CN109069593B

CN109069593B - 组合、治疗性用途和预防性用途

Info

Publication number: CN109069593B
Application number: CN201780024505.3A
Authority: CN
Inventors: 朱迪丝·玛丽·布拉格尔; 罗德尼·韦恩·克莱科姆; 科林·罗杰·奥格尔
Original assignee: Quantec Ltd
Current assignee: Quantec Ltd
Priority date: 2016-04-21
Filing date: 2017-04-21
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2037-04-21
Also published as: EP3445387A4; CN109069593A; US20190134168A1; NZ746539A; US12005100B2; MX2018012671A; EP3445387A1; NZ787026A; WO2017183996A1

Abstract

本发明涉及包括乳过氧化物酶和至少一种其他组分的组合的治疗性和预防性用途，其具有等于或基本上超过6.8的等电点，并且其是从乳中提取的，以通过针对至少一种致病性微生物的选择性来调节动物的微生物组。

Description

组合、治疗性用途和预防性用途

技术领域

本发明涉及组合，诸如组合物，及其治疗性和预防性用途。特别地(尽管不是唯一地)，本发明涉及通过对微生物的选择性来调节或治疗动物的微生物组的新方法。

背景技术

人类和其他动物寄生了非常多样的微生物，既有共生体也有致病性的。共生微生物是与宿主生物和谐共生，利用食物或其他益处，而不伤害宿主并且通常有益地帮助宿主的那些微生物。相反，致病性微生物，包括细菌，真菌或病毒，是在侵入身体后通常导致感染和相关病症或疾病的生物。偶尔，有益的共生微生物可以抓住机会变成致病性的，在这种情况下，共生体可以被称为“伺机性共生体”。

共同地，术语微生物群描述了生活在我们身体上或身体内的共生体和致病性微生物两者的群落。术语微生物组与微生物群有关，但通常被认为是描述微生物的集体基因组，而不是微生物本身。贯穿于本说明书，我们将使用术语微生物组，但应理解为包含微生物的遗传和/或表型多样性两者。

微生物组可以是非常多样的，并且存在于身体的许多区域，包括皮肤，胃肠道的不同区域，从口腔或口直到直肠，鼻腔，耳朵，肺和阴道。每个位置的不同环境导致微生物为了生存的竞争和适应。此外，在健康宿主中，先天机制有助于选择性地利于与病原微生物相对的共生体或有益健康的微生物的生存。

研究已表明，健康的微生物组对碳水化合物和蛋白质的代谢，免疫系统的发育，上皮的功能，激素生成，维生素生成，病原体保护和脂肪储存非常重要。(Hooper等，2004，Stappenbeck等，2004)。

在体内，口，消化道和结肠的粘膜表面被大量内源性细菌覆盖，该内源性细菌提供保护和对抗致病生物和食物抗原的屏障。存在对内源性细菌和食物抗原的免疫耐受性，使得全身适应性免疫系统不会对这些抗原反应过度，而保持对致病细菌的反应性。由例如感染性胃肠炎的急性发作，细菌过度生长或一剂抗生素引起的屏障的任何破坏都导致炎症和细胞因子的流入。炎症中断免疫耐受性并且可能导致肠易激疾病(IBD)，肠的慢性炎症性病患，以疼痛、直肠出血、严重腹泻和体重减轻为特点。

在口中，牙周疾病已被认为是具有特定诱发细菌的感染，然而许多牙周细菌现在被认为是永久性共生细菌而不是暂时性病原体。人类口腔粘膜的微生物群由极大数量的细菌种类组成，其通常与宿主以共生和谐存在。例如，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)可以从健康个体分离，但是在一些具有骨质流失和炎症的个体中涉及严重的牙周疾病。

皮肤也被密集的共生生物的群落定殖，其占据皮肤并且通过通过营养竞争(Bibel等，1983)以及通过抑制致病生物的抗菌肽(AMP)的产生(Cogen等，2010)抑制病原体的定殖来直接保护以对抗致病性侵入物。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)产生大量的AMP以控制致病性金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株的生长。

我们通常认为皮肤感染的细菌是总菌群的一小部分。凝固酶阴性葡萄球菌(Staphylococci)，诸如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)，是在皮肤的干燥区域中占主导地位的共生体中的很大一部分。亲脂性生物，诸如丙酸杆菌属(Propionibacterium spp)和马拉色菌属(Malasseziaspp.)在皮脂腺区域占主导地位，并且潮湿的非皮脂腺区域更有可能被酵母菌，诸如念珠菌属(Candida)或真菌，诸如毛癣菌属(Trichophyton spp)所占据。虽然这些无处不在并且通常是良性的，但当皮肤屏障受损或破损时，共生细菌通常与皮肤疾病有关。当微生物组和皮肤的免疫系统平衡时，保持最佳的皮肤健康。共生微生物桥接先天和适应性免疫系统，并且使免受特应性致敏和炎症。

由于两个原因，通过过量使用局部抗生素去除共生生物，诸如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)可能对宿主有害。首先，去除表皮葡萄球菌消除了细菌的内源性抗菌肽，允许潜在的致病生物更有效地定植于皮肤。其次，没有皮肤的细菌引发作用，宿主在抵抗感染方面可能效率较低。

随着对微生物组重要性的了解，研究人员一直在研究如何对其调节，以维持或改善整体健康，防御或治疗感染及相关疾病或病症。

通常最依赖的方法是使用抗生素，这已经对现代医学有所帮助，无论是在对抗感染方面，否则感染可能会杀死宿主，还是允许在没有后续感染和死亡的重大风险下进行手术。然而，抗生素的主要衰败是，当然除了抗药性的发展之外，抗生素几乎没有选择性——使得药物基本上杀死了所有的微生物组，包括有益的共生体。考虑到如先前所讨论的微生物组的重要功能，这是不希望的。

其他方法包括使用益生元(prebiotics)和益生菌(probiotics)，其被认为有助于调节微生物组。益生元旨在为共生体提供最佳的生长条件。益生菌包括实际的微生物，其目的是用特定种类丰富身体的微生物组，具有明显的有益结果。合生元(synbiotics)包括益生元和益生菌的组合。尽管这些方法具有前景，但仍然几乎没有调节微生物组对于关键的所需健康结果的治疗效果的科学证据。此外，尽管益生元和益生菌可能有助于增强系统的防御系统，但它对治疗已经表现出的感染几乎没有效力。

WO 2014/159659描述了使用螯合剂和碱来选择性靶向牙科疾病中的致病细菌的组合物。许多潜在的化合物被列为潜在的增强剂，没有任何特定的抗微生物作用，但其以某种方式增强了螯合剂或碱的作用。然而，大多数增强剂未被研究或显示出改善治疗效果。此外，没有提示，WO2014/159659中使用的组合物对牙科环境外的微生物组具有选择性。

WO 2011022542已经试图通过依赖于对每个微生物组位置(例如在口，皮肤和气道中)的特异的宿主衍生因子开发具有改善的选择性的组合物。例如，它公开了使用唾液消化产物如麦芽糖，麦芽三糖和糊精来选择性地调节和促进口中的共生体。它还广泛地提出了一系列其他可能具有额外益处的化合物。提供了七种示例组合物，但没有任何关于是否这些组合物对共生体与致病性微生物任何选择性地有效地起作用或赋予的分析。此外，WO2011022542教导了针对每个治疗位置开发具有不同活性剂的特定组合物。这可以被视为复杂并且不合需要的系统，其需要非常不同的组分以用作针对不同位置的活性成分。

科学研究的不同方向已经研究了所有哺乳动物身体内遍布存在的先天防御系统的蛋白质和肽。它是抵抗病原体侵入的第一道防线，始终存在于身体的所有部位，并且独立于全身适应性免疫系统。它是非炎症性的，因为它不会引起细胞因子，并且是抗炎性的，因为它吸收自由基。

先天防御系统在眼睛，口和呼吸道中特别重要，其中存在有害病原体进入的高风险。这些区域由液体(泪液，唾液和粘液)的恒定流动保护，该液体含有高浓度的先天系统的蛋白质，肽和防御素，以及过氧化物酶产生次硫氰酸盐所需的底物，诸如硫氰酸盐。

在该类别下，EP 0614352描述了洁牙剂组合物，其包括氧化还原酶类酶及其底物，以便一旦施用就形成过氧化氢，从而提供来自次硫氰酸盐离子产物的抗微生物作用。提供了许多氧化还原酶类选择，包括作为优选酶的葡萄糖氧化酶，连同其优选的底物，葡萄糖。如实施例E所示，还可加入其它成分，诸如过氧化物酶，以试图在过氧化氢存在下将硫氰酸盐离子转化为次硫氰酸盐离子。尽管显示组合物产生过氧化氢，但没有证据表明是否任何组合物向致病性微生物而不是共生体赋予任何程度的选择性。也没有数据支持是否添加过氧化物酶改善或赋予任何选择性。此外，使用了大量合成赋形剂，并且在配制组合物之前似乎需要分离或来源每种单独的组分。

