[go: up one dir, main page]

CN109055426B - 一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法 - Google Patents

一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109055426B
CN109055426B CN201810886140.1A CN201810886140A CN109055426B CN 109055426 B CN109055426 B CN 109055426B CN 201810886140 A CN201810886140 A CN 201810886140A CN 109055426 B CN109055426 B CN 109055426B
Authority
CN
China
Prior art keywords
thr
pro
culture
lys
lubricin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810886140.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109055426A (zh
Inventor
诸葛鑫
马丽强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhixiang Biology (Suzhou) Co.,Ltd.
Original Assignee
Zhixiang Biology Suzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhixiang Biology Suzhou Co ltd filed Critical Zhixiang Biology Suzhou Co ltd
Priority to CN201810886140.1A priority Critical patent/CN109055426B/zh
Publication of CN109055426A publication Critical patent/CN109055426A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109055426B publication Critical patent/CN109055426B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法，属于生物技术领域。本发明方法包括：1)构建含有类人润滑素目的基因的重组CHO细胞株，2)一级种子培养，3)二级种子培养，4)反应器连续流加培养，5)收集上清进行纯化。通过本发明提供的在CHO细胞中表达纯化rh‑Lubricin的方法，该方法工艺简单，可以规模化生产，有广阔的应用前景。

