地，所述带有连接臂的固相载体与所述PBS溶液的体积比为1:1-2；
优选地，所述配基的浓度为5.3-5.9g/L；
优选地，所述催化剂包括NaBH4或KBH4，优选为NaBH4；
优选地，所述NaBH4的浓度为1-1.4g/L。
进一步地，所述连接臂与固相载体连接的步骤包括：将连接臂和固相载体在碱性条件下，通过催化剂进行孵育连接；
优选地，所述固相载体和所述连接臂的体积比为1:0.4-0.8；
优选地，所述孵育连接的条件包括：在35-45℃条件下，100-150rpm/min孵育5-11h；
优选地，所述碱性条件包括含有NaOH或KOH的有机溶液，优选为含有NaOH的有机溶液；
优选地，NaOH的浓度为25-35g/L；
优选地，所述有机溶液包括二甲基亚砜或二甲基甲酰胺，优选为二甲基亚砜；
优选地，所述固相载体和所述二甲基亚砜的体积比为1:1.2-1.6；
优选地，所述催化剂包括NaBH4或KBH4，优选为NaBH4；
优选地，NaBH4的浓度为1-3g/L。
进一步地，所述连接臂包括己二醇二缩水甘油醚、戊二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的至少一种；
优选地，所述固相载体包括硅胶、可控孔径玻璃、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或纤维素中的至少一种，优选为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中至少一种，进一步优选为agarose4FF、agarose 6FF、agarose CL-4B或agarose CL-6B中的至少一种，更进一步优选为agarose 4FF；
优选地，所述配基为GSH蛋白。
进一步地，配基与连接臂偶联后还包括固相载体去活化的步骤；
所述去活化的步骤包括：用乙醇胺将固相载体上未与连接臂连接的位点进行封闭；
优选地，所述封闭的条件包括：在35-40℃条件下，100-150rpm/min封闭12-20h；
优选地，所述去活化用的溶剂为3-7mM EDTA；
优选地，所述乙醇胺的浓度为0.5-1.5M；
优选地，所述固相载体与所述乙醇胺的体积比为1:1-1.4。
一种GST纯化产品，所述产品包含上述的GST纯化材料或制备方法制备得到的GST纯化材料；
优选地，所述产品包括亲和层析柱或纯化试剂盒。
上述GST纯化材料或制备方法制备得到的GST纯化材料或GST纯化产品在分离、纯化、分析或鉴定GST蛋白或GST融合蛋白中的应用；
优选地，所述GST融合蛋白包括哺乳动物细胞、昆虫细胞或微生物表达系统中表达的含GST标签的融合蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的GST纯化材料，由固相载体、连接臂和通过连接臂与固相载体连接的配基组成，其中，连接臂包括己二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的至少一种。该GST纯化材料是经过反复试验优化，精心筛选原料，制备出来的产品。连接臂由于具有合适的分子链长度及性能，使得GST更有利于与配基进行特异性结合，提高了材料的纯化效率。该GST纯化材料不仅质优，而且价廉，与目前市面上销售的同类产品相比，具有更高的载量，吸附载量大，非特异性吸附少，纯化效果好，同时适用范围广，适合大规模装置应用。
本发明提供的GST纯化材料的制备方法，是经过反复试验，优化工艺参数得到的生产工艺。该方法最大优点是制备工艺简单，成本低廉，性能稳定，适合大规模生产制备。
本发明提供的GST纯化产品具有上述GST纯化材料的优势，特别是纯化效果好的同时成本低，GST纯化材料可以重复利用，进一步降低纯化成本。
附图说明
图1为本发明GST纯化材料的结构示意图；
图2为本发明实施例9中实施例5-7的GST纯化材料纯化效果检测的SDS-PAGE结果图；
图3为本发明实施例9中对比产品纯化效果检测的SDS-PAGE结果图；
图4为本发明实施例10中回收GST纯化材料纯化效率变化示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
一种GST纯化材料，由固相载体、连接臂和通过连接臂与固相载体连接的配基组成，其中，连接臂包括己二醇二缩水甘油醚、戊二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的至少一种，优选为己二醇二缩水甘油醚。
GST纯化材料的结构示意图如图1所示。该GST纯化材料是经过反复试验优化，精心筛选原料，制备出来的产品。连接臂由于具有合适的分子链长度及性能，使得GST更有利于与配基进行特异性结合，提高了材料的纯化效率。通过研究发现，己二醇二缩水甘油醚的效果更好。该GST纯化材料不仅质优，而且价廉，与目前市面上销售的同类产品相比，具有更高的载量，吸附载量大，非特异性吸附少，纯化效果好，同时适用范围广，适合大规模装置应用。