作为另一示例，US 08/480,357描述了选择性靶向致病性微生物的方法，其明显缺乏对共生体的抑制。该文献强调，在过氧化物发生物(例如葡萄糖氧化酶)和卤化物，诸如Cl^-或Br-的存在下，髓过氧化物酶对某些病原体提供一些选择性，同时显然避免了特定共生体的抑制。然而，在病原体之间的选择性和效力方面，髓过氧化物酶和其他测试的过氧化物酶之间存在很大变化，结合数据通常与抑制结果相矛盾或提示对特定病原体的选择性差。相比之下，乳过氧化物酶显示出非常差的结合选择性(如表13所示)，表明它几乎没有抑制或选择性，尽管实际上没有被作者测试。充其量，US 08/480,357可以激励读者探索髓过氧化物酶(或者可能是根据权利要求1中要求保护的发明的嗜酸性粒细胞过氧化物)与过氧化物和卤化物一起使用以实现报道的结果。无论如何，该文献没有报道在大范围的致病细菌中的理想选择性结果以及对大范围的共生体抑制作用的缺乏。

在乳腺的情况下，其先天防御系统的所有组分已被广泛研究，尤其是来自乳的主要组分，诸如乳铁蛋白，乳过氧化物酶和血管生成素(核糖核酸酶)。有许多出版物描述了这些蛋白质抵抗细菌，酵母，真菌和病毒的活性。然而，这些出版物都没有教导共生体和病原体之间的选择性，或使用这些组分来调节微生物组。

总之，需要开发新的方法来有效地调节微生物组而没有抗生素的刺激性和选择性缺乏，并且同样具有比益生元和益生菌更大的效力，以选择性地抑制致病性微生物而没有对有益的共生体产生类似的抑制水平。此外，需要解决如上文关于WO 2011022542，WO2014/159659，EP 0614352和US 08/480,357所讨论的缺点。理想地，为了消费者接受和避免副作用，方法应该依赖于基于天然的组合物。优选地，组分易于来源，提取并且是耐储藏的。如果可能，组合物应具有广泛的选择性覆盖范围，以便可以使用类似的组合物来调节身体上或身体内许多不同位置的微生物组。

所有参考文献，包括本说明书中引用的任何专利或专利申请均通过引用并入本文。不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述了其作者的主张，并且申请人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。将清楚地理解，尽管本文提及了许多现有技术出版物，但该参考文献并不构成承认任何这些文献构成在新西兰或在任何其他国家中本领域的公知常识的一部分。

众所周知，在不同的司法管辖区，术语“包括”可以被归于具有独有性或包含性含义。出于本说明书的目的，并且除非另有说明，否则术语“包括”应具有包含性含义——即，它将被视为意为不仅包括其直接引用的所列组分，还包括其他非指定组分或元素。当关于方法或工艺中的一个或多个步骤使用术语“包括(comprised)”或“包括(comprising)”时，也将使用该基本原理。

本发明的目的是解决上述问题或者至少为公众提供有用的选择。

从随后的描述中，该描述仅通过示例的方式给出，本发明的其它方面和优点将变得显而易见。

发明内容

根据本发明的一方面，提供了组合诸如组合物的用途，其包括乳过氧化物酶和至少一种其他组分，其中乳过氧化物酶和至少一种其他组分具有等于或超过基本上6.8的等电点并且其是从乳中提取的，

其中组合，诸如组合物，在动物外部或内部施用，以选择性地抑制至少一种致病性微生物生长或杀死至少一种致病性微生物，而没有对至少一种共生微生物产生相当的抑制。

在一方面中，本发明提供了包括乳过氧化物酶和至少一种其他组分的组合的用途，其中乳过氧化物酶和至少一种其他组分具有等于或超过基本上6.8的等电点并且其是从乳中提取的，以选择性地抑制至少一种致病性微生物生长或杀死至少一种致病性微生物，而没有对至少一种共生微生物产生相当的抑制，通过向动物施用乳过氧化物酶和至少一种其他组分。

根据本发明的另一方面，提供了组合诸如组合物的用途，其包括乳过氧化物酶，以及乳铁蛋白，血管生成素和/或溶菌酶样蛋白质中的至少一种或多种，所有都具有等于或超过基本上6.8的等电点并且其是从乳中提取的，

根据本发明的另一方面，提供了组合诸如组合物的用途，该组合包括乳过氧化物酶，乳铁蛋白，血管生成素和溶菌酶样蛋白质，所有都具有等于或超过基本上6.8的等电点并且其是从乳中提取的，

根据本发明的另一方面，提供了组合诸如组合物的用途，其包括乳过氧化物酶，乳铁蛋白，血管生成素和溶菌酶样蛋白质，静止素(quiescin)和木菠萝素类蛋白质，所有都具有等于或超过基本上6.8的等电点并且其是从乳中提取的，

其中组合诸如组合物，在动物外部或内部施用，以选择性地抑制至少一种致病性微生物生长或杀死至少一种致病性微生物，而没有对至少一种共生微生物产生相当的抑制。

根据本发明的另一方面，提供了组合诸如组合物的用途，其包括从乳中分离的基本上所有蛋白质，其具有等于或超过基本上6.8的等电点，

根据本发明的另一方面，提供了基本上如本文所述的组合诸如组合物的用途，

根据本发明的另一方面，提供了通过选择性抑制至少一种致病性微生物生长或杀死至少一种致病性微生物，而没有对至少一种共生微生物产生相当的抑制来调节微生物组的方法，其特征在于以下步骤：

a)外部地或内部地对动物给药基本上如本文的组合诸如组合物。

在一方面，本发明提供了通过选择性抑制至少一种致病性微生物生长或杀死至少一种致病性微生物，而没有对至少一种共生微生物产生相当的抑制来调节微生物组的方法，该方法包括对动物施用组合的步骤，该组合包括乳过氧化物酶和至少一种其它组分，其中乳过氧化物酶和至少一种其他组分具有等于或超过基本上6.8的等电点并且其是从乳中提取的。

根据本发明的另一方面，提供了治疗或预防动物的病症或疾病的方法，该病症或疾病与在动物上或动物内的至少一个位置上的微生物组具有至少部分的致病关联，其特点为以下步骤：

a)给药如本文所述的组合诸如组合物，在动物外部或内部给药。

在一方面，本发明提供了治疗或预防动物的病症或疾病的方法，该病症或疾病与在动物上或动物内的至少一个位置上的微生物组具有至少部分的致病关联，该方法包括给药组合的步骤，该组合包括乳过氧化物酶和至少一种其它组分，其中乳过氧化物酶和至少一种其他组分具有等于或超过基本上6.8的等电点并且其是从乳中提取的。

在一方面，本发明提供了治疗或预防动物的病症或疾病的方法，该病症或疾病与在动物上或动物内的至少一个位置上的微生物组具有至少部分的致病关联，该方法包括给药基本上如本文所述的组合的步骤。

总之，本发明人已经发现，与对健康微生物组中存在的有益的共生微生物的明显较小的抑制作用相比，如本文所述的组合诸如组合物，对于致病性微生物的抑制具有惊人的并且意想不到的选择性。该发现呈现出其本身对用于调节微生物组和/或预防或治疗相关病症或疾病的新用途。此外，本发明提供了优于先前治疗方法(诸如不具有高度特异性的广谱抗生素)的显着优势。本发明在组合诸如组合物可以使用已知技术容易地开发，并且包括具有广泛消费者接受和安全特性的来源于乳的蛋白质的意义上也是非常有益的。最后，能够在制造和储存期间将乳蛋白质的组合分离在一起的便利性似乎也改善了整体抗微生物效果，并且早期迹象表明这也改善了有益的选择性谱的保留。

如本文所用，术语“选择性”是指对共生细菌和对致病细菌和/或伺机性致病细菌的抑制活性的差异。便利地，通过比较合适的定量抑制水平，诸如最小抑制浓度(MIC)，诸如MIC，MIC₅₀或MIC₉₀值，可以在数字上表示选择性水平。比较通常在两个不同种类之间进行，但也可以在同一种类内的菌株之间进行。比较可以表示为以下比率：

·(对共生细菌种类的抑制活性)比(对致病细菌种类的抑制率)；或者

·(对共生细菌种类的抑制活性)比(对伺机性致病细菌种类的抑制率)。

选择性水平可以是低、中或高，并且可以定量为大于或等于1.1、1.5、2,5、50、100、200或300。

如本文所用，术语“抑制(inhibit)”，“抑制(inhibition)”，“抑制(inhibitory)”，特别是关于细菌生长，是指相对于细菌种类的未抑制的生长速率细菌种类的生长速率的降低。通常，可以通过计算细胞数量随时间的变化来测量细菌生长，但是设想了其他方法，诸如培养基消化，代谢物产生等。在一些实施方式中，通过测量随时间的细菌种类的菌群相对于在没有抑制剂(诸如本发明的组合)的相同条件下生长的细菌种类的不同菌群的生长速率的差异来确定抑制程度。

