CN109045036B

CN109045036B - [1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN109045036B
Application number: CN201810797573.XA
Authority: CN
Inventors: 赵勇; 陈艳莲
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2038-07-19
Also published as: CN109045036A

Abstract

本发明公开了[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其能够有效抑制PDL1表达水平。

Description

[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤的发生与恶化是严重威胁人类生命健康的疾病。在我国，肿瘤的发病率、死亡率居高不下，且大部分患者就诊时间晚，肿瘤治疗手段又相对局限，导致恶性肿瘤对国民健康形成了重大威胁。因此，如何有效治疗并治愈肿瘤已成为现代生命科学中亟待突破的研究热点。

传统的肿瘤治疗方法主要包括外科手术、化学治疗和放射治疗，由于诊断及治疗手段的局限性，绝大部分肿瘤都无法简单通过这三种传统方法根治。越来越多的研究表明，在放、化疗过程中，辐射或药物的使用会造成大量DNA损伤，从而导致肿瘤细胞表面的程序性死亡配体-1(PD-L1)异常上调，进而抑制病人的免疫系统，最终导致病人出现对辐射或药物的耐受性。因此，如何在放、化疗过程中结合免疫治疗以控制PD-L1的水平，已成为肿瘤治疗中的一大关键。

PD-L1是细胞免疫应答过程中的共抑制分子，通过与程序性死亡受体-1(PD-1)结合对T细胞的免疫活性发挥抑制作用，帮助肿瘤进行免疫逃逸，导致肿瘤进一步恶化。因此，针对肿瘤特性和机体的免疫系统进行免疫治疗，在肿瘤治疗方法中显现着越来越重要的作用。近年来，肿瘤免疫治疗因其对晚期肿瘤具有显著疗效，受到了极大关注,并于2013年被Science杂志评为年度十大科技突破之首，为转移性晚期肿瘤治疗带来新的希望。

在免疫治疗方法中，利用免疫检查点阻滞剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体来阻断PD-1/PD-L1信号通路，在临床试验上(如治疗晚期NSCLC)已展现良好的疗效性和安全性，而且该疗法在其他肿瘤类型中也展现出良好前景。但在接受治疗的患者中，只有不足40％的病人能对单抗治疗产生应答，而低应答率的确切原因目前仍不得而知。此外，病人在治疗过程中常会出现免疫反应异常增强的情况，如出现过敏、发烧等免疫过激症状。因此，除了针对PD-L1的单抗治疗外，急需开发其他不同类别的癌症治疗药物。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够有效实现抗肿瘤效应的小分子药物。

为此，本发明提供了以下式(I)的[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用：

以上式(I)化合物为小分子药物，其全称为N-甲基-N-(3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪-6-基)苯基)乙酰胺，水溶性高，热稳定性良好，细胞毒性低。

式(I)化合物的合成路线如下：

根据本发明所述的应用，所述药物能应用于不同类型的肿瘤的治疗和/或预防，包括但不限于乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤或肺腺癌中的任意一种。

根据本发明所述的应用，所述药物能显著抑制肿瘤细胞的生长，以及实体瘤的增殖。

根据本发明所述的应用，所述药物能抑制肿瘤细胞表面的PD-L1水平。

根据本发明所述的应用，所述药物包括上述式(I)的化合物作为活性成分以及药学上可接受的载体。

应当理解的是，所述药物可制成适当的剂型，例如但不限于片剂、丸剂、胶囊剂、液体制剂如注射液等。

特别地，本发明还提供了上述式(I)的化合物在制备用于抑制肿瘤细胞的PD-L1表达水平的药物中的应用。优选地，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤或肺腺癌中的任意一种。

在本发明的另一方面，还提供了上述式(I)的化合物在制备用于抑制肿瘤细胞增殖并重新激活免疫系统的药物中的应用。优选地，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤或肺腺癌中的任意一种。

根据本发明所述的应用，所述药物能提高机体的免疫活性，包括但不限于提高肿瘤浸润T淋巴细胞中CD8+淋巴细胞的比例以及CD69+淋巴细胞的比例，抑制PD-1+CD8+淋巴细胞的比例。