在本发明的一些实施方式中，固相载体包括硅胶、可控孔径玻璃、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或纤维素中的至少一种，优选为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中至少一种，进一步优选为agarose 4FF、agarose 6FF、agarose CL-4B或agarose CL-6B中的至少一种，更进一步优选为agarose 4FF。
将配基通过连接臂固定在球形、无定型、薄膜或纤维状的硅胶，可控孔径玻璃，葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶或纤维素上，便可得到亲和材料并制备出相应的纯化产品。优选使用agarose 4FF，由于微球的颗粒大小在50-160μm之间，并且在2-12的宽pH范围内稳定，具有4％的合适交联度，既保证了产品高载量的特性，更有耐高压、高流速的特性，适合大规模装柱应用。
在本发明一个优选地实施方式中，配基为GSH蛋白。GST可以和谷胱甘肽(glutathione，GSH)中的巯基发生特异性共价结合，利用此性质，可以将GSH偶联到固相载体上，进而将GST融合蛋白从粗提物中分离出来。由于GST与GSH的结合具有高度专一性，因此其纯化得到的融合蛋白具有较高的纯度。
一种GSH纯化材料的制备方法，制备方法包括将配基偶联到连接臂上的步骤，其中，连接臂与固相载体连接。该制备方法是经过反复试验，优化工艺参数得到的生产工艺。该方法最大优点是制备工艺简单，成本低廉，性能稳定，适合大规模生产制备。
在本发明的一些实施方式中，偶联的步骤包括：将配基、催化剂和带有连接臂的固相载体在PBS溶液中进行孵育偶联。在催化剂的作用下，配基与连接臂发生脱水缩合反应，形成GST纯化材料。该偶联步骤的条件通过大量的试验研究，反复验证得到的，有利于配基与连接臂的偶联反应，进一步提高GST纯化材料的纯化性能。
在本发明的一些实施方式中，孵育偶联的条件包括：在温度为45-55℃条件下，100-150rpm/min孵育12-20h。该反应条件是通过反复试验得出的，该条件下偶联效果好，材料性能稳定。温度典型但非限制性的为45℃、47℃、47℃、50℃、52℃、54℃或55℃；转速典型但非限制性的为100rpm/min、110rpm/min、120rpm/min、130rpm/min、140rpm/min或150rpm/min；孵育时间典型但非限制性的为12、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h。
在本发明的一些实施方式中，PBS溶液的浓度为10-30mM。PBS溶液的浓度典型但非限制性的为10mM、15mM、20mM、25mM或30mM。
在本发明的一些实施方式中，带有连接臂的固相载体与PBS溶液的体积比为1:1-2。带有连接臂的固相载体与PBS溶液的体积比典型但非限制性的为1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8或1:2。需要说明的是，本申请中的固相载体体积均指的是沉降体积。
在本发明的一些实施方式中，配基的浓度为5.3-5.9g/L。配基的浓度典型但非限制性的为5.3g/L、5.4g/L、5.5g/L、5.6g/L、5.7g/L、5.8g/L或5.9g/L。
在本发明的一些实施方式中，催化剂包括NaBH4或KBH4，优选为NaBH4，进一步地，NaBH4的浓度为1-1.4g/L。NaBH4的浓度典型但非限制性的为1g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L或1.4g/L。
通过对反应原料的配比进行优化和限定，可以进一步的保证GST纯化材料的性能和纯化效果。
在本发明一个优选地实施方式中，连接臂与固相载体连接的步骤包括：将连接臂和固相载体在碱性条件下，通过催化剂进行孵育连接。在该特定的碱性环境下，将固相载体上裸露在外的羟基(-OH)活化，在催化剂的催化作用下，将连接臂与固相载体上的羟基通过化学键的形式连接，得到的连接有连接臂的固相载体性质稳定，二者之间不易脱落。
在本发明的一些实施方式中，固相载体和连接臂的体积比为1:0.4-0.8。固相载体和连接臂的体积比典型但非限制性的为1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7或1:0.8。
在本发明的一些实施方式中，孵育连接的条件包括：在35-45℃条件下，100-150rpm/min孵育5-11h。该反应条件是通过反复试验得出的，该条件下连接效果好，材料性能稳定。温度典型但非限制性的为35℃、37℃、39℃、40℃、42℃、44℃或45℃；转速典型但非限制性的为100rpm/min、110rpm/min、120rpm/min、130rpm/min、140rpm/min或150rpm/min；孵育时间典型但非限制性的为5h、6h、7h、8h、9h、10h或11h。