组合的优选特征(例如乳的阳离子级分)

贯穿本说明书，术语“阳离子级分”的使用应被视为意为来自乳的级分或分离的组分，其是与阳离子交换媒介结合的阳离子组分，并且包括任何乳的组分，其具有等于或超过基本上6.8的等电点。

贯穿本说明书，术语“共生”应被视为意为通常对宿主无害的生物体，并且可以为宿主提供有益作用。

本发明人发现，从乳中分离的阳离子级分中的一些或所有蛋白质共同地一起作用以某种方式诱导对许多致病性微生物的高度有益的选择性，而没有对共生体产生相当的抑制水平。正在进行进一步测试以确定哪种特定组合提供最佳结果；然而，初步试验已经表明，如果将来自乳的阳离子级分的更多蛋白质保留在一起，则选择性地协同增强。

如本文所用，术语“协同”意指用本发明的组合物和组合实现的效果大于由使用单独组分作为单一疗法产生的效果的总和。有利地，这种协同在相同剂量下提供更大的功效，而提供没有可辨别的效果的效果则不是协同。

应当理解，将组合物中的蛋白质组合在一起的特定方法(其似乎提供有利的选择性)不应被认为是对本发明的限制。例如，通过了解本文观察到的选择性结果以及对阳离子级分中蛋白质的清楚理解，本领域技术人员可以可能地制备来自不同来源的蛋白质的组合，或甚至可能在合成上工程化每种蛋白质并且组合它们，视情况而定。然而，使用色谱法分离和洗脱阳离子级分的能力代表了制备本发明组合作为组合物的便利方式，并且还提供了将蛋白质保持在其先天环境中的精巧的机制以避免蛋白质功能的损失或与其他乳蛋白质相互干涉，并且以促进蛋白质之间似乎起作用的任何形式的协同。

组合诸如组合物中使用的蛋白质，可以从一种或多种乳来源中分离或提取，诸如牛乳，绵羊乳，山羊乳，水牛乳，骆驼乳，人乳等。在牛乳中发现的主要和次要蛋白质(用于该初步研究)也存在于其他乳来源中，在每种情况下都具有非常相似的等电点。此外，术语乳应采取包括全脂乳，脱脂乳或乳清。

因此，基于在这些乳来源中发现的密切相关的蛋白质，将预期这些蛋白质在组合中协同地一起作用以提供类似的选择性响应，并且可以方便地提取并且储存在一起作为从任何给定的乳来源分离的阳离子级分。

在一种优选的实施方式中，通过SDS-PAGE，阳离子级分可为3,000-80,000道尔顿的分子量分布。

该蛋白质大小分布范围包括在乳的阳离子级分(和子级分)内观察到的蛋白质的大小。

在本发明的优选实施方式中，阳离子级分和蛋白质中最普遍的蛋白质是乳铁蛋白，血管生成素和乳过氧化物酶。乳中的相对量确实变化很大。通常，阳离子级分(和因此可能所得的组合，诸如组合物)可包括20-70％w/w之间的范围内的乳铁蛋白和5-40％w/w之间的范围内的乳过氧化物酶。本发明人相信这些蛋白质可主要负责对病原体的令人印象深刻但意想不到的选择性，有利于促进微生物组中的共生体。

然而，在乳中还存在大量的额外蛋白质，其可以作为阳离子级分和组合(诸如由本发明人研究的组合物)的一部分被分离，其中许多也可以有助于在大量的病原体与共生体中观察到的有益的选择性。

没有限制，在乳的阳离子级分中存在的蛋白质，以及另外被认为与本发明有关的蛋白质，在下面更详细地讨论。应当理解，尽管认为许多这些蛋白质与先天免疫应答相关和/或赋予一定水平的杀生物活性，但从未阐明来自乳的蛋白质可以协同地一起作用以提供对微生物的选择性以帮助调节微生物组环境。

乳过氧化物酶

乳过氧化物酶(Lp)是存在于乳腺分泌物和哺乳动物的许多其他外分泌分泌物中的蛋白质。

乳过氧化物酶系统由三种组分组成——Lp，硫氰酸盐和过氧化氢，其所有都存在于鲜乳中。Lp通过过氧化物催化硫氰酸盐的氧化并且产生具有抗菌性能的中间产物(次硫氰酸盐(OSCN^-))。硫氰酸盐存在于乳腺，唾液腺和甲状腺及其分泌物中，在滑液、脑液、宫颈液和脊髓液中，在淋巴和血浆中，并且在器官，诸如胃和肾脏中。乳过氧化物酶系统的第三种组分过氧化氢，通常不会在乳中检测到，但存在于感染期间。

乳过氧化物酶系统对多种易感微生物具有抑菌或杀菌活性，包括与乳腺炎相关的细菌，真菌和病毒。

本发明人先前通过2006年之前的主要研发产品(NZ专利547849的主题)认定，阳离子级分(包括乳过氧化物酶和从乳中分离的其他优选蛋白质)能够通过在施用后攻击乳腺中致病微生物有效地用于治疗乳腺炎。10多年前的这一重大突破是重要的，因为它提供了治疗，该治疗巧妙地从哺乳动物乳腺环境的先天免疫应答中进行，并且利用由实际的乳腺产生的内源地发现的蛋白质。此外，该组合物的功效不依赖于常规抗生素治疗，其在乳制品工业中是重要的壮举，因为它避免了抗生素抗药性增加、长停药期的问题并且解决了对抗生素治疗的天然替代品增长的消费者需求。本发明人当时还设想，除乳腺炎外，相同的组合物也可用于治疗身体的其他区域上的感染。

然而，现在本发明人最近才发现，在该阳离子级分中发现的蛋白质具有重要的其他治疗性和商业特性，其对致病性微生物是高选择性，但对有益的共生体具有显着的低抑制。这开创了乳蛋白质的全新应用，以改善人类或其他动物的身体上或身体内存在的微生物组。

此外，它克服了与施用对病原体无选择性并因此破坏了整个微生物组(包括病原体和共生体两者)的抗生素相关的问题。益生元或益生菌的作用更加保守地增强共生体，但没有任何直接的抑制功能。然而，本发明对病原体具有直接抑制作用，使其成为对抗感染或具有被致病性微生物占主导的功能不良的微生物组的病症的更有效的工具。

实际上，这种新发现的选择性打开了将选择性抗微生物乳源性组分与益生元或益生菌潜在组合的大门，以便进一步增强天然微生物组的平衡，而同时地外源地增加天然共生体活性。这是本发明的功能优点，否则单独使用益生元或益生菌是不可能的。

与本发明完全相反，US 5,888,505描述了不同形式的过氧化物酶对靶向致病性微生物具有广泛的多样性和特异性。结果表明，与其他形式的过氧化物酶相比，乳过氧化物酶在不同微生物之间有效地提供无或非常少的选择性。与此相反，本发明人现在已经发现乳中的阳离子级分，其完全依赖于乳过氧化物酶作用(而不是其他过氧化物形式)以及与从乳中分离的具有超过6.8的pI的其他蛋白质一起表现得非常好，并且事实上似乎显著优于US5,888,505中所见的特异性和广谱有效性。此外，本发明不需要为治疗效果加入过氧化物或卤化物(尽管如果治疗部位缺乏天然底物如过氧化物/卤化物，则可包括任一种)，并且不需要高浓度的乳过氧化物酶以实现理想的击倒作用。此外，消费者对商业产品中乳过氧化物酶的接受度相当好。除此之外，乳蛋白质是稳定的并且可以廉价地获得。

US号6,544,498公开了通过梯度洗脱提取碱性蛋白质级分，该碱性蛋白质级分具有7.5和11之间的等电点和3,000至80,000道尔顿的分子量分布，具有的主要组分是乳过氧化物酶和乳铁蛋白。US 6,544,498认为，他们的申请的创造性基于抑制牙槽骨减少的分数，并且示出了支持这一点的实验数据。没有迹象表明US 6,544,498中的组合物被鉴定为对致病细菌具有选择性而没有对共生体产生类似的抑制，也没有任何通过将许多(如果不是全部)如本发明中描述的具有超过6.8的pI的乳蛋白质的蛋白质组组合可以显着增强选择性的讨论。事实上，许多后来的出版物证实，美国No.6,544,498中的蛋白质分数通过促进成骨细胞增殖作用于抑制牙槽骨的减少(参见例如：US 8,647,619；Aoe,S.,等Acontrolledtrial of the effect of milk basic protein(MBP)supplementation on bonemetabolismin healthy menopausal women.Osteoporosis International 2005；16:2123-8；16：Yamamura，J.，等Milk basic protein(MBP)increases radial bone mineraldensity in healthy adult women.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry2002；66(3):702-4；Dorit Naot；Andrew Grey；Ian R.Reid；Jillian Cornish Lactoferrin—ANovel Bone Growth Factor Clin Med Res.2005May；3(2):93-101)而不是通过任何抗菌活性，更不用说选择性的抗菌活性。因此，US 6,544,498对本发明没有教导。