Description

一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法
技术领域
本发明涉及一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法，属于生物技术领域。
背景技术
类人润滑素(Lubricin)一种具有软骨保护作用的黏液糖蛋白，由滑膜细胞及关节软骨浅表区的软骨细胞合成，这种由蛋白聚糖4(PRG4)基因编码的表面润滑蛋白又叫做润华素、巨核细胞刺激因子(MSF)或浅表层蛋白(SZP)。润华素是从PRG4基因表达的，全长跨12个外显子，但是也有报道过多种天然发生的截短的版本。940个氨基酸的大的“类黏液素”中央结构域(有外显子6编码)，包含一些70+类KEPAPTT序列并且是重度糖基化的。所述糖蛋白包含II型核心糖基化残基和多样性I型核心聚糖(O-连接β(1-3)Gal-GalNAc寡糖)，其中至少后者已经显示出介导其主要的生理学功能，界面润滑。PRG4已被显示出有助于对接的关节软骨表面的界面润滑，PRG4已被显示出不仅仅作为单体存在还可作为二聚体和多聚体(通过N-末端和C-末端处保守的富半胱氨酸结构域的二硫键)。
在滑膜关节的软骨交界面，有至少两种润滑的物理化学模式在起作用。这些被分类为“流体薄膜”和“界面”。运作的润滑模式取决于关节连接组织上的正向力和切向力，取决于这些表面之间切向运动的相对速率，以及取决于载荷和运动随着时间的变化。摩擦系数μ(无量纲单位，相对运动中的两个表面之间所测量的摩擦力与所应用的正向力的比率)，提供了润滑的定量量度。
被认为造成滑液出色润滑性质的两种机械成分是润滑素和透明质酸(HA)。润滑素已经被显示出在关节连接滑膜关节中作为界面润滑剂以及用于保护软骨的表面以防摩擦力、细胞黏连和蛋白沉积。例如，美国专利号6，960，562和6，743，774公开了包含基本纯的PRG4同种型的通过全身性或者直接施用至组织润滑滑膜关节或者其它组织的方法。HA本身已经被显示出在界面模式润滑下于软骨-软骨界面处相对于盐水而言降低μ，而仅有润滑素将μ降低至更低的水平，但是包含HA以及润滑素的滑液可以将仅有润滑素或者HA与润滑素的合成混合物所不能实现的摩擦系数赋予给界面表面，尚未有润滑素与HA的合成混合物能够完全复制天然形式的滑液所赋予的低摩擦系数。
类人润滑素(Lubricin)是关节软骨表层的特异性标志，最早发现存在于人体膝软骨、眼球表面以及多处组织，被认为是滑液的主要成分之一，是人体内最重要的润滑及抗黏连成分之一，对于保持人体的正常生理功能有至关重要的作用。随着患者年龄的增大或体外实验中细胞培养周期的延长，软骨细胞分泌Lubricin的能力显著降低。由于损伤、疾病以及老化导致的炎症会影响到人体正常水平Lubricin的产生，重组Lubricin的补充疗法可以消除表面摩擦，修损表面功能，特别适合开发用于干眼症、骨关节炎的治疗。
骨关节炎是一种最常见的关节炎形式，这一痛苦的关节疾病可导致日常活动和生活质量受到严重影响。它可引起关节疼痛、肿胀、活动减少。尽管它可以发生于任何关节，其主要常见于手、膝、臀部和脊柱。根据美国疾病控制和预防中心的统计，骨关节炎从人45岁开始患病率增加，在美国导致2700万处于肥胖、衰老、关节损伤/创伤等风险因子中的成人受累。缺乏或突变Lubricin，会导致浅表区软骨细胞消失及滑膜细胞增生，造成关节内摩擦力增高和关节过早磨损，即便是存在高水平的对关节起缓冲作用的粘性流体透明质酸存在的情况下，也会导致软骨细胞死亡。而以Lubricin进行关节内治疗可取得明显效果，能够有效抑制
但，目前，在适于商业拓展的规模上，还没有成功生产重组全长润滑素还没有取得成功，产量只能达到每升个位或者十位数毫克。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产重组类人润滑素的方法。
本发明首先提供了一种表达生产重组类人润滑素(rh-Lubricin)的重组CHO细胞株，是将来源于人的rh-Lubricin基因连接到表达载体pCHO1.0，转化CHO细胞株，经筛选达到分泌表达rh-Lubricin的工程细胞株。
在本发明的一种实施方式中，所述重组类人润滑素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了应用所述重组CHO细胞表达生产重组类人润滑素的方法，所述方法是用基础培养基将二级种子细胞按(0.6±0.1)×106个/ml的接种密度稀释至3L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；设置搅拌转速为200～250r/min；pH设置为6.8～7.2，关联碳酸氢钠溶液和CO2以调节pH；溶解氧设置为20～60％；前期培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至32～34℃；培养第14天收获。
进一步地，在培养的第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。
进一步地，用于培养种子的种子培养基为：CD FortiCHO 24.4g/L，葡聚糖硫酸酯钠盐0.05g/L，MTX 1.0mmol/L。
进一步地，基础培养基为：ActiCHO Pro 22.2g/L，5mmol/L氢氧化钠7.56g/L，碳酸氢钠1.79g/L，聚糖硫酸酯钠盐0.05g/L。
进一步地，补料培养基A为：Cell Boost 7a 170.0g/L，5mmol/L氢氧化钠20.5g/L。
进一步地，补料培养基B为：Cell Boost 7b 90.1g/L，5mmol/L氢氧化钠179g/L。
进一步地，在培养的第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基A、补料培养基B、酪氨酸和酵母水解物，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，酪氨酸的添加量为5g/L、酵母水解物的添加量为16g/L；葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。
进一步地，所述一级种子的制备方法是：用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.3±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中，摇瓶置于二氧化碳摇床：36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min，每次扩增培养3±1天，活细胞密度不超过6.0×106个/ml，扩增三次。
进一步地，所述二级种子的制备方法是：用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级细胞按0.3±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中扩增培养，摇瓶置于二氧化碳摇床：36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增两次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×106个/ml。
本发明还提供了从CHO细胞表达生产重组类人润滑素的培养液中亲和纯化类人润滑素的方法，培养液进行澄清过滤后，澄清过滤液(每100mL)用含有5mL 200mM Tris，40mMMgCl2，pH 8.2的溶液与400units核酸酶混匀后去除多聚核苷酸。室温下混匀4h后，加入37.8g尿素调整尿素浓度至6M，加入1N NaOH调整pH值为11，并加入0.01％吐温20至终体积120mL。处理后的溶液用GE Q Big BeadsTM阴离子交换柱进行亲和纯化。柱子使用前用0.1NNaOH冲洗后，用100mM NaPO4，1.5M NaCl，pH 7.2的溶液进行再次冲洗，前平衡液为200mMTris-Borate，6M尿素，pH 10。柱体积为30mL，上样体积120mL，流速为20ml/min。平衡液为100mM Tris-Borate，100mM NaCl，6M尿素，0.01％吐温20，pH 7.2。然后用0.1N NaOH和1MNaCl进行洗脱收集目的蛋白。
本发明的有益效果：
本发明提供的重组类人润滑素在CHO细胞中的表达、流加培养和纯化方法，在3L反应器水平上可使目的蛋白浓度达到0.73g/L，进一步优化培养基，表达量可以达到1.88g/L，纯化后重组类人润滑素的纯度达到98.2％。本发明提供的制备方法简单、便于使用，具有很好地应用前景。
附图说明
图1rh-Lubricin表达过程中活细胞数变化曲线
图2rh-Lubricin表达过程中细胞活率变化曲线
图3rh-Lubricin表达过程中蛋白产量曲线
具体实施方式
种子培养基：CD FortiCHO 24.4g/L，葡聚糖硫酸酯钠盐0.05g/L，MTX 1.0mmol/L；
基础培养基：ActiCHO Pro 22.2g/L，5mmol/L氢氧化钠7.56g/L，碳酸氢钠1.79g/L，聚糖硫酸酯钠盐0.05g/L；
补料培养基A：Cell Boost 7a 170.0g/L；
补料培养基B：Cell Boost 7b 90.1g/L。
CD FortiCHO购自Gibco，ActiCHO Pro、Cell Boost 7a、Cell Boost 7b购自GE，其他试剂均购自Sigma。
实施例1重组细胞株的构建
利用常规的DNA重组技术将rh-Lubricin基因正确置于CHO细胞表达载体pCHO 1.0(Thermo)，转化CHO-S细胞，经筛选建立分泌表达rh-Lubricin的重组细胞株。参考书有《分子克隆技术指南》、《分子生物学指南》、《动物细胞培养》。
实施例2重组细胞株的复苏
将种子培养基放置水浴锅中，37±0.5℃预热20min以上，取一支工作库细胞，37±0.5℃水浴速融，控制融解时间120±30s内，将细胞移入8.5ml种子培养基的15ml离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，用5ml的种子培养基重悬细胞并转移到125ml摇瓶内，补充体积至30±5ml，混合均匀后取0.5ml计数，后置于36.5±0.5℃、6±1％CO2、130rpm的摇床中培养3±1天。
实施例3一级种子的制备
用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.3±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中，混匀后取样0.5ml细胞液用于计数。摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min，扩增培养3±1天，活细胞密度不超过6.0×106个/ml，扩增3次。
实施例4二级种子的制备