在本发明的一些实施方式中，碱性条件包括含有NaOH或KOH的有机溶液，优选为含有NaOH的有机溶液，进一步地，NaOH的浓度优选为25-35g/L。NaOH的浓度典型但非限制性的为25g/L、27g/L、29g/L、30g/L、32g/L、34g/L或35g/L。
在本发明的一些实施方式中，有机溶液包括二甲基亚砜或二甲基甲酰胺，优选为二甲基亚砜。在二甲基亚砜或二甲基甲酰胺的媒介作用下，固相载体上的羟基得到充分的活化，有利于后面的与连接臂连接反应。
在本发明的一些实施方式中，固相载体和二甲基亚砜的体积比为1:1.2-1.6。固相载体和二甲基亚砜的体积比典型但非限制性的为1:1.2、1:1.6、或1:1.4。
在本发明一些实施方式中，催化剂包括NaBH4或KBH4，优选为NaBH4，进一步地，NaBH4的浓度优选为1-3g/L。NaBH4的浓度典型但非限制性的为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L。
通过对反应原料的配比进行优化和限定，进一步保证了连接臂和固相载体结合的稳定性。
在本发明一个优选地实施方式中，连接臂包括己二醇二缩水甘油醚、戊二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的至少一种，优选为己二醇二缩水甘油醚。己二醇二缩水甘油醚和丁二醇二缩水甘油醚的分子链长度合适，有利于GST与配基的特异性结合。
在本发明一个优选地实施方式中，固相载体包括硅胶、可控孔径玻璃、高分子微球、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或纤维素中的至少一种，优选为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中至少一种，进一步优选为agarose 4FF、agarose 6FF、agarose CL-4B或agarose CL-6B中的至少一种，更进一步优选为agarose 4FF。优选使用agarose 4FF，由于微球的颗粒大小在50-160μm之间，并且在2-12的宽pH范围内稳定，具有4％的合适交联度，既保证了产品高载量的特性，更有耐高压、高流速的特性，适合大规模装柱应用。
在本发明一个优选地实施方式中，配基为GSH蛋白。GST可以和谷胱甘肽(glutathione，GSH)中的巯基发生特异性共价结合，利用此性质，可以将GSH偶联到固相载体上，进而将GST融合蛋白从粗提物中分离出来。由于GST与GSH的结合具有高度专一性，因此其纯化得到的融合蛋白具有较高的纯度。
在本发明的一些实施方式中，配基与连接臂偶联后还包括固相载体去活化的步骤，其中，去活化的步骤包括：用乙醇胺将固相载体上未与连接臂连接的位点进行封闭。
在本发明的一些实施方式中，封闭的条件包括：在35-40℃条件下，100-150rpm/min封闭12-20h。将固相载体上没有连接连接臂的活性基团进行封闭，有利于减少非特异性吸附，提高纯化的效率。温度典型但非限制性的为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃；转速典型但非限制性的为100rpm/min、110rpm/min、120rpm/min、130rpm/min、140rpm/min或150rpm/min；封闭时间典型但非限制性的为12、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h。
在本发明的一个优选地实施方式中，去活化用的溶剂为3-7mM EDTA。
在本发明的一个优选地实施方式中，乙醇胺的浓度为0.5-1.5M。
在本发明的一个优选地实施方式中，固相载体与乙醇胺的体积比为1:1-1.4。固相载体与乙醇胺的体积比典型但非限制性的为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3或1:1.4。
通过对去活化所用组分的配比和反应条件的优化和限定，使得未连接连接臂的固相载体得到有效地去活化，有效避免了非特异性吸附，提高了GST纯化材料的性能和纯化效果。
在本发明一个优选地实施方式中，GST纯化材料的制备方法包括以下步骤：
A)取固体载体，真空抽滤机抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
B)向抽干的固相载体中加入，1.2-1.6倍固相载体体积的二甲基亚砜，0.4-0.8倍固相载体体积的己二醇二缩水甘油醚，混匀，然后加入0.1倍固相载体体积的NaOH、NaBH4混合溶液(母液浓度10×，即NaOH为300g/L，NaBH4为20g/L，下同)，至NaOH终浓度为30g/L，NaBH4终浓度为2g/L，最后置于35-45℃恒温摇床，100-150rpm，孵育5-11h；
C)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