乳铁蛋白

乳铁蛋白(Lf)是糖蛋白，其存在于乳腺分泌物和哺乳动物的许多其他外分泌分泌物中。Lf主要通过表面上皮细胞分泌到粘膜环境中。乳铁蛋白是多功能蛋白质，其具有抗细菌，抗真菌，抗病毒，抗肿瘤，抗炎和免疫调节的特性。因此，本发明人期望乳铁蛋白有助于组合诸如组合物，的抗微生物作用，但更重要的是，在某种程度上，与组合中的其他蛋白质组合，有助于赋予对致病性微生物的复杂的选择性水平，但对共生体具有非常低的MIC水平。

Lf在鼻腔和气管通道以及胃、生殖器和眼的分泌物中以高水平产生。Lf也在中性粒细胞中以高水平产生，其中它储存在次级颗粒中并且在炎症期间释放。

Lf抑制微生物生长的机制尚未完全阐明。其抗微生物和抗炎作用被认为是Lf的许多不同作用或功能的结果。

牛乳铁蛋白的高碱性N末端区域被认为是对于抗微生物活性至关重要的。可以通过蛋白酶去除25个N-末端氨基酸以形成乳铁蛋白肽/乳铁蛋白素(lactoferricin，Lfcin)。这些蛋白酶可以天然存在于乳或血清中，并且许多微生物产生蛋白酶。Lfcin对一些微生物的有效性比完整的乳铁蛋白提高了1000倍。已证明Lfcin抑制多种微生物，诸如革兰氏阴性细菌，革兰氏阳性细菌，酵母，丝状真菌和寄生原生动物，包括一些抗生素抗性病原体。因此，可以将乳铁蛋白肽加入到组合诸如组合物中，来替代乳铁蛋白，和/或由于蛋白水解作用，乳铁蛋白肽成为本发明的组合中乳铁蛋白的天然降解产物，这是合理的。

Lf与脂多糖结合。当革兰氏阴性细菌被动物的天然防御系统或被抗微生物剂杀死时，脂多糖从细菌细胞壁的释放引发炎症反应。因此，Lf的主要作用之一是结合LPS并且预防炎症反应。Lf还通过与细菌内毒素具有高亲和性的结合显示免疫调节作用，从而防止内毒素致死性休克。

Lf也是铁结合糖蛋白。大多数微生物都需要铁来生长，并且因此Lf具有抑制细菌生长可能性，并且甚至通过夺去它们的铁来杀死它们。Lf的抗菌活性的有效性取决于生物的铁需要量，外源性铁的可用性，以及Lf的浓度和铁饱和度水平。

牛Lf当前的商业应用包括婴儿配方食品，发酵乳，营养铁补充剂，口香糖，免疫增强营养食品，化妆品制剂和饲料和宠物护理补充剂。因此，有利的是注意到，在组合诸如组合物中对于乳铁蛋白的使用被一般消费者接受，并有食品安全法规。

血管生成素-核糖核酸酶

已经在乳中鉴定出血管生成素-核糖核酸酶属于核糖核酸酶超家族，并且已知其具有一些抗病毒和抗微生物活性。因此，本发明人期望血管生成素-核糖核酸酶有助于组合的抗微生物作用，但更重要的是，在某种程度上(与组合中的其他蛋白质组合)有助于赋予对致病性微生物的复杂的选择性水平，但对共生体具有非常低的MIC水平。

溶菌酶样蛋白质，诸如几丁质酶样蛋白质(CLP-1)或溶酶体α甘露糖苷酶(LAM)

组合优选包括溶菌酶样蛋白质，诸如几丁质酶样蛋白质(CLP-1)或溶酶体α甘露糖苷酶(LAM)。溶菌酶样蛋白质(诸如CLP-1或LAM)具有细胞裂解活性，并且从而被认为通过其溶菌酶样作用增强抗微生物活性。

在优选的实施方式中，组合(诸如阳离子级分)还可以包括静止素和/或木菠萝素类蛋白质。

可以包含在组合中以改善其有效性的其他乳蛋白质(通过赋予选择性或蛋白质功能的一些其他形式的间接调节)包括：

-抗菌肽1；

-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶；

-血清淀粉样蛋白A；

-β防御素；

-肽聚糖识别蛋白；

-黄嘌呤脱氢酶；

-免疫球蛋白IgA，IgD，IgG，IgM，IgA和/或IgE；

-生长因子EGF，IGF 1，TGF B1和TGF B2。

免疫球蛋白是乳的重要组分，并且为哺乳的幼仔提供被动保护。虽然它们不是强阳离子，但是一些免疫球蛋白，IgG，IgM，IgA和多聚免疫球蛋白受体(PIGR)被阳离子交换捕获。免疫球蛋白在抵抗外来侵入物的第一道防线中是重要的。免疫球蛋白与微生物结合，并且从而调理它们，使得它们更容易被吞噬细胞识别。因此，这是合理的，它们可对本发明中观察到的选择性也具有一定影响，并且可与阳离子级分中的其他蛋白质协同地作用。

可以预期，从乳中分离的组合(诸如阳离子级分)也可包含少量的多种生长因子；尽管这些生长因子可能以低水平存在，但它们的作用在刺激细胞修复方面可以是有效的。这些生长因子可包括例如：EGF，IGF1，TGF B1和TGF B2。

有趣的是，Smolenski等(2007)通过质谱分析法(MS)报道了牛乳中次要蛋白质的特性和显着数量，并且，特别地，鉴定了大量参与宿主防御的乳蛋白质。然而，尽管提到单个蛋白质具有抗微生物活性，但Smolenski绝不提及或暗示对任何单个蛋白质或蛋白质组合的任何选择性。结果在表1中示出，其中我们已经适应地以粗体示出一些蛋白质，其对应于优选地并入本发明组合中的那些蛋白质(并且其经由乳中的阳离子级分分离并且示出了具有根据本发明的高选择性)。应该注意，Smolenski等(2007)使用SDS-PAGE方法，其未公开在本发明中使用的组合(诸如包括阳离子级分的组合物)中鉴定的蛋白质的检测(诸如血管生成素，木菠萝素类蛋白质，静止素，PIGR和生长因子)。

表1.从乳中鉴定的宿主防御相关的次要蛋白质，示出了一些可以作为阳离子级分(粗体)的一部分提取的那些蛋白质(转载自Smolenski等，2007)表1：在牛乳中鉴定的次要蛋白质。

¹免疫球蛋白通常具有5.0-9.5范围的等电点。因此，并非所有都与阳离子交换树脂结合。

^*这些蛋白质的等电点是基于预期的蛋白质结构计算的。(Swiss Prot/TrEMBL,www.expasy.org)。

一些阳离子级分组分(例如乳铁蛋白，血管生成素)也可以具有次要变体，——诸如氨基酸序列或糖基化的水平和类型的变化，这些次要变体以及它们在阳离子级分中的存在也应当视为被本申请涵盖。

在一种优选的实施方式中，最终的治疗组合诸如组合物，可以是以液体，乳膏，凝胶，糊剂，粉末，胶囊，锭剂，片剂，栓剂，团注剂，可注射溶液等等的形式。

最终的治疗组合可以包括以下中至少一种或多种：载体，缓冲剂，防腐剂，赋形剂或其他药学上可接受的所需组分，以确保阳离子级分是处于易于分配、使用并且有效的形式，为了选择性地支持微生物组的目的。

在一种实施方式中，最终的治疗组合还可包含至少一种能够控制组合的长效释放的组分。这可以用于在延长的时间段内有效地延长治疗作用的释放。可用于此目的的已知的组分对于本领域技术人员将是公知的。

组合诸如组合物，还可包括以下一种或多种：

1.过氧化物酶底物，

2.过氧化氢或过氧化氢源；

3.细胞裂解物质，能够完全或部分裂解细胞壁(诸如去垢剂，如单甘油酯或甘油单月桂酯[单月桂酸甘油酯])。

过氧化物酶底物可以是乳过氧化物酶或任何其他过氧化物酶酶可以作用的任何底物或化合物。在一种优选的实施方式中，过氧化物酶底物可以是硫氰酸盐。

在一种特别优选的实施方式中，过氧化物酶底物可以是硫氰酸钾或硫氰酸钠。或者，可以使用任何其他可以作为过氧化物酶底物的硫氰酸盐。

在优选的实施方式中，过氧化物酶底物的最小浓度是20ppm(当过氧化物酶底物是硫氰酸钠时)，20ppm(当过氧化氢源是抗坏血酸盐时)和5ppm(当细胞裂解剂是甘油单月桂酯时)(如在体外所示)。