用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.3±0.1×106个/ml的密度稀释至新摇瓶中，混匀后取样0.5ml细胞液用于计数。摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO2，130r/min，扩增培养3±1天，活细胞密度不超过6.0×106个/ml，扩增2次。
实施例5反应器连续流加培养
用基础培养基将二级种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释至3L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；设置搅拌转速为250r/min；pH设置为7.00，DeadBand设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液(NaHCO3 90.7g/L)和CO2进行调节；溶解氧设置为40％(溶氧饱和时的溶解氧设定为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；培养第14天收获。
第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。细胞培养的密度曲线如图1所示，培养过程中的细胞活力如图2所示。如图3所示，最终培养上清液中类人润滑素蛋白含量达到0.73g/L。
进一步地，对补料培养基进行优化，每次在补加补料培养基A和补料培养基B的同时，添加酪氨酸、胱氨酸和酵母水解物。如表1所示，添加酪氨酸和酵母水解物均能大幅提高产量，添加胱氨酸对产量的提高作用不显著。添加终浓度为5g/L的酪氨酸、终浓度为16g/L的酵母水解物，能够将表达量提高到1.64g/L，比原产量0.73g/L提高了124％。
表1
序号 酪氨酸(g/L) 胱氨酸(g/L) 酵母水解物(g/L) 表达量(g/L)
1 0 0 0 0.73
2 0 0 16 1.2
3 0 5 0 0.82
4 0 5 16 1.33
5 5 0 0 0.91
6 5 0 16 1.64
7 5 5 0 1.02
8 5 5 16 1.88
9 2.5 2.5 8 1.28
10 2.5 2.5 8 1.31
11 2.5 2.5 8 1.30
实施例6培养液澄清纯化
采用实施例5优化后的添加5g/L酪氨酸、16g/L酵母水解物的方法培养制备重组类人润滑素，将培养液进行澄清过滤后，澄清过滤液(每100mL)用含有5mL 200mM Tris，40mMMgCl2，pH 8.2的溶液与400units核酸酶混匀后去除多聚核苷酸。室温下混匀4h后，加入37.8g尿素调整尿素浓度至6M，加入1N NaOH调整pH值为11，并加入0.01％吐温20至终体积120mL。处理后的溶液用GE Q Big BeadsTM阴离子交换柱进行亲和纯化。柱子使用前用0.1NNaOH冲洗后，用100mM NaPO4，1.5M NaCl，pH 7.2的溶液进行再次冲洗，前平衡液为200mMTris-Borate，6M尿素，pH 10。柱体积为30mL，上样体积120mL，流速为20ml/min。平衡液为100mM Tris-Borate，100mM NaCl，6M尿素，0.01％吐温20，pH 7.2。然后用0.1N NaOH和1MNaCl进行洗脱收集目的蛋白。
纯化后的目的蛋白采用SEC-HPLC(Waters E2695)分析，色谱柱为Tosh TSKgelG3000SWXL，流动相为100mM的磷酸盐缓冲液，pH 7.5，流速0.5ml/min，进样量50μl，检测波长280nm。检测结果表明纯化后蛋白纯度达到98.2％。
对比例1反应器连续流加培养
用基础培养基将二级种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释至3L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；设置搅拌转速为250r/min；pH设置为7.00，DeadBand设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液和CO2进行调节；溶解氧设置为40％(溶氧饱和时的溶解氧设定为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；培养第14天收获。
第3、5、7、9、11天进行补料，补加补料培养基A、酪氨酸和酵母水解物，不补加补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，酪氨酸的添加量为5g/L、酵母水解物的添加量为16g/L；每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。最终培养上清液中类人润滑素蛋白含量达到1.27g/L。
对比例2反应器连续流加培养
用基础培养基将二级种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释至3L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；设置搅拌转速为250r/min；pH设置为7.00，DeadBand设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液和CO2进行调节；溶解氧设置为40％(溶氧饱和时的溶解氧设定为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；培养第14天收获。
第3、5、7、9、11天进行补料，补加补料培养基B、酪氨酸和酵母水解物，不补加补料培养基A，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，酪氨酸的添加量为5g/L、酵母水解物的添加量为16g/L；每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。最终培养上清液中类人润滑素蛋白含量达到0.93g/L。
对比例3反应器连续流加培养
用基础培养基将二级种子细胞按0.6×106个/ml的接种密度稀释至3L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L；设置搅拌转速为250r/min；pH设置为7.00，DeadBand设置为0.10，关联碳酸氢钠溶液和CO2进行调节；溶解氧设置为40％(溶氧饱和时的溶解氧设定为100％)，前期培养温度设置为36.5℃；培养第5天降温至32.0℃；培养第14天收获。
第3、5、7、9、11天进行补料，补加补料培养基A、补料培养基B、酪氨酸和酵母水解物，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的2％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，酪氨酸的添加量为5g/L、酵母水解物的添加量为16g/L；每天取样3mL检测活细胞密度、细胞活率和pH，如果检测样品当天发现葡萄糖浓度低于3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0g/L。最终培养上清液中类人润滑素蛋白含量达到1.39g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州迈缔姆生物技术有限公司
<120> 一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1404
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val
1 5 10 15
Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly
20 25 30
Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr
35 40 45
Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys
50 55 60
Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg
65 70 75 80
Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys
85 90 95
Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser
100 105 110
Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr
115 120 125
Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys
130 135 140
Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val
145 150 155 160
Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
165 170 175
Ser Thr Ile Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg
180 185 190
Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr
195 200 205
Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser
210 215 220
Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr
225 230 235 240
Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys
245 250 255
Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys
260 265 270
Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu
275 280 285
Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr
290 295 300
Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp
305 310 315 320
Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu
325 330 335
Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro
340 345 350
Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro
355 360 365
Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr
370 375 380
Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
385 390 395 400
Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
405 410 415
Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro
420 425 430
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro
435 440 445
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro
450 455 460
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
465 470 475 480
Glu Pro Ala Pro Thr Ala Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
485 490 495
Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys
500 505 510
Glu Pro Ser Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys
515 520 525
Ser Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser
530 535 540
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ser Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro
545 550 555 560
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro
565 570 575
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
580 585 590
Ala Pro Thr Thr Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
595 600 605
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Leu
610 615 620
Thr Pro Thr Thr Pro Glu Lys Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Lys Pro
625 630 635 640
Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro
645 650 655
Thr Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Ala Ala
660 665 670
Ala Pro Asn Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
675 680 685
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr
690 695 700
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys Glu Leu Ala Pro Thr
725 730 735
Thr Thr Lys Glu Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp Lys Pro Ala Pro Thr
740 745 750
Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr
755 760 765
Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr
770 775 780
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys
785 790 795 800
Glu Leu Ala Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp
805 810 815
Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys
820 825 830
Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu
835 840 845
Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys
850 855 860
Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu
865 870 875 880
Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro
885 890 895
Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr
900 905 910
Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro
915 920 925
Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr
930 935 940
Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val
945 950 955 960
Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr Leu
965 970 975
Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile
980 985 990
Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys
995 1000 1005
Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys
1010 1015 1020
Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys
1025 1030 1035
Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg
1040 1045 1050
Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile
1055 1060 1065
Ala Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro
1070 1075 1080
Asn Ser Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly
1085 1090 1095
Gly Ala Glu Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val
1100 1105 1110
Phe Met Pro Glu Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val
1115 1120 1125
Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr
1130 1135 1140
Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg
1145 1150 1155
Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val
1175 1180 1185
Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn
1190 1195 1200
Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr Trp Arg
1205 1210 1215
Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Phe
1220 1225 1230
Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser
1235 1240 1245
Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys
1250 1255 1260
Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val
1265 1270 1275
Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr
1280 1285 1290
Gly Glu Thr Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile
1295 1300 1305
Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala
1310 1315 1320
Arg Leu Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys
1325 1330 1335
Val Ser Ile Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala
1340 1345 1350
Ile Ser Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr
1355 1360 1365
Ala Phe Ser Lys Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg
1370 1375 1380
Thr Ala Arg Ala Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys
1385 1390 1395
Val Trp Tyr Asn Cys Pro
1400