D)向抽干的带有己二醇二缩水甘油醚的固相载体中加入1-3倍体积的20mM PBS溶液，混匀，然后分别加入配基、NaBH4粉末，至配基的终浓度为5.3-5.9g/L，NaBH4终浓度为1-1.4g/L，最后置于45-55℃恒温摇床，100-150rpm，孵育12-20h；
E)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
F)向抽干的固相载体中加入1-1.4倍琼脂糖体积的1M乙醇胺溶液，混匀，然后加入EDTA溶液(母液浓度500mM)至终浓度5mM，最后置于35-40℃恒温摇床，100-150rpm，孵育12-20h；
G)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次，最后保存于1×PBS，pH7.4，20％乙醇溶液。
上述制备方法制备得到的GST纯化材料具有专一作用力强，原料易得，价格低廉同时纯化效果好的特点。
一种GST纯化产品包含上述GST纯化材料或制备方法制备得到的GST纯化材料。产品具有上述GST纯化材料的优势，特别是纯化效果好的同时成本低，GST纯化材料可以重复利用，进一步降低纯化成本。
在本发明优选地实施方式中，产品包括亲和层析柱或纯化试剂盒。
上述GST纯化材料或制备方法制备得到的GST纯化材料或GST纯化产品在分离、纯化、分析或鉴定GST蛋白或GST融合蛋白中的应用。本发明提供的GST纯化材料可以应用于各种GST蛋白相关的领域中，反应环境可以为液相或固相，反应体积可以为微量或大批量，产品性能好，纯化效率高，适合各种应用场景。
在本发明的一些实施方式中，GST融合蛋白包括哺乳动物细胞、昆虫细胞或微生物表达系统中表达的含GST标签的融合蛋白。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种GST纯化材料的制备方法，包括以下步骤：
A)取保存于20％乙醇中的琼脂糖agarose 6FF，真空抽滤机抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
B)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.2倍琼脂糖体积的二甲基亚砜，0.8倍琼脂糖体积的丁二醇二缩水甘油醚，混匀，然后加入0.1倍琼脂糖体积的NaOH、NaBH4混合溶液(母液浓度10×，即NaOH为300g/L，NaBH4为20g/L，下同)，至NaOH终浓度为30g/L，NaBH4终浓度为2g/L，最后置于35℃恒温摇床，100-150rpm，孵育11h；
C)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
D)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1倍琼脂糖体积的20mM PBS溶液，混匀，然后分别加入GSH、NaBH4粉末，至GSH终浓度为5.9g/L，NaBH4终浓度为1g/L，最后置于55℃恒温摇床，100-150rpm，孵育12h；
E)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
F)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.4倍琼脂糖体积的1M乙醇胺溶液，混匀，然后加入EDTA溶液(母液浓度500mM)至终浓度5mM，最后置于35℃恒温摇床，100-150rpm，孵育20h；
G)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次，最后保存于1×PBS，pH7.4，20％乙醇溶液。
实施例2
本实施例提供一种GST纯化材料的制备方法，包括以下步骤：
A)取保存于20％乙醇中的琼脂糖agarose CL-4B，真空抽滤机抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
B)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.6倍琼脂糖体积的二甲基亚砜，0.4倍琼脂糖体积的戊二醇二缩水甘油醚，混匀，然后加入0.1倍琼脂糖体积的NaOH、NaBH4混合溶液，至NaOH终浓度为30g/L，NaBH4终浓度为2g/L，最后置于45℃恒温摇床，100-150rpm，孵育5h；
C)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
D)向抽干的琼脂糖颗粒中加入2倍琼脂糖体积的20mM PBS溶液，混匀，然后分别加入GSH、NaBH4粉末，至GSH终浓度为5.3g/L，NaBH4终浓度为1.4g/L，最后置于45℃恒温摇床，100-150rpm，孵育20h；
E)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