附图说明

图1为CCK-8检测细胞增殖实验结果。

图2为流式细胞术检测细胞表面PD-L1蛋白水平的结果。

图3为荷瘤小鼠体重增长及实体瘤增长曲线。

图4为流式细胞术检测荷瘤小鼠中肿瘤浸润T淋巴细胞比例的结果。

具体实施方式

下面将结合一些具体实施例进一步清楚、完整地阐述本发明。在此说明，这里所描述的实施例仅是本发明中的部分实施例，而且以下所描述的实施例仅用于说明本发明，并不用于限制本发明的应用范围。

如未特别指出，本发明所使用的试剂、材料、仪器均可通过商购获得，常规操作步骤参数等均为本领域技术人员所知晓并可实施。

实施例1

式(I)化合物的结构与制备

本发明所称的式(I)化合物为[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物，其全称为N-甲基-N-(3-(3-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪-6-基)苯基)乙酰胺，分子式为C₁₅H₁₅N₅O；相对分子量为281.13，化学结构式如下：

式(I)化合物的合成路线如下：

式(I)化合物的具体合成步骤如下：

将起始原料1(购自J&K Chemical公司)(0.65g，3.40mmol)溶解在甲苯(40mL)中，加入3-甲基-4H-1,2,4-三唑-4-胺(购自J&K Chemical公司)(0.33g，3.36mmol)，反应通过迪安-斯达克分水器将混合物回流过夜(22小时)。冷却至室温后，向混合物中加入适量硅胶，旋干溶剂。使用MeOH/CH₂Cl₂(0-10％)进行快速柱层析，得到浅黄色固体化合物3(0.85g，92％)。

将化合物3(0.77g，2.84mmol)溶解在THF(四氢呋喃)(5mL)中，滴加叔丁氧基双(二甲基氨基)甲烷(购自J&K Chemical公司)(1.19mL，5.68mmol)。室温搅拌4.5小时后，向反应混合物中加入适量硅胶并旋干溶剂。使用MeOH/CH₂Cl₂(0-15％)进行快速柱层析，得到淡黄色固体化合物5(0.95g，定量)。

将化合物5(0.2g，0.61mmol)溶解在AcOH(3mL)回流(浴温140℃)过夜(20h)。冷却至室温后，向反应混合物中加入适量硅胶并真空旋干溶剂。使用MeOH/CH₂Cl₂(0-15％)进行快速柱层析，得到为浅黄色固体的CL285032(0.122g，71％)，即本发明所涉及的式(I)化合物。

经质谱和核磁共振分析化学结构。

实施例2

式(I)化合物的效果验证

1.实验材料

人类乳腺癌细胞株MCF-7、宫颈癌细胞株Hela、骨肉瘤细胞株U2OS、肺腺癌细胞株A549，以及小鼠乳腺癌细胞株TUBO均购自中国典型物种保藏中心(CTCC)。

雌性4-6周龄BALB/C小鼠购自中山大学动物实验中心。

2.实验方法

2.1CCK8检测细胞增殖实验：

将MCF-7、Hela、U2OS和A549细胞分别接种于96孔板中，接种密度为1×10⁴/孔，每种细胞接种4孔。等6小时待细胞贴壁后，小心撤去培养基，加入100μL含终浓度为68mg/L的式(I)化合物的培养基或等体积的含0.1％DMSO的培养基。培养基每48小时更换一次。72小时后终止培养，每孔加入10μL CCK8溶液，放回37℃细胞培养箱孵育1小时，随后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

细胞培养72小时后，4种细胞的增殖结果如图1所示。

实验结果表明，式(I)的化合物可以显著抑制多种类型肿瘤细胞(包括乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤和肺腺癌细胞)的增殖。