然而，本领域技术人员将认识到，这些可以不同，取决于所施加的组合的类型，即液体或糊剂，以及特定的应用或作用部位。

本领域技术人员还将认识到，在体内，施用部位可能已经具有过氧化物酶底物存在。在这种情况下，可以不需要将其包含在制剂中，或者可以能够以较低的浓度包含。

在优选的实施方式中，所使用的过氧化氢源可以是抗坏血酸盐或抗坏血酸。

已在先前的出版物中示出抗坏血酸盐和抗坏血酸是过氧化物酶的良好底物。这是优选的过氧化氢源，因为它是稳定的——不像过氧化物本身。

过氧化氢也是过氧化物酶的底物。因此，本领域技术人员将认识到，如上文关于过氧化物酶底物所讨论的，将应用相同的考虑。

治疗性用途

尽管将在最佳模式部分中更详细地概述试验结果，但我们简要概述了一些病原体和共生体，其已知存在于微生物组中并且因此可能是本发明的目标。在下文中，我们概述了身体的治疗区域，以及由于这种新确定的微生物组的选择性和调节而可受益的潜在病症/疾病。

优选地(但不限于)，致病性和/或共生微生物选自由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、需氧细菌、厌氧细菌、真菌、酵母和/或病毒组成的组。初步结果表明，在许多(如果不是全部)这些不同的生物类型中，对病原体将有广泛的选择性。

初步试验(其结果在表4中示出)示出了明显的选择性(0.1和0.5之间的低MIC)，这可能是抑制致病性微生物(或者如果微生物组受损，其可以变成致病性的)的广泛选择所需要的，其包括痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)，白色念珠菌(Candida albicans)，须癣毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，糠秕马拉色菌(Malazzeziafurfur)，大肠杆菌(Escherichia coli)。这些致病性微生物涉及皮肤、毛发、指甲、肠道、鼻、耳朵口、阴道、前尿道、肺和身体的任何其他区域的感染，这些区域的表面可与外部气体、液体、食物等接触，或经由血液屏障，诸如乳腺，从内部系统中分离，其举例说明了组合的广泛治疗性用途。正在进行进一步的试验以确定其他目标，并期望成功。

结合起来，由本发明人进行的初步试验表明，组合在大范围的共生微生物中显示出相对低的抑制水平，其在最佳模式部分中更详细的概述。例如，共生微生物的MIC(mg/ml)是大多数病原体的MIC的20-100倍高(表4)。这意味着组合对共生体具有低抑制效力，使得它们可以增殖并且完善微生物组，同时感染部位处的病原体被组合攻击。

本发明人还预期组合可具有选择性调节伺机性共生体的能力，该伺机性共生体虽然在健康环境中赋予宿主益处，但如果微生物组被削弱或者如果共生体通过屏障进入，诸如皮肤或胃肠道内膜(例如由于受伤)可能引起感染或伤害。在这种情况下，共生体可能变成致病性的，并且组合可具有选择性调节微生物组的能力，从而减少感染的机会或严重性。有许多可变得伺机性的共生体的示例，并且在该领域中有相当多的研究来理解微生物组环境的这一方面的复杂性。

应当理解，本发明不应仅限于在初步试验期间测试的微生物，因为预期选择性将具有许多治疗性用途的深远的结果。在大范围的病原体与共生体中的广泛特异性趋势意味着相同的组合可以有利地用于治疗大范围的病症，和/或被施用以提供预防性的或促进作用以支持在身体上或身体内的大范围的区域中的健康微生物组。

组合可以基本上依赖于天然中发现的内源性蛋白质，其可以从具有广泛消费者接受的乳中提取，该事实更进一步增强了这一优点。

组合中蛋白质的协同治疗效果(通过比较US 5,888,505中的结果强调)也巧妙地利用了以精巧的方式将蛋白质分离在一起以保持其与其他蛋白质的天然相互作用并且以保持消耗前组合的稳定性的简单能力。

待治疗的区域

如由本领域技术人员将容易理解的，给药途径和药学上可接受的载体的性质将取决于病症的性质和待治疗的动物(优选哺乳动物)。可以相信，特定载体或递送系统的选择和给药途径可以由本领域技术人员容易地确定。

本发明的组合可以允许单独的、顺序的或同时的给药乳过氧化物酶和至少一种如上文所述的其他组分提取物。组合可以以药物组合物的形式提供，其中乳过氧化物酶和至少一种其他组分是以紧密混合物存在。

通常，将给药治疗有效量的本发明的组合。当给药于动物，优选哺乳动物，更优选需要这种治疗的人类时，如下文限定的术语“治疗有效量”是指足够达到治疗目的的量。治疗有效量将根据所治疗疾病的受试者和性质，感染的严重性和施用的方式而变化，并且可由本领域普通技术人员常规地确定。

如本文所用的术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”涵盖动物，优选人类中的感染的任何治疗，并且包括：(i)抑制感染；(ii)减轻感染；或(iii)减轻由感染引起的病症，例如感染的症状。

如本文所用的术语“预防(prevention)”和“预防(preventing)”涵盖动物，优选人类中的感染的预防或预防法，并且包括预防感染发生在可能有感染倾向的但尚未被确诊为感染的受试者中。

在一些实施方式中，配制本发明的组合用于局部给药。优选地，本发明的组合将局部施用，诸如在糊剂，乳膏，洗剂，凝胶中或经由浸渍敷料或浸渍面膜。如本文所用，术语“局部”是指用于施用于皮肤，指甲或粘膜组织(诸如牙龈)的组合。本发明的组合被认为在一系列皮肤，指甲和粘膜感染的治疗和/或预防方面特别有效。

没有限制，下表(表2)概述了可以用组合治疗以选择性地调节微生物组的人体的可能的区域表面。这可有益于治疗现有的感染(或与所述感染相关的疾病或病症)，或者可以替代地用作预防措施，类似于益生元或益生菌，以有益地增强微生物组免于未来的感染。

例如，该信息建议使用该组合靶向多个位置的感染，并且促进有益的共生体，同时抑制或杀死致病性微生物。

组合产品

本申请人设想本发明的组合可包括已知的或被认为促进或增强微生物组的其他化合物或材料。例如，该组合可包括益生元或益生菌。这可以更进一步增强选择性谱。

制造和储存方法

有趣的是，本申请人在先前的研究中发现，随着阳离子生物活性级分变得更加纯化，对病原体乳房链球菌(Streptococcus uberis)(在乳腺炎的情况下)的抑制作用减弱。这与普通思维相反，因为普遍理解，组分越纯，它就将越有效。此时，这导致了假设，其随后被测试，本发明的“总阳离子级分”可以用作成功的天然衍生的抑制产物。另外，从本申请人的先前研究发现，乳蛋白质(即具有超过6.8的pI的阳离子乳级分)的组合引起强大的抗炎作用。然而，没有设想这种现象也会对于对致病性微生物与共生体的有益选择性具有影响，其直到现在才被发现，并且其开辟了一套全新的治疗性用途。

应当理解，术语乳可包括任何未加工(或未被加工的)的乳。这采取包括处于冷冻或环境温度下的已经冷冻，温育或储存的未加工的乳。

在一种优选的实施方式中，阳离子级分可以从牛乳中提取。

然而，这不应被视为限制，因为阳离子级分也可以从其他哺乳动物种类提取，包括但不限于绵羊、山羊、水牛、骆驼和人类。

在一种实施方式中，阳离子级分中不同阳离子组分的比例可以是提取的或浓缩的。

然而，这不应被视为限制，因为可以期望分别改变或控制至少一种或多种组分的比例。应当理解，本公开涵盖了阳离子级分组分的比例中的任何这种改变。

在一种优选的实施方式中，阳离子级分可以在挤奶过程期间或直接在挤奶过程之后“在农场”提取。这可以是有利的，因为在随后的处理，储存，脂肪去除或其他加工步骤期间一些组分可能丢失，损坏或变性。

许多方法可用于制备组合诸如组合物，如根据本发明所述的。然而，阳离子交换被认为是优选的制备方法，如将在下面进一步详细讨论并且在最佳模式中举例说明的。

优选地，该方法包括从乳中提取优选的蛋白质，包括以下步骤：

a)将乳通过提取材料，并且

b)洗脱具有超过6.8的pI的结合乳组分的阳离子级分。

在优选的实施方式中，提取材料可以是阳离子交换材料。这可以是以树脂，膨胀床树脂，磁珠，膜的形式或其它适合于大规模提取的形式。

在优选的实施方式中，阳离子交换材料可以是具有足够的机械强度以抵抗高压并且保持高流速的任何材料。

在优选的实施方式中，阳离子交换树脂可具有超过100μm的平均粒度。已经开发出较大珠粒形式的树脂用于粘性进料流，因为它们不像较小的珠粒那样紧密堆积，因此存在更宽的通道，以便没有过多的背压。

合适的阳离子交换树脂的示例是SP-Sepharose Big Beads，SP-Sepharose FastFlow，SP-Toyopearl和S-Ceramic HyperD。