F)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1倍琼脂糖体积的1M乙醇胺溶液，混匀，然后加入EDTA溶液(母液浓度500mM)至终浓度5mM，最后置于40℃恒温摇床，100-150rpm，孵育12h；
G)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次，最后保存于1×PBS，pH7.4，20％乙醇溶液。
实施例3
本实施例提供一种GST纯化材料的制备方法，包括以下步骤：
A)取保存于20％乙醇中的琼脂糖agarose CL-6B，真空抽滤机抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
B)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.4倍琼脂糖体积的二甲基亚砜，0.6倍琼脂糖体积的丁二醇二缩水甘油醚，混匀，然后加入0.1倍琼脂糖体积的NaOH、NaBH4混合溶液，至NaOH终浓度为30g/L，NaBH4终浓度为2g/L，最后置于40℃恒温摇床，100-150rpm，孵育8h；
C)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
D)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.5倍琼脂糖体积的20mM PBS溶液，混匀，然后分别加入GSH、NaBH4粉末，至GSH终浓度为5.6g/L，NaBH4终浓度为1.2g/L，最后置于50℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h；
E)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
F)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.2倍琼脂糖体积的1M乙醇胺溶液，混匀，然后加入EDTA溶液(母液浓度500mM)至终浓度5mM，最后置于37℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h；
G)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次，最后保存于1×PBS，pH7.4，20％乙醇溶液。
实施例4
本实施例提供一种GST纯化材料的制备方法，包括以下步骤：
A)取保存于20％乙醇中的琼脂糖agarose 4FF，真空抽滤机抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
B)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.4倍琼脂糖体积的二甲基亚砜，0.6倍琼脂糖体积的己二醇二缩水甘油醚，混匀，然后加入0.1倍琼脂糖体积的NaOH、NaBH4混合溶液，至NaOH终浓度为30g/L，NaBH4终浓度为2g/L，最后置于40℃恒温摇床，100-150rpm，孵育8h；
C)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
D)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.5倍琼脂糖体积的20mM PBS溶液，混匀，然后分别加入GSH、NaBH4粉末，至GSH终浓度为5.6g/L，NaBH4终浓度为1.2g/L，最后置于50℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h；
E)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次；
F)向抽干的琼脂糖颗粒中加入1.2倍琼脂糖体积的1M乙醇胺溶液，混匀，然后加入EDTA溶液(母液浓度500mM)至终浓度5mM，最后置于37℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h；
G)反应结束后，抽干，浸于去离子水中浸泡不少于6h，抽干，反复三次，最后保存于1×PBS，pH7.4，20％乙醇溶液。
实施例5小试制备
活化：10mL agarose 4FF琼脂糖颗粒，水洗抽干后加入50mL三角烧瓶中，依次加入14mL二甲基亚砜，6mL己二醇二缩水甘油醚，1mL NaOH，NaBH4母液，混匀后置于40℃恒温摇床，100-150rpm，孵育8h。
偶联：琼脂糖颗粒水洗抽干后加入到50mL三角烧瓶中，依次加入15mL 20mM PBS溶液，56mg GSH，12mg NaBH4，混匀后置于50℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h。
去活化：琼脂糖颗粒水洗抽干后加入到50mL三角烧瓶中，依次加入12mL乙醇胺溶液，0.2mL EDTA母液，混匀后置于37℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h。
保存：水洗后保存于1×PBS，pH7.4，20％乙醇溶液。
实施例6中试制备
活化：100mL agarose 4FF琼脂糖颗粒，水洗抽干后加入500mL三角烧瓶中，依次加入140mL二甲基亚砜，60mL己二醇二缩水甘油醚，10mLNaOH，NaBH4母液，混匀后置于40℃恒温摇床，100-150rpm，孵育8h。
偶联：琼脂糖颗粒水洗抽干后加入到500mL三角烧瓶中，依次加入150mL 20mM PBS溶液，0.56g GSH，0.12g NaBH4，混匀后置于50℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h。
去活化：琼脂糖颗粒水洗抽干后加入到500mL三角烧瓶中，依次加入120mL乙醇胺溶液，2mL EDTA母液，混匀后置于37℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h。
保存：水洗后保存于1×PBS，pH7.4，20％乙醇溶液。
实施例7大试制备
活化：1L agarose 4FF琼脂糖颗粒，水洗抽干后加入5L三角烧瓶中，依次加入1.4L二甲基亚砜，0.6L己二醇二缩水甘油醚，0.1L NaOH，NaBH4母液，混匀后置于40℃恒温摇床，100-150rpm，孵育8h。
偶联：琼脂糖颗粒水洗抽干后加入到5L三角烧瓶中，依次加入1.5L 20mM PBS溶液，5.6g GSH，1.2g NaBH4，混匀后置于50℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h。
去活化：琼脂糖颗粒水洗抽干后加入到5L三角烧瓶中，依次加入1.2L乙醇胺溶液，20mL EDTA母液，混匀后置于37℃恒温摇床，100-150rpm，孵育16h。
保存：水洗后保存于1×PBS，pH7.4，20％乙醇溶液。
实施例8诱导大肠杆菌表达GST-Mut融合蛋白
A)取保存的菌种，按1:1000接种于100mL LB培养基(含50mg/ml氨苄青霉素)中，37℃，220rpm活化过夜；
B)取活化好的菌种，按1:100比例接种于3L LB培养基(含50mg/ml氨苄青霉素)中，37℃，220rpm培养；
C)到OD600达到0.6左右时，停止培养，将菌液温度降至20℃，加入IPTG至终浓度0.2mM，20℃，220rpm培养过夜；
D)培养完毕，离心收集细胞。
实施例9GST纯化材料的纯化效果检测
1.将实施例8中收集到的细胞用150mL Lysis Buffer吹打制成悬浮液，超声破碎后，4℃，12000rpm离心20min，分离出细胞裂解上清液备用，沉淀舍弃；
2.实施例5-7制备的GST纯化材料各取1mL，分别加入对应的层析柱中，BindingBuffer平衡材料，分别进行亲和层析实验；
3.每个材料分别加入50mL细胞裂解上清液，4℃摇床孵育1h；
4.孵育样品加入层析柱中，收集材料，Binding Buffer平衡10CV(columnvolume)；
5.Elution Buffer洗脱5CV；
6.收集洗下来的各组分，各加入1CV的loading buffer制成上样样品，SDS-PAGE凝胶电泳，结果如附图2所示，其中，M：protein marker；1：上样液；2：流穿液；3：洗脱；4：树脂残留；
注：Lysis Buffer/Binding Buffer：1×PBS，20％Glycerol，pH7.4；
Elution Buffer：1×PBS，20％Glycerol，20mM GSH，pH7.4。
GST-Mut亲和层析后洗脱组分的蛋白质浓度，由非干扰型蛋白质定量试剂盒测定(生工生物产品#C503071)，并由此计算出材料的载量。
GST纯化材料的纯化效果检测试验用XXX产品作为对比产品进行检测，对比产品的SDS-PAGE凝胶电泳，结果如附图3所示，其中，M：protein marker；1：上样液；2：流穿液；3：洗脱；4：树脂残留；
将实施例5-7和对比产品的材料的载量、非特异性吸附和材料残留量进行统计，结果如下表：
实施例5 实施例6 实施例7 对比产品
载量mg/ml 12.6 11.5 13.6 9.7
非特异性吸附 极少 极少 很少 较少
树脂残留 很少 很少 很少 较少
实施例10GST纯化材料重复使用效果检测
将实施例7所制备的GST标签纯化树脂通过实施例9纯化GST-Mut后，按以下步骤清洗：
1.去离子水冲洗10CV；
2.8M Urea，1×PBS，pH7.4冲洗10CV；
3.去离子水冲洗10CV；
4.0.1M NaAc，0.5M NaCl，10mM EDTA，pH4.0冲洗10CV；
5.去离子水冲洗10CV；
6.20％乙醇，1×PBS保存。
