CN109053878A - 一种胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胶原蛋白的制备方法，属于生物科技技术领域。本发明首先通过球磨对鱼鳞的内部结构进行破坏，并且在球磨过程中加入混合溶剂，通过混合溶剂对鱼鳞内部的羟基磷灰石进行软化处理，随后再将其进行蒸汽爆破处理，利用蒸汽爆破处理可以将鱼鳞内部纤维板层结构破坏，内部的羟基磷石灰层破裂，再利用混合酸进行处理，可以有效的进入至鱼鳞内部，对羟基磷石灰进行消除，并且混合酸中的腐殖酸将游离的的钙进行进一步的吸附去除，接着将其与固定化酶进行混合酶解，由于以活性炭作为载体，可以有效的进行吸附杂质及脱色处理，进一步的加强了酶解效果，同时提高了胶原蛋白的纯度，最后通过菌的作用达到进一步的提取、提纯的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白的制备方法，属于生物科技技术领域。
背景技术
胶原蛋白是一种高分子功能性蛋白质。它是皮肤的主要组成部分，占皮肤真皮层80％的比重。它在皮肤中构成了一张细密的弹力网，牢固锁住水分，支撑着皮肤。胶原蛋白是由3条肽链拧成螺旋纤维状蛋白质，也是人体内含量最丰富的蛋白质，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质及肌腔、韧带、巩膜等部位，大约占人体总蛋白质的30％及以上。它富含人体需要的脯氨酸、羟脯氨酸等胶原蛋白特征氨基酸，是人体细胞特别是肌肤细胞外基质中重要组成部分，所以胶原蛋白也是在发达国家美容界流行最久的美容保健品。现有的胶原蛋白的制备原料主要来源于陆生动物的骨骼和皮。随着物价的上涨，近年来为了追求动物能够快速成长，动物饲料的化学添加剂越来越多，导致陆生动物的骨骼和皮蛋白肽含量大大降低，而且受到化学添加剂的污染严重，致使肽原蛋白的来源受到极大的影响。
鱼鳞，通常都将它刮下来当废物扔掉。其实，鱼鳞含有丰富的蛋白质、脂肪和多种维生素，还有铁、锌、钙和多种人体必需的微量元素，以及胶质。近年来，海水鱼加工业随着我国海洋鱼类产量的增长而得到了较快的发展，鱼品加工也越来越广泛。但是，许多海水鱼加工过程仅局限于对鱼体肌肉的利用，而对鱼鳞等废弃物的加工利用甚少。在淡水鱼数量废弃物鱼鳞也有相当大部分的比例。若能合理利用，可有效减少环境污染，又可提高企业效益，因此加大对鱼鳞含有物质的利用，具有非常重大的意义。
现有的鱼鳞胶原蛋白提取方法通常为简单的酸碱或是蒸煮处理，但是鱼鳞中羟基磷灰石、蛋白质与其他物质之间已经形成网状结构，简单的酸碱处理并不能除去羟基磷灰石等其他物质，直接导致蛋白纯度低，影响产品质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：针对目前胶原蛋白提取方法易导致蛋白纯度低的问题，本发明提供了一种胶原蛋白的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
一种胶原蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）将鱼鳞进行干燥，粉碎，收集粉碎物，将粉碎物与混合溶剂按质量比4～6:2放入球磨机中进行球磨，收集球磨物；
（2）将球磨物放入蒸汽爆破装置中进行蒸汽爆破，收集爆破物，过滤，收集滤渣，将滤渣、混合酸按质量比1:2～4混合均匀，超声震荡，静置，过滤，收集滤饼，洗涤，干燥，粉碎，过筛，收集过筛颗粒；
（3）将过筛颗粒、固定化酶及水按质量比4～6:2:8～11，混合均匀，调节pH至4.0～4.5，搅拌酶解，过滤，收集滤液；
（4）按质量比4:0.1～0.3:0.2，将滤液、酵母菌、曲霉混合发酵，收集发酵混合物，将发酵混合物与水按质量比1:4～7进行混合加热，过滤，收集过滤液，冷冻干燥，即得胶原蛋白。
所述步骤（1）中混合溶剂为将乙醇、丙酮按体积比5:1～3混合而成。
所述步骤（2）中蒸汽爆破的条件为2.6～2.9MPa，维持压力30～40s。
所述步骤（2）中混合酸的配制为将柠檬酸、腐殖酸及水按质量比3～6:2:16～18混合而成。
所述步骤（2）中洗涤溶剂为丙酮、乙二醇、乙醇溶液中的任意一种。
所述步骤（3）中固定化酶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、水及活性炭按质量比1:20:4～6混合，再加入混合酶，搅拌，加入活性炭质量2～4％的京尼平，搅拌，静置，冷冻干燥，即得固定化酶。
所述混合酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶按质量比1:1～3混合而成；混合酶加入量为活性炭质量的10～15％。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
本发明首先通过球磨对鱼鳞的内部结构进行破坏，并且在球磨过程中加入混合溶剂，通过混合溶剂对鱼鳞内部的羟基磷灰石进行软化处理，随后再将其进行蒸汽爆破处理，利用蒸汽爆破处理可以将鱼鳞内部纤维板层结构破坏，内部的羟基磷石灰层破裂，再利用混合酸进行处理，可以有效的进入至鱼鳞内部，对羟基磷石灰进行消除，并且混合酸中的腐殖酸将游离的的钙进行进一步的吸附去除，接着将其与固定化酶进行混合酶解，由于以活性炭作为载体，可以有效的进行吸附杂质及脱色处理，进一步的加强了酶解效果，同时提高了胶原蛋白的纯度，最后通过菌的作用达到进一步的提取、提纯的效果。
具体实施方式
混合溶剂为将乙醇、丙酮按体积比5:1～3混合而成；
混合酸的配制为将柠檬酸、腐殖酸及水按质量比3～6:2:16～18混合而成；
洗涤溶剂为丙酮、乙二醇、乙醇溶液中的任意一种；
固定化酶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、水及活性炭按质量比1:20:4～6混合，再加入混合酶，搅拌，加入活性炭质量2～4％的京尼平，搅拌，静置，冷冻干燥，即得固定化酶；
所述混合酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶按质量比1:1～3混合而成；混合酶加入量为活性炭质量的10～15％；
一种胶原蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）将鱼鳞在50℃下进行干燥20min，以500r/min粉碎10min，收集粉碎物，将粉碎物与混合溶剂按质量比4～6:2放入球磨机中以600r/min进行球磨15min，收集球磨物；
（2）将球磨物放入蒸汽爆破装置中进行蒸汽爆破，蒸汽爆破的条件为2.6～2.9MPa，维持压力30～40s，收集爆破物，过滤，收集滤渣，将滤渣、混合酸按质量比1:2～4混合均匀，超声震荡20min，静置2h，过滤，收集滤饼，洗涤，干燥，粉碎，过300目筛，收集过筛颗粒；
（3）将过筛颗粒、固定化酶及水按质量比4～6:2:8～11，混合均匀，调节pH至4.0～4.5，搅拌酶解3h，过滤，收集滤液；
（4）按质量比4:0.1～0.3:0.2，将滤液、酵母菌、曲霉在36～39℃混合发酵1～2天，收集发酵混合物，将发酵混合物与水按质量比1:4～7，在80～90℃下进行混合加热4h，过滤，收集过滤液，冷冻干燥，即得胶原蛋白。
实施例1
混合溶剂为将乙醇、丙酮按体积比5:3混合而成；
混合酸的配制为将柠檬酸、腐殖酸及水按质量比6:2:18混合而成；
洗涤溶剂为乙二醇；
固定化酶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、水及活性炭按质量比1:20:6混合，再加入混合酶，搅拌，加入活性炭质量4％的京尼平，搅拌，静置，冷冻干燥，即得固定化酶；
混合酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶按质量比1:3混合而成；混合酶加入量为活性炭质量的15％；
一种胶原蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）将鱼鳞在50℃下进行干燥20min，以500r/min粉碎10min，收集粉碎物，将粉碎物与混合溶剂按质量比6:2放入球磨机中以600r/min进行球磨15min，收集球磨物；
（2）将球磨物放入蒸汽爆破装置中进行蒸汽爆破，蒸汽爆破的条件为2.9MPa，维持压力40s，收集爆破物，过滤，收集滤渣，将滤渣、混合酸按质量比1:4混合均匀，超声震荡20min，静置2h，过滤，收集滤饼，洗涤，干燥，粉碎，过300目筛，收集过筛颗粒；
（3）将过筛颗粒、固定化酶及水按质量比6:2:11，混合均匀，调节pH至4.5，搅拌酶解3h，过滤，收集滤液；
（4）按质量比4:0.3:0.2，将滤液、酵母菌、曲霉在39℃混合发酵2天，收集发酵混合物，将发酵混合物与水按质量比1:7，在90℃下进行混合加热4h，过滤，收集过滤液，冷冻干燥，即得胶原蛋白。
实施例2
混合溶剂为将乙醇、丙酮按体积比5:2混合而成；
混合酸的配制为将柠檬酸、腐殖酸及水按质量比5:2:17混合而成；
洗涤溶剂为1.2mol/L乙醇溶液；
固定化酶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、水及活性炭按质量比1:20:5混合，再加入混合酶，搅拌，加入活性炭质量3％的京尼平，搅拌，静置，冷冻干燥，即得固定化酶；
所述混合酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶按质量比1:2混合而成；混合酶加入量为活性炭质量的13％；
一种胶原蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）将鱼鳞在50℃下进行干燥20min，以500r/min粉碎10min，收集粉碎物，将粉碎物与混合溶剂按质量比5:2放入球磨机中以600r/min进行球磨15min，收集球磨物；
（2）将球磨物放入蒸汽爆破装置中进行蒸汽爆破，蒸汽爆破的条件为2.8MPa，维持压力35s，收集爆破物，过滤，收集滤渣，将滤渣、混合酸按质量比1:3混合均匀，超声震荡20min，静置2h，过滤，收集滤饼，洗涤，干燥，粉碎，过300目筛，收集过筛颗粒；
（3）将过筛颗粒、固定化酶及水按质量比5:2:9，混合均匀，调节pH至4.0，搅拌酶解3h，过滤，收集滤液；
（4）按质量比4:0.2:0.2，将滤液、酵母菌、曲霉在38℃混合发酵1.5天，收集发酵混合物，将发酵混合物与水按质量比1:6，在85℃下进行混合加热4h，过滤，收集过滤液，冷冻干燥，即得胶原蛋白。
实施例3
混合溶剂为将乙醇、丙酮按体积比5:1混合而成；
混合酸的配制为将柠檬酸、腐殖酸及水按质量比3:2:16混合而成；
洗涤溶剂为丙酮；
固定化酶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、水及活性炭按质量比1:20:4混合，再加入混合酶，搅拌，加入活性炭质量2％的京尼平，搅拌，静置，冷冻干燥，即得固定化酶；
所述混合酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶按质量比1:1混合而成；混合酶加入量为活性炭质量的10％；
一种胶原蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
（1）将鱼鳞在50℃下进行干燥20min，以500r/min粉碎10min，收集粉碎物，将粉碎物与混合溶剂按质量比4:2放入球磨机中以600r/min进行球磨15min，收集球磨物；
（2）将球磨物放入蒸汽爆破装置中进行蒸汽爆破，蒸汽爆破的条件为2.6MPa，维持压力30s，收集爆破物，过滤，收集滤渣，将滤渣、混合酸按质量比1:2混合均匀，超声震荡20min，静置2h，过滤，收集滤饼，洗涤，干燥，粉碎，过300目筛，收集过筛颗粒；
（3）将过筛颗粒、固定化酶及水按质量比4:2:8，混合均匀，调节pH至4.0，搅拌酶解3h，过滤，收集滤液；
（4）按质量比4:0.1:0.2，将滤液、酵母菌、曲霉在36℃混合发酵1天，收集发酵混合物，将发酵混合物与水按质量比1:4，在80℃下进行混合加热4h，过滤，收集过滤液，冷冻干燥，即得胶原蛋白。
对比例1
与实施例2基本相同，唯独不同的是步骤（3）缺少固定化酶，而是直接加入胃蛋白酶、胰蛋白酶按质量比1:1混合而成的混合酶，加入量与固定化酶加入量相等。
对比例2
与实施例2基本相同，唯独不同的是缺少步骤（2）中的蒸汽爆破处理。
对比例3
与对比例1基本相同，唯独不同的是缺少步骤（2）中的蒸汽爆破处理。
对比例4
传统的酸碱或是蒸煮处理，制备的胶原蛋白。
将实施例1～3和对比例1～4制备的胶原蛋白进行检测，检测方法为：冷冻干燥后用于UV、SDS-PAGE、氨基酸组成分析，并计算得率与纯度。得率= m /M ×100% （m为冷冻干燥所得胶原蛋白的质量/mg；M 为鱼鳞质量 /mg），纯度通过测定冷冻干燥所得胶原蛋白中羟脯氨酸含量计算。检测结果如表1。
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | |
| 得率（％） | 60.3 | 65.6 | 62.3 | 46.2 | 47.2 | 23.4 | 38.9 |
| 纯度（％） | 98.22 | 99.01 | 98.76 | 92.36 | 94.68 | 88.23 | 93.56 |
综上可得，本发明制备的胶原蛋白具有较好的提取率和纯度。
Claims (7)
1.一种胶原蛋白的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
（1）将鱼鳞进行干燥，粉碎，收集粉碎物，将粉碎物与混合溶剂按质量比4～6:2放入球磨机中进行球磨，收集球磨物；
（2）将球磨物放入蒸汽爆破装置中进行蒸汽爆破，收集爆破物，过滤，收集滤渣，将滤渣、混合酸按质量比1:2～4混合均匀，超声震荡，静置，过滤，收集滤饼，洗涤，干燥，粉碎，过筛，收集过筛颗粒；
（3）将过筛颗粒、固定化酶及水按质量比4～6:2:8～11，混合均匀，调节pH至4.0～4.5，搅拌酶解，过滤，收集滤液；
（4）按质量比4:0.1～0.3:0.2，将滤液、酵母菌、曲霉混合发酵，收集发酵混合物，将发酵混合物与水按质量比1:4～7进行混合加热，过滤，收集过滤液，冷冻干燥，即得胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中混合溶剂为将乙醇、丙酮按体积比5:1～3混合而成。
3.根据权利要求1所述胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中蒸汽爆破的条件为2.6～2.9MPa，维持压力30～40s。
4.根据权利要求1所述胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中混合酸的配制为将柠檬酸、腐殖酸及水按质量比3～6:2:16～18混合而成。
5.根据权利要求1所述胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中洗涤溶剂为丙酮、乙二醇、乙醇溶液中的任意一种。
6.根据权利要求1所述胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中固定化酶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、水及活性炭按质量比1:20:4～6混合，再加入混合酶，搅拌，加入活性炭质量2～4％的京尼平，搅拌，静置，冷冻干燥，即得固定化酶。
7.根据权利要求6所述胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述混合酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶按质量比1:1～3混合而成；混合酶加入量为活性炭质量的10～15％。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111808903A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-10-23 | 浙江工业大学 | 一种安全高效新型蛋白抗冻剂及其制备方法和应用 |
| CN120818583A (zh) * | 2025-09-17 | 2025-10-21 | 仙乐健康科技股份有限公司 | 促进骨骼纵生长的帝王鲑骨胶原蛋白肽及制备方法和应用 |
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