提取和纯化过程的一个示例如下：

乳铁蛋白与阳离子交换牢固结合，并且是在盐梯度中洗脱的最后一种主要蛋白质。因此，用1M盐(80mS-100mS)的单步洗脱来洗脱单个级分(阳离子级分)中的所有蛋白质和肽。在先前的40mS洗脱后用80-100mS盐洗脱将产生主要是乳铁蛋白的级分。

在乳铁蛋白之后，乳过氧化物酶是通过离子交换从乳中(0.03-0.075mg/ml乳)捕获的下一个最丰富的阳离子蛋白质。在盐梯度中，乳过氧化物酶在乳铁蛋白之前以25-30mS从阳离子交换中洗脱。

生长因子EGF，IGF 1，IGF 2，TGF B1和TGF B2以ng/ml的量存在于乳中，并且已显示出通过阳离子交换捕获。

许多其他生物活性阳离子肽在乳过氧化物酶和乳铁蛋白之间以35-40mS(中间级分)洗脱。这些可能包括静止素，木菠萝素类蛋白质和溶菌酶样蛋白质，诸如几丁质酶样蛋白质(CLP-1)或溶酶体α甘露糖苷酶(LAM)。因此，在洗脱的每个步骤中使用的盐浓度决定了这些生物活性肽是在乳过氧化物酶级分中还是在乳铁蛋白级分中。在初步研究中，本发明人已经确定，与仅在中间级分中的蛋白质相比，整个阳离子级分似乎具有高得多的选择性水平。

免疫球蛋白在低盐(15-20mS)中洗脱。

在优选的实施方式中，乳或乳制品可以通过具有阳离子交换特性的膜，或用阳离子交换树脂填充的柱或具有悬浮阳离子树脂的间歇式反应器，由此微量组分从起始的乳或其产物吸附到阳离子交换树脂或膜上。

在吸附乳微量组分后，优选通过用盐溶液洗脱来提取阳离子级分。

然而，这不应被视为限制，因为阳离子级分的洗脱也可以经由pH的变化进行。然而，该方法在大规模商业过程中不普及，因为从树脂中去除乳铁蛋白所需的高pH可能损害乳铁蛋白，或者在本情况中的阳离子级分中的任何其它组分。

在优选的实施方式中，在洗脱之前，可以用盐溶液冲洗树脂或膜。优选地，冲洗溶液可以是氯化钠或碳酸氢钠，具有在5和10mS(毫西门子/cm)之间的电导率。该冲洗步骤确保基本上所有未吸附的乳组分从树脂上冲洗掉或从膜中冲洗出。

在优选的实施方式中，阳离子级分可以在基本上10mS和100mS电导率(0.1至2.0M盐)之间的盐梯度中洗脱。

在优选的实施方式中，阳离子级分可以通过使具有80和100mS之间的电导率的盐溶液通过柱或膜而在单个级分中洗脱。

在优选的实施方式中，洗脱盐可以优选为氯化钠。然而，这不应被视为限制，因为可以使用其他盐，包括乙酸钠，碳酸氢钠，碳酸氢铵或氯化钾。

使阳离子级分在一步洗脱中洗脱提供了显着的优点。它减少了提取时间的长度，从而降低了生物活性变性的可能性。它还减少了提取过程的时间，劳动力和成本。这可以提供显着的优点，尤其是在大规模上。此外，结果清楚地表明，当具有超过6.8的pI的乳组分作为单个分离的级分保留并且一起施用时，抑制作用(并且我们还期望选择性)将增强。

在优选的实施方式中，在初始监测洗脱流中的蛋白质水平以确定盐的浓度和洗脱所有蛋白质所需的体积之后，典型的大规模过程在体积而不是连续监测下进行。

在优选的实施方式中，提取可以以连续的方式进行。

在另一优选的实施方式中，提取可以以分批洗脱进行。

在上述优选实施方式中，阳离子级分可以通过“一步”过程，通过分布洗脱来提取。

在替代实施方式中，可以使用梯度洗脱提取阳离子级分。

然而，这不应被视为限制，因为阳离子级分也可以以独立的级分提取并且重新组合以在稍后阶段形成完整的阳离子级分。

在一些实施方式中，阳离子级分可以通过本领域已知的标准技术经受进一步处理，例如，去除盐，或浓缩，或过滤为无菌或去除内毒素。浓缩的级分也可以被冻干。

在优选的实施方式中，阳离子级分可以浓缩至约20％固体。

在从以常规方式加工的乳中提取阳离子级分的情况下，包括储存，运输和转化成脱脂乳或乳清，温度应优选保持在基本上4-7℃以使微生物生长最小化。

在从全脂乳中提取阳离子级分的情况下，温度应优选保持在不低于35℃，以确保脂质保持在液体状态，使得它们可以容易地通过提取材料。并且确保阳离子级分中因子的生物活性保持在或接近内源性状态。

在替代实施方式中，阳离子级分可以从遗传修饰动物中提取，例如奶牛中乳铁蛋白产生的遗传修饰增强。本领域技术人员将认识到，从遗传修饰动物的乳中提取可以影响乳铁蛋白或阳离子级分中的其他组分，或整个系列的关键组分的比例或浓度。

在一种优选的实施方式中，阳离子级分可以从与处理物质打算使用的相同动物种类中提取。

优点概述

本发明被认为提供了许多显着的优点，包括：

·对大量致病性微生物的抑制的高选择性，而没有对大量共生体产生类似的抑制水平；

·组合诸如组合物靶向伺机性共生体的能力的潜力；

·与其他组分诸如益生元或益生菌，进一步协同的可能性；

·达到预期的效果的组合中乳过氧化物酶的浓度低，以便避免诸如溶血的问题的可能性。

·观察到的改善的选择性的协同作用似乎与具有超过6.8的pI的乳的阳离子级分中乳过氧化物酶以及其他蛋白质的保留联系密切，这在容易制备，改善的稳定性和消费者接受(需要低加工)方面也是便利地有益的。这与US 5,888,505相反，其强调的纯化形式的过氧化物(例如髓过氧化物酶)以及添加的卤化物/辅助因子是达到预期结果所需的，并且此外其乳过氧化物酶基本上不具有在病原体和共生体之间提供选择性的能力。

·提供在一步洗脱中洗脱的阳离子级分的能力减少了提取所需的提取时间的长度，从而降低了生物活性变性的可能性。它还减少了提取过程的时间，劳动力和成本。这可以提供显着的优点，尤其是在大规模上。它也似乎改善了抑制作用，并且我们期望保留选择性谱。

·组合，诸如组合物，可以方便地从乳中制备，并且因此被认为是天然的并且使用安全。

·与广谱抗生素(其将杀死微生物组中的所有微生物)不同，阳离子级分自然地保留了有益的共生体。

·与益生菌或益生元不同，组合有效抑制致病性微生物，并且因此对治疗现有感染将具有更好的治疗效果(不仅是预防)。

·同样地，组合的效力不排除以预防方式使用该组合以增强、调节或维持人(或其他动物)的微生物组以避免未来发生感染、病症或疾病的能力。

附图的简要说明

本发明的其他方面将从以下描述中变得显而易见，该描述仅通过实施例的方式并且参考附图给出，其中：

图1显示了来自阳离子交换的所有级分的一般洗脱曲线。这表示所有蛋白质峰(如在280nm处检测到的)将存在于以从80-100mS的梯度洗脱的单个级分中。阳离子级分中的主要组分是免疫球蛋白，乳过氧化物酶，乳铁蛋白和一组包括血管生成素的次要组分。

图2显示了在SDS-PAGE上分离的级分，并且表明了被切离用于质谱分析并且被鉴定为牛血管生成素的条带。免疫球蛋白级分显示作为主要的条带的PIGR(76kDa)，以及免疫球蛋白的重链(52kDa)和轻链。Lp级分主要是乳过氧化物酶，其具有少量免疫球蛋白和血管生成素的重链和轻链。中间级分具有显着的乳过氧化物酶和乳铁蛋白(80kDa)的条带和约15kDa的条带，其通过质谱分析法鉴定为血管生成素，大约13kDa的条带，其通过质谱分析法鉴定为木菠萝素类。Lf级分主要是乳铁蛋白(80kDa)。

图3显示了使用单独的阳离子级分和具有40ppm的硫氰酸钠对致病性大肠杆菌(Escherichia coli)抑制的图表，

图4显示了使用单独的阳离子级分，以及具有75ppm的硫氰酸钠和150ppm的抗坏血酸盐对致病性乳房链球菌(Streptococcus uberis)抑制的图表，

图5显示了使用阳离子级分的各种子级分、重新组合的阳离子级分和未分级的(整个)阳离子级分的情况下的致病性大肠杆菌(Escherichia coli)生长的图表，

图6显示了使用阳离子级分的各种子级分、重新组合的阳离子级分和未分级的(整个)阳离子级分的情况下的致病性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生长的图表，

实施本发明的最佳模式

实施例1：经由质谱分析法评估组合物中的蛋白质(即阳离子级分)

生产阳离子级分的过程包括将乳通过阳离子交换树脂分级，使用盐溶液从树脂中洗脱结合的组分，该盐溶液可以是一步高摩尔浓度(>1M)盐或从较低摩尔浓度到超过1M的梯度洗脱，将洗脱的组分收集在单个级分中，并且然后脱盐并且纯化收集的级分。

分析阳离子级分的构成组分，并且结果在表3中示出。这显示了对于在阳离子蛋白质级分中鉴定的主要蛋白质的产率和身份的典型结果。

这种特定的阳离子级分是从未加工的全脂乳中捕获的。

表3.来自阳离子级分的子级分，如通过质谱分析法(MS)测量的。(乳过氧化物酶是经由消光系数而不是MS确定的。)

实施例2：对病原体与共生体的抑制试验

本申请人使用本文所述的方法制备如表3中所述的从牛乳中分离的阳离子级分。使用微滴定板在体外针对许多微生物测试组合物，并且一些在琼脂扩散测试中进行。结果显示在表4中(如下所示)，鉴定阳离子级分对不同微生物的MIC(mg/ml)。

表4.针对共生体和病原体范围的阳离子级分的抑制分析。

从该初步工作可以得出的结论是：

1.频繁引起感染的微生物(即病原体)被组合(作为组合物提供)的最低浓度杀死。

2.常见的无害的共生体和/或用作益生菌的微生物未被在这些试验中测试的最高浓度杀死。(为杀死病原体的浓度的100×)。

3.诸如经常被发现作为无害的共生体并且当局部环境中的条件改变使得生长增强(例如糖浓度的增加)时仅引起感染(即变得伺机性)的白色念珠菌(Candida albicans)的中间生物显示中等至高MIC值。

实施例3：分离的和/或重新组合的蛋白质，子阳离子级分和整个阳离子级分之间的比较选择性

进行了另外的研究，其显示阳离子级分中的单个蛋白质(即乳过氧化物酶，乳铁蛋白，静止素类，木菠萝素类，几丁质酶样，血管生成素)对病原体具有较差的抗微生物效果，并且因此将不能提供由优选的组合物(最优选阳离子级分中的全套蛋白质)中蛋白质的组合提供的选择性。结果显示在图5和6中。

非正式结果还显示，中间阳离子级分(不包含乳过氧化物酶或乳铁蛋白)具有相对较差的选择性，支持了乳过氧化物酶是组合物的重要组分，但需要来自乳的其他蛋白质以便发挥观察到的选择性谱。

而且，图5和6中所示的结果显示，在提取过程期间有将蛋白质保持在一起，而不是将它们分离并且重新组合以形成组合物的益处。尽管如此，重新组合级分提供了对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的有用的抑制。

当阳离子级分保持完整时抗微生物活性增强的事实也强烈表明如果组分在重新组合之前没有彼此单独分离，则选择性将更好。也就是说，该组合作为优选地包括乳的阳离子级分的组合物提供是优选的。

基于这些结果，提供以下示意图以说明本发明对选择性的有效性。

^*例如血管生成素，静止素，木菠萝素类蛋白质和几丁质酶样蛋白质——没有Lp或Lf

^**如表4所示。

实施例4：附加底物的影响

图3和4说明在底物存在下抗微生物效果(并且因此潜在的选择性也)得到改善。如果在感染部位不存在这样的底物，则在组合中包含合适的底物可以是有益的。微生物的生长程度由条的高度表示。最短的条显示出最大的生长抑制。对于该图，左侧条表示单独使用浓度为1mg/ml的阳离子级分实现了一些生长抑制。然而，向阳离子级分中添加40ppm的硫氰酸钠允许在阳离子级分浓度为2mg/ml时发生完全生长抑制。这表明当包含其底物(硫氰酸盐)时，乳过氧化物酶有助于抗微生物活性。

图4显示了针对乳房链球菌(Streptococcus uberis)的不同阳离子级分制剂的结果，这次使用硫氰酸钠(75ppm)和抗坏血酸盐(150ppm)作为底物。对于乳房链球菌(Streptococcus uberis)，单独使用高达0.8mg/ml的阳离子级分在体外没有抑制。然而，添加硫氰酸钠和抗坏血酸盐显示出低至0.2mg/ml的阳离子级分的抑制作用。这证实，在不存在乳(或底物的另一天然来源)的情况下，添加硫氰酸盐(作为底物)和抗坏血酸盐(作为过氧化物的来源)可用于增加对乳房链球菌(Streptococcus uberis)的抑制(和可能的选择性)。

注意，在图4中，没有添加剂本身是完全抑制的。图中标记为“0”的样品是仅缓冲液和仅添加剂的样品。

表5：以下提供用于对比测试的实施例制剂

^*总蛋白质值，由于没有报道过针对该材料的乳过氧化物酶特异性分析，因此无法估计其他蛋白质水平。

注意：对于每个样品，100％的材料的剩余物主要是无机物(以灰分测量)或残留水分。

注意：n.m.没有测量

注意：阳离子乳清级分中有数百或大概数千种次要蛋白质(“其他蛋白质”)。

应当注意，“活化的阳离子级分”包括葡萄糖，葡萄糖氧化酶和单月桂酸甘油酯，其通常不见于乳中，更不用说“阳离子级分”。葡萄糖氧化酶可以使用葡萄糖作为底物来原位产生过氧化物。其他过氧化物产生系统可以包括过碳酸盐或过乙酸盐，其可以被胶囊化或包衣以控制过氧化物的释放速率。可以认为这些组分充当佐剂。

硫氰酸盐存在于“活化的阳离子级分”中并且是底物的实例。底物的其他实例包括具有钠，钾或钙的抗衡阳离子的碘化物或氯化物。

先天的乳过氧化物酶系统保护眼睛、鼻、口和气道免受有害微生物的侵入，并且需要存在乳过氧化物酶酶、过氧化物和硫氰酸盐或卤化物。

H₂O₂天然存在于内部生物环境中，因为它是各种氧化过程的副产物。例如，中性粒细胞产生大量游离过氧自由基(O₂ ^-)，其稳态浓度已估计在微摩尔范围内。(参见Hampton,MB,Kettle AJ,Winterbourn CC.Inside the neutrophil phagosome:oxidants,myeloperoxidase,and bacterial killing.Blood1998；92:3007-17)。

过氧化物酶(诸如乳过氧化物酶)存在于生物分泌物中并且催化卤化物(硫氰酸盐、碘化物、溴化物、氯化物)的H₂O₂依赖性氧化，其可与微生物反应并且杀死微生物。(参考Klebanoff SJ.Antimicrobial mechanisms in neutrophilic polymorphonuclearleukocytes.Semin.Hematol 1975；12:117-42)

硫氰酸盐天然存在于淋巴和血液中，乳腺，唾液腺和甲状腺及其分泌物中，滑液，脑液，宫颈液和脊髓液中，以及器官诸如胃和肾脏中。例如，在来自插管的成年患者的人类气管-支气管分泌物中测量的硫氰酸盐水平为0.46+/-0.19mM或26.7+/-11ppm(范围16-38ppm)。(参见Wijkstrom-Frei,C.,El-Chemaly,S.,Ali-Rachedi,R.,Gerson,C.,Cobas,M.A.,Forteza,R.,Salathe,M.和G.E.Conner.2003.Lactoperoxidase and human airwayhost defense,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,29:206-12).

因此，在某些情况下在某些情况下，诸如组合在内部施用于开放性伤口或粘膜的情况下，提供佐剂和/或底物作为组合的一部分可能不必要的，或甚至是不优选的，因为待被施用组合的组织内源性地提供底物。

在其他情况下，佐剂和/或底物的内源性浓度可能太低或不存在，不能对组合的活性产生明显的影响。在那些情况下，在组合中包含佐剂和/或底物可以是优选的。

对于体外测试，分析培养基将通常不含有佐剂和/或底物，并且与“阳离子级分”相比，对于“活化的阳离子级分”的改善结果可部分地通过包含在活化的阳离子级分中的底物和佐剂的有益效果解释。然而，当施用于，例如，已经存在底物和/或佐剂(例如卤化物和过氧化物产生)的身体区域，诸如内部施用，于开放性伤口或于粘膜时，“阳离子级分”仍然可以提供有用的选择性。

实施例5：细菌选择性

针对一系列致病性的和共生生物确定一系列测试化合物/组合物的活性和选择性。

以下描述了对于每种下列测试组合物的方法：

·乳过氧化物酶(样品3)；

·乳铁蛋白(样品2)；

·“阳离子级分”(样品4)；和

·“活化的阳离子级分”(样品1)

将每个样品制备成5mg/ml的储备溶液。将样品1、3和4溶解于含有40ppm(40μg/ml)的异硫氰酸钾的HBSS中。将样品2以5mg/ml溶解于HBSS中(表4)。

好氧测试

对于白色念珠菌(C.albicans)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)，缓症链球菌(S.mitis)，变形链球菌(S.mutans)和唾液链球菌(S.salivarius)的实验方案。