回收树脂后，实施例9同样方法测试GST纯化材料纯化效果，SDS-PAGE分析，回收6次以后仍能达到很高的纯化效率，结果如图4所示。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种GST纯化材料，其特征在于，包括固相载体、连接臂和通过连接臂与固相载体连接的配基；
所述连接臂包括己二醇二缩水甘油醚、戊二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的GST纯化材料，其特征在于，所述固相载体包括硅胶、可控孔径玻璃、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或纤维素中的至少一种，优选为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中至少一种，进一步优选为agarose 4FF、agarose 6FF、agarose CL-4B或agarose CL-6B中的至少一种，更进一步优选为agarose 4FF。
3.根据权利要求1或2所述的GST纯化材料，其特征在于，所述配基为GSH蛋白。
4.一种GSH纯化材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将配基偶联到连接臂上的步骤，其中，所述连接臂与固相载体连接。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述偶联的步骤包括：将配基、催化剂和带有连接臂的固相载体在PBS溶液中进行孵育偶联；
优选地，所述孵育偶联的条件包括：在温度为45-55℃条件下，100-150rpm/min孵育12-20h；
优选地，所述PBS溶液的浓度为10-30mM；
优选地，所述带有连接臂的固相载体与所述PBS溶液的体积比为1:1-2；
优选地，所述配基的浓度为5.3-5.9g/L；
优选地，所述催化剂包括NaBH4或KBH4，优选为NaBH4；
优选地，所述NaBH4的浓度为1-1.4g/L。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述连接臂与固相载体连接的步骤包括：将连接臂和固相载体在碱性条件下，通过催化剂进行孵育连接；
优选地，所述固相载体和所述连接臂的体积比为1:0.4-0.8；
优选地，所述孵育连接的条件包括：在35-45℃条件下，100-150rpm/min孵育5-11h；
优选地，所述碱性条件包括含有NaOH或KOH的有机溶液，优选为含有NaOH的有机溶液；
优选地，NaOH的浓度为25-35g/L；
优选地，所述有机溶液包括二甲基亚砜或二甲基甲酰胺，优选为二甲基亚砜；
优选地，所述固相载体和所述二甲基亚砜的体积比为1:1.2-1.6；
优选地，所述催化剂包括NaBH4或KBH4，优选为NaBH4；
优选地，NaBH4的浓度为1-3g/L。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述连接臂包括己二醇二缩水甘油醚、戊二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚中的至少一种；
优选地，所述固相载体包括硅胶、可控孔径玻璃、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或纤维素中的至少一种，优选为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶中至少一种，进一步优选为agarose 4FF、agarose 6FF、agarose CL-4B或agarose CL-6B中的至少一种，更进一步优选为agarose4FF；
优选地，所述配基为GSH蛋白。
8.根据权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，配基与连接臂偶联后还包括固相载体去活化的步骤；
所述去活化的步骤包括：用乙醇胺将固相载体上未与连接臂连接的位点进行封闭；
优选地，所述封闭的条件包括：在35-40℃条件下，100-150rpm/min封闭12-20h；
优选地，所述去活化用的溶剂为3-7mM EDTA；
优选地，所述乙醇胺的浓度为0.5-1.5M；
优选地，所述固相载体与所述乙醇胺的体积比为1:1-1.4。
9.一种GST纯化产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1-3任一项所述的GST纯化材料或权利要求4-8任一项所述的制备方法制备得到的GST纯化材料；
优选地，所述产品包括亲和层析柱或纯化试剂盒。
10.权利要求1-3任一项所述的GST纯化材料或权利要求4-8任一项所述的制备方法制备得到的GST纯化材料或权利要求9所述的GST纯化产品在分离、纯化、分析或鉴定GST蛋白或GST融合蛋白中的应用；
优选地，所述GST融合蛋白包括哺乳动物细胞、昆虫细胞或微生物表达系统中表达的含GST标签的融合蛋白。
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