2.2流式细胞术检测PD-L1实验：

PD-L1是一种细胞膜表面蛋白，它通过与PD-1结合从而抑制T细胞的分化、增殖以及功能行使，因此，我们采用流式细胞术检测位于细胞膜表面的PD-L1分子。

将MCF-7、Hela、U2OS和A549细胞分别接种于6孔板中，接种密度为1×10⁵/孔。等6小时待细胞贴壁后，小心撤去培养基，加入2mL含终浓度为68mg/L的式(I)化合物的培养基或等体积的含0.1％DMSO的培养基。培养基48小时后更换一次，同时加入终浓度为10ng/mL的IFN-γ，以增强PD-L1的本底表达水平，便于检测。再经过24小时后终止培养，收集细胞并与APC标记的PD-L1抗体于冰上孵育30分钟，随后用流式细胞仪检测PD-L1的蛋白水平。实验数据用FlowJo软件进行处理分析。

如图2所示，经过72小时的式(I)化合物([1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物)处理后，4种细胞的表面PD-L1表达水平都得到了显著抑制。

2.3小鼠体重增长以及实体瘤增长实验

将5×10⁵个TUBO细胞接种于雌性4-6周龄BALB/C小鼠右前肢腋窝下第三对乳腺皮下。待小鼠成瘤后，把100μL含终浓度为68mg/L的式(I)化合物([1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物)的PBS或等体积的含0.1％DMSO的PBS通过尾静脉注射的方式注入小鼠体内。给药周期为12天，每两天进行一次尾静脉注射。在每次注射前，称量小鼠体重并测量肿瘤大小，记录小鼠体重变化曲线以及肿瘤增长曲线。其中，肿瘤体积按照公式“体积＝长×宽²/2”计算。

小鼠体重增长及实体瘤增长曲线如图3所示，接受式(I)化合物([1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物)注射的荷瘤小鼠体重与对照组相比并无显著差异，但肿瘤体积增长与对照组相比显著缓慢，最终的肿瘤体积也显著小于对照组，说明式(I)的化合物显著抑制实体瘤增长。

2.4小鼠肿瘤浸润T淋巴细胞检测实验：

淋巴细胞浸润到肿瘤中被认为是机体对于肿瘤的一种特异性免疫反应，通过检测肿瘤浸润T淋巴细胞的组成比例能反映药物激活机体免疫系统的效果。一般来说，肿瘤浸润淋巴细胞中，绝大多数细胞呈CD3阳性，其中又以CD8+ T细胞为主。但是肿瘤浸润CD8+ T细胞多高表达PD-1，表现为衰竭型T淋巴细胞，增殖能力减弱，免疫细胞功能发生障碍。

最后一次小鼠给药24小时后，用颈椎脱臼法处死小鼠并分离肿瘤。用胶原酶和DNA酶把肿瘤消化成单细胞，随后用淋巴细胞分离液富集淋巴细胞，并用CD3-FITC、CD8-PerCP、PD-1-PE、以及CD69-APC同时对细胞表面标记物进行标记，最后用流式细胞仪对不同的标记物进行检测。实验数据用FlowJo软件进行处理分析。

小鼠肿瘤浸润T淋巴细胞检测结果如图4所示，持续接受式(I)化合物([1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物)尾静脉注射后，肿瘤浸润淋巴细胞中，CD8+ T细胞的比例得到显著增加，且衰竭表型CD8+PD-1+ T细胞的比例显著下降。此外，免疫细胞早期活化标志物CD69+ T细胞的比例显著上调，说明与对照组相比，式(I)化合物([1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物)能够显著提高机体的免疫活性，提高抗肿瘤效应。

综合以上结果可见，本发明所公开的式(I)化合物能有效抑制肿瘤细胞生长和PD-L1表达，抑制肿瘤生长并激活免疫系统，可作为抗肿瘤药物。

Claims

1.式(I)的[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备通过抑制肿瘤细胞的PD-L1表达水平而抗肿瘤的药物中的应用：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤或肺腺癌中的任意一种。

3.式(I)的[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备抑制肿瘤细胞的PD-L1表达水平的药物中的应用：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤或肺腺癌中的任意一种。

5.式(I)的[1,2,4]三唑并[4,3-B]哒嗪衍生物在制备通过抑制肿瘤细胞的PD-L1表达水平而抑制肿瘤细胞增殖并重新激活免疫系统的药物中的应用：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、骨肉瘤或肺腺癌中的任意一种。