1.对于白色念珠菌，将沙氏葡萄糖肉汤粉末以30g/L加入蒸馏水中并且搅拌。对于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，将胰蛋白酶大豆肉汤粉末以30g/L加入蒸馏水中并且搅拌。对于缓症链球菌、变形链球菌和唾液链球菌，通过用双蒸水稀释绵羊血液制备5％绵羊血液肉汤。

2.然后在搅拌下将肉汤溶液煮沸1分钟以完全溶解粉末。

3.然后将肉汤培养基在121℃下热压处理20分钟。

4.取少量每种纯微生物并且用于接种40ml的肉汤培养基。将接种过的肉汤在37℃下温育大约66小时。

5.在MIC测试开始之前，用新鲜的无菌肉汤培养基将肉汤培养物稀释至大约0.1的OD_650nm，相当于约10⁵CFU/ml。这是将用于接种每个板中的测试孔的接种体。将接种体保持在4℃直至需要铺板。

6.制备测试样品的储备溶液，使得在适当的肉汤中浓度为5mg/ml。

7.将参比抗生素溶解在肉汤中，以给予100μg/ml的最终浓度。

8.然后如以下板布局图中所示设置96孔微滴定板：将200μl的适当的肉汤中的测试样品的适当的样品储备溶液，抗生素标准品和载体对照加入到板1至3上的第1列中的相关孔中。

9.向所有其他孔中加入100μl适当的无菌肉汤。

10.使用多通道移液管，从每个板上的第1列的孔中取样100μl样品和抗生素，并且转移到第2列的孔中，通过前后吸移5次充分混合。对移液管添加新的吸头，并且将100μl溶液从第2列的孔转移到第3列的孔中，通过前后吸移5次充分混合，并且然后弃去吸头。该过程一直持续到每个板上的第11列的孔。该过程将导致连续双倍稀释，其范围对于样品为从5mg/ml至0.005mg/ml，并且对于抗生素标准品为100μg/ml至0.098μg/ml。每行的第12个和最后一个孔(板1至3)包含仅含有接种体的肉汤和仅没有接种体的肉汤(板4)的孔。这些孔分别用作无菌对照空白和无测试物质对照空白。

11.板4上的孔A1-12，B1-12，C1-12，D1-12，E1-12，F1-12，G1-12和H1-12仅含有肉汤，并且未接种有种菌培养物。这些孔对于每行用作无菌对照和空白。孔A12-F12(板1-2)和A12-C12(板3)含有细胞并且用作阴性对照。

12.如下面的板布局所示，向每个孔中加入100μl接种体或肉汤。添加接种体或肉汤使每个孔中的提取物浓度减半，得到对于样品(包括载体对照)的最终孔浓度为从2.5mg/ml至0.0025mg/ml，并且对于抗生素标准品为50μg/ml至0.049μg/ml。

13.轻轻敲打板以确保接种体与样品溶液均匀混合。

14.使用Versamax微滴定板读数器读取每个孔的OD_650nm。这将被记录为零时间读数。

15.将板在37℃下温育3小时，此时读取每个孔的OD_650nm并且记录为3小时读数。

16.将板再放回培养箱中，保持13小时，并且读取每个孔的OD_650nm并且记录为16小时读数。

17.将微滴定板再放回培养箱中，保持8小时，并且读取OD_650nm并且记录为24小时读数。

18.一旦读取板的OD_650nm后，记录与在时间零点的初始读数相比OD_650nm没有可检测的变化的含有每个样品的最高稀释度(测试提取物的最低浓度)的孔。

厌氧测试

对于两歧双歧杆菌(B.bifidum)，短双歧杆菌(B.breve)，难辨梭菌(C.difficile)，产气荚膜梭菌(C.perfringens)和痤疮丙酸杆菌(P.acnes)的实验方案。

1.对于这些细菌中的每一种，使用脑心浸液血液肉汤。通过将其加入蒸馏水中制备为37g/L。

2.然后在搅拌下将肉汤溶液煮沸一分钟以完全溶解粉末。

3.然后将肉汤培养基在121℃下热压处理20分钟。

4.使用少量的每种生物接种40ml通过向其中鼓入氮气而脱空气的脑心浸液肉汤。然后将该密封管在37℃下温育。

5.在该温育期间，制备样品。在肉汤中以5mg/ml制备样品的储备溶液。

6.将参比抗生素溶解在肉汤中，以给予100μg/ml的最终浓度。

7.然后如以下板布局图中所示设置96孔微滴定板：将200μl的适当的肉汤中的测试样品的适当的样品储备溶液、抗生素标准品和载体对照)加入到板1至3上的第1列中的相关孔中。

8.向所有其他孔中加入100μl适当的无菌肉汤。

9.使用多通道移液管，从每个板上的第1列的孔中取样100μl样品和抗生素，并且转移到第2列的孔中，通过前后吸移5次充分混合。对移液管添加新的吸头，并且将100μl溶液从第2列的孔转移到第3列的孔中，通过前后吸移5次充分混合，并且然后弃去吸头。该过程一直持续到每个板上的第11列的孔。该过程导致连续双倍稀释，其范围对于样品为从5mg/ml至0.005mg/ml，并且对于抗生素标准品为100μg/ml至0.098μg/ml。每行的第12个和最后一个孔(板1至3)包含仅含有接种体的肉汤和仅没有接种体的肉汤(板4)的孔。这些孔分别用作无菌对照空白和无测试物质对照空白。

10.板4上的孔A1-12，B1-12，C1-12，D1-12，E1-12，F1-12，G1-12和H1-12仅含有肉汤，并且未接种有种菌培养物。这些孔对于每行用作无菌对照和空白。孔A12-F12(板1-2)和孔A12-C12(板3)含有细胞并且用作阴性对照。

11.如下面的板布局所示，向每个孔中加入100μl接种体或肉汤。添加接种体或肉汤使每个孔中的提取物浓度减半，得到对于样品(包括载体对照)的为从2.5mg/ml至0.0025mg/ml的最终孔浓度，以及对于抗生素标准品为50μg/ml至0.049μg/ml的最终孔浓度。

12.轻轻敲打板以确保接种体与样品溶液均匀混合。

13.使用Versamax微滴定板读数器读取每个孔的OD_650nm。这被记录为零时间读数。

14.然后将板与一个或多个厌氧袋一起置于密封容器中。然后将密封容器在37℃下温育。

15.3小时后，从容器中取出板，并且立即在板读数器中读取每个孔的OD_650nm，每次一个板。然后将板与新的厌氧袋一起放回容器中，并且将板在37℃下温育。

16.在开始研究后16小时，重复步骤15。

17.24小时后，测量每个孔的OD_650nm。

18.一旦读取板的OD_650nm后，记录与在时间零点的初始读数相比OD_650nm没有可检测变化的含有每个样品的最高稀释度(测试提取物的最低浓度)的孔。

表6列出了厌氧种类和好氧种类的测试结果。

表6：MIC值@3hrs(mg/ml)

MIC值@48hrs(mg/ml)

^*1.0＝无选择性

^**相对于唾液链球菌(S.salivarius)和缓症链球菌(S.mitis)

已经仅通过实施例的方式描述了本发明的方面，并且应当理解，在不脱离其范围的情况下，可以对其进行修改和添加。

Claims

1.包括从乳中分离的阳离子级分中的蛋白质的组合物在制备药物中的用途，所述阳离子级分中的蛋白质的组合物包括乳过氧化物酶、静止素、木菠萝素类蛋白质、几丁质酶样蛋白质、血管生成素和乳铁蛋白，所述药物用于通过选择性地抑制至少一种致病性微生物的生长或杀死至少一种致病性微生物而没有对至少一种共生微生物产生相当的抑制来预防或治疗致病性微生物感染病症或疾病，所述阳离子级分中的蛋白质具有等于或超过6.8的等电点，其中所述致病性微生物选自须癣毛癣菌，红色毛癣菌，化脓性链球菌和变形链球菌，其中所述共生微生物选自：表皮葡萄球菌，肺炎链球菌，人葡萄球菌，保加利亚乳杆菌，干酪乳杆菌，牙龈卟啉单胞菌，缓症链球菌和唾液链球菌。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于外部施用。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物用于内部施用。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述致病性微生物选自：化脓性链球菌和变形链球菌。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包括选自底物；佐剂；

益生元；和/或益生菌的一种或多种组分。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包括选自过氧化物酶底物；过氧化氢或过氧化氢源；和能够完全或部分裂解细胞壁的细胞裂解物质的一种或多种组分。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包括选自硫氰酸盐，抗坏血酸盐，葡萄糖氧化酶，葡萄糖和甘油单月桂酯的一种或多种组分。

8.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物对至少一种致病性微生物生长的选择性地抑制是对至少一种共生微生物的抑制程度的至少1.1倍。

9.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物对至少一种致病性微生物生长的选择性地抑制是对至少一种共生微生物的抑制程度的至少2倍。