Claims (2)

1.一种表达生产重组类人润滑素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将来源于人的编码类人润滑素的基因连接到表达载体pCHO1.0，转化CHO细胞株，经筛选得到分泌表达重组类人润滑素的工程细胞株，
2）一级种子培养，
3）二级种子培养，
4）连续流加培养，
5）收集培养上清，纯化重组类人润滑素；所述重组类人润滑素的氨基酸序列如 SEQ IDNO.1所示；
步骤4）是用基础培养基将二级种子细胞按（0.6±0.1）×106个/ml的接种密度稀释至3L 细胞培养反应器中，初始培养体积为1 L；设置搅拌转速为200~250 r/min；pH设置为6.8~7.2，关联碳酸氢钠溶液和CO2以调节pH；溶解氧设置为20~60%；1~4天的培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至32~34℃；培养至第14天，停止培养、收获目的物；
其中，在步骤4）的培养的第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基A、补料培养基B、酪氨酸和酵母水解物，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4%，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4%，酪氨酸的添加量为5 g/L，酵母水解物的添加量为16 g/L；补料培养基A为：Cell Boost 7a 170.0 g/L，5 mmol/L氢氧化钠 20.5 g/L；补料培养基B为：Cell Boost 7b 90.1 g/L，5 mmol/L氢氧化钠 179 g/L；
基础培养基为：ActiCHO Pro 22.2 g/L，5 mmol/L氢氧化钠 7.56 g/L，碳酸氢钠 1.79g/L，聚糖硫酸酯钠盐0.05 g/L；
在步骤4）的培养过程中，葡萄糖浓度低于3.0 g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0 g/L。
2.根据权利要求1所述的一种表达生产重组类人润滑素的方法，其特征在于，步骤5）是将培养液进行澄清过滤后，去除多聚核苷酸；然后，用GE Q Big BeadsTM阴离子交换柱进行亲和纯化。
CN201810886140.1A 2018-08-06 2018-08-06 一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法 Active CN109055426B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810886140.1A CN109055426B (zh) 2018-08-06 2018-08-06 一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810886140.1A CN109055426B (zh) 2018-08-06 2018-08-06 一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109055426A CN109055426A (zh) 2018-12-21
CN109055426B true CN109055426B (zh) 2021-06-25

Family

ID=64833025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810886140.1A Active CN109055426B (zh) 2018-08-06 2018-08-06 一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109055426B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113905753A (zh) 2019-01-15 2022-01-07 康奈尔大学 重组粘蛋白和组合物以及其使用方法
CN113122493A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 上海迈泰君奥生物技术有限公司 一种蛋白质的表达方法
AR121396A1 (es) * 2020-02-24 2022-06-01 Novartis Ag Purificación de polipéptidos producidos recombinantemente
CN113462648A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 成都彤琦恩生物科技有限公司 一种高效表达重组猫干扰素ω2突变体的哺乳动物细胞培养工艺

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014144A (zh) * 2012-03-13 2013-04-03 郑州牧业工程高等专科学校 检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法
CN105462909A (zh) * 2015-12-31 2016-04-06 哈药集团技术中心 一种高效表达人促卵泡激素的cho细胞的培养方法
CN105899527A (zh) * 2013-10-22 2016-08-24 卢布里斯有限责任公司 重组润滑素的制备
WO2017123934A1 (en) * 2016-01-13 2017-07-20 Merial, Inc. Recombinant aav vectors expressing osteoprotective genes, including has2 and lubricin, useful in the treatment of osteoarthritis and related joint conditions in mammals

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103014144A (zh) * 2012-03-13 2013-04-03 郑州牧业工程高等专科学校 检测猪链球菌2型的基因芯片的制备及其应用方法
CN105899527A (zh) * 2013-10-22 2016-08-24 卢布里斯有限责任公司 重组润滑素的制备
CN105462909A (zh) * 2015-12-31 2016-04-06 哈药集团技术中心 一种高效表达人促卵泡激素的cho细胞的培养方法
WO2017123934A1 (en) * 2016-01-13 2017-07-20 Merial, Inc. Recombinant aav vectors expressing osteoprotective genes, including has2 and lubricin, useful in the treatment of osteoarthritis and related joint conditions in mammals

Also Published As

Publication number Publication date
CN109055426A (zh) 2018-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109055426B (zh) 一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法
EP1789442B1 (en) Muteins of fibroblast growth factor 21
TW516962B (en) A human TNFR1-IgG1 preparation
EP2913059B1 (en) Novel method for treating spinal cord injury using hmgb1 fragment
EP2995626B1 (en) Bifunctional fusion proteins to inhibit angiogenesis in tumour microenvironment and to activate adaptive immune responses and the genes and uses thereof
US20240240147A1 (en) Chimeric antigen receptor-modified granulocyte-macrophage progenitors for cancer immunotherapy
JPS62174026A (ja) 白血球減少症治療剤
CN116535520A (zh) 一种细胞外基质蛋白融合蛋白及其制备方法和应用
JP3955352B2 (ja) 破骨細胞形成阻害剤
CN113717269B (zh) 一种重组的变体fgf21蛋白及其制备方法和应用
JPH09289896A (ja) 免疫担当細胞においてインターフェロン−γの産生を誘導する蛋白質
EP4089106B1 (en) New-type anti-metabolic-disorder fgf analogue and use thereof
EP0550769B1 (en) Use of hepatocyte growth factors for the manufacture of a hemopoietic stem cell augmenting agent
EP2341061A1 (en) A novel process for preparing G-CSF (granulocyte colony stimulating factor)
KR101858598B1 (ko) 인터페론 알파 5의 제조방법
JPS60221094A (ja) 発現ビヒクル
WO2005017174A2 (en) Process for the purification of recombinant polypeptides
CN108949870B (zh) 一种生产重组血小板源生长因子的方法
JPH09512165A (ja) インターロイキン１５
WO1999055863A1 (fr) Nouveau polypeptide, adnc le codant et son utilisation
CN1239516C (zh) 肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体胞外区突变多肽及其制法与用途
US10702547B2 (en) Compositions for treatment of arthritis
JP2589094B2 (ja) 抗悪性腫瘍剤
CN119285748A (zh) 一种重组丛集素及其应用
CN106754700A (zh) 一种抗肿瘤过继免疫活性细胞cik的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210204

Address after: 215000 No. 6 Anmin Road, Huangduo Town, Xiangcheng District, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant after: Zhixiang Biology (Suzhou) Co.,Ltd.

Address before: 215000 No. 6 Anmin Road, Huangduo Town, Xiangcheng District, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant before: SUZHOU MAIDIMU BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant