CN109030817A - Hmgb1检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种HMGB1检测试剂盒及其制备方法，其中，HMGB1检测试剂盒包括：试剂1和试剂2；所述试剂1包括HMGB1抗体标记的胶乳微球、助悬剂、牛血清白蛋白、第一缓冲液；所述试剂2包括氯化钠、分散剂、表面活性剂、第二缓冲液。该HMGB1检测试剂盒是一种基于胶乳增强免疫比浊法检测HMGB1的试剂盒，使用时通过在均相反应体系中进行抗原、抗体反应，当抗原与抗体结合后，直接测定反应溶液的吸光度值来反应被测抗原的浓度，检测速度快、成本低、省时省力，且稳定性和重复性好，能较真实地反映被测物质的含量。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种HMGB1检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
高迁移率族蛋白1(high mobility group protein，HMGB1)是存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)中迁移速度快而得名。HMGB1普遍存在于哺乳动物组织细胞中，是具有重要意义的炎症因子。HMGB1作为晚期炎症因子，相对于早期炎症因子在较长时间表达稳定，能够更好的反应体内炎症发生的情况，对临床治疗方案的确定具有更加重要的意义。
大量研究表明，在由细菌感染引起的炎症(例如内毒素血症和脓毒症，特别是急性炎症)中，早期炎症因子(例如TNF)刺激相关细胞(例如巨噬细胞)，开始分泌HMGB1，在一定时间后(例如18h)达到峰值。急性炎症经过治疗后，早期炎症因子回复到正常水平，若治疗效果不佳，晚期炎症因子(HMGB1)将会产生。随时监测晚期炎症因子，判断治疗效果，指导用药，及早采取措施，减少炎症对身体的伤害极为重要。
HMGB1检测运用非常广泛，但目前已有的方法由于操作时间长或灵敏度问题，不适于临床检验项目的开展。目前，市面上HMGB1检测主要采用ELISA法(酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay)，其操作繁琐、耗时。而且，国产HMGB1ELISA检测试剂盒质量参差不齐，而进口试剂一般价格昂贵。因此，亟需一种成本低，检测速度快，适合临床样本检测项目的技术出现。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测速度快、成本低的HMGB1检测试剂盒。
一种HMGB1检测试剂盒，包括：试剂1和试剂2；
所述试剂1包括HMGB1抗体标记的胶乳微球、助悬剂、牛血清白蛋白和第一缓冲液；
所述试剂2包括氯化钠、分散剂、表面活性剂和第二缓冲液。
采用上述HMGB1检测试剂盒进行检测时，取试剂1和试剂2混合，然后加入待测样品，通过在均相反应体系中进行抗原、抗体反应，并测定反应溶液的吸光度值来反应被测HMGB1的浓度。其通过在胶乳微球表面交联HMGB1抗体，当抗原与交联有HMGB1抗体的胶乳微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应溶液的吸光度，通过直接测定反应溶液的吸光度值来反应被测抗原的浓度，相较于ELISA法，省却了ELISA法反复孵育和洗板等繁琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力；并且，操作步骤的简化也相应地避免了繁琐的人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。
而且，通过将HMGB1抗体标记在胶乳颗粒上，在保证抗体与抗原特异性结合的条件下，还提高试剂检测的敏感性。
在其中一个实施例中，所述试剂1包括以下终浓度的组分：60μg/mL～120μg/mLHMGB1抗体、0.1v/v％～0.15v/v％胶乳微球、30g/L～60g/L助悬剂、5g/L～20g/L牛血清白蛋白和40mM/mL～60mM/mL第一缓冲液，所述试剂1的pH值为7～8。
在其中一个实施例中，所述胶乳微球为表面活化的聚苯乙烯胶乳微球，所述聚苯乙烯胶乳微球的表面活化基团为羧基，所述胶乳微球的颗粒直径为20nm～50nm。
采用羧基修饰的纳米聚苯乙烯微球，与HMGB1抗体通过共价键的形式结合，提高了与抗体偶联效率、减少抗体使用量的同时，也为HMGB1抗体提供了合适的3D结构与抗原进行结合，进而可以提升检测的敏感性和特异性。并且20nm～50nm的聚苯乙烯微球具有高比表面积，能够加快检测时达到吸附平衡的时间和吸附平衡稳定性，可以提高反应速度和结果的稳定性。
在其中一个实施例中，所述助悬剂选自海藻糖、葡萄糖、乳糖和蔗糖中的至少一种。
较优地，所述助悬剂为海藻糖。在试剂1中添加海藻糖，不但可以促进HMGB1抗体标记的胶乳微球悬浮，还易防止蛋白质变性和清除α和β射线所产生的OH自由基，提高试剂盒的稳定性。
在其中一个实施例中，所述第一缓冲液选自PB(磷酸盐)缓冲液、MES(2-吗啉乙磺酸)缓冲液、Tris-HCl(三羟基甲烷盐酸)缓冲液和甘氨酸缓冲液中的至少一种。
进一步地，所述第一缓冲液的pH值为7～8。如此，可通过所述第一缓冲液的pH值较易得到所述试剂1的pH值。
较优地，所述第一缓冲液为PB缓冲液。
在其中一个实施例中，所述试剂2包括以下终浓度的组分：5g/L～9g/L氯化钠、5g/L～10g/L分散剂、0.2g/L～0.8g/L表面活性剂和40mM/mL～60mM/mL第二缓冲液，所述试剂2的pH值为7～8。
在其中一个实施例中，所述试剂2中的所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、司盘40和司盘60中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述第二缓冲液选自PB缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液和甘氨酸缓冲液中的至少一种。
进一步地，所述第二缓冲液的pH值为7～8。
在其中一个实施例中，所述分散剂选自聚乙二醇类或硬脂酸盐类分散剂。
较优地，所述分散剂为聚乙二醇6000。
在其中一个实施例中，所述试剂1和所述试剂2的用量体积比为1:(1～3)。
较优地，所述试剂1和所述试剂2的用量体积比为1:3。可以理解的，采用上述HMGB1检测试剂盒进行检测时，所述试剂1和所述试剂2的用量体积比为1:3。
本发明另一目的在于提供一种上述HMGB1检测试剂盒的制备方法，包括所述试剂1的制备步骤和所述试剂2的制备步骤；
其中，所述试剂1的制备步骤包括以下步骤：
将所述助悬剂、所述牛血清白蛋白、所述第一缓冲液和所述HMGB1抗体标记的胶乳微球混合，并超声悬浮，得超声悬浮液；
将所述超声悬液进行紫外灭菌、无菌封装，得到所述试剂1；
所述试剂2的制备步骤：将所述试剂2的各组分混合均匀，得到所述试剂2。
具体地，将所述助悬剂、所述牛血清白蛋白和所述第二缓冲液混合均匀，得到悬浮液；然后将所述HMGB1抗体标记的胶乳微球超声悬浮于悬浮液中，得到超声悬浮液。
上述制备方法，超声悬浮在分散、悬浮HMGB1抗体标记的胶乳微球的同时，对液体内部起到良好的灭菌作用，而紫外灭菌可以对液体表面及空气起到良好灭菌效果，通过超声和紫外灭菌相结合能够起到良好的灭菌效果，从而避免了在试剂盒中加入如叠氮化钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯等防腐剂，避免此类防腐剂对人体和环境带来的危害。而且，此类防腐剂性质比较活泼，虽然能起到防腐作用，但是对胶乳体系的长期稳定性会造成严重影响。
超声悬浮通过超声波均质作用对试剂1的胶乳体系同时均匀作用，使悬浮颗粒快速达到微米级或以下，避免因使用其他分散方法需要时间较长、产生较大的热效应使HMGB1抗体的结构受到影响。
在其中一个实施例中，所述试剂1的制备步骤还包括所述HMGB1抗体标记的胶乳微球的制备，包括如下步骤：
取胶乳微球加入到缓冲液中，然后加入表面活性剂和活化剂，活化所述胶乳微球，制成混合液A；所述活化剂为羧基活化剂或氨基活化剂；
往所述混合液A中加入HMGB1抗体，进行偶联标记反应，制成含HMGB1抗体标记的胶乳微球的溶液B；
往所述溶液B中加入封闭液，封闭反应完成后，进行离心，所得沉淀即为所述HMGB1抗体标记的胶乳微球。
在其中一个实施例中，所述胶乳微球为颗粒直径为20nm～50nm的聚苯乙烯胶乳微球。
在其中一个实施例，所述混合液A中胶乳微球的体积浓度为0.1％～0.15％。
在其中一个实施例中，所述试剂1的制备方法中的所述表面活性剂选自TritonX-100、吐温-20和脂肪酸甲酯磺酸钠中的至少一种。
较优地，所述表面活性剂为脂肪酸甲酯磺酸钠。活化胶乳基团时选用脂肪酸甲酯磺酸钠表面活性剂，可以大大减少对胶乳标记过程的干扰，提高标记效率。
在其中一个实施例中，所述活化剂为N-HS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液和/或EDC(1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)溶液。通过N-HS、EDC活化，使得胶乳微球表面形成羧基活化基团。
进一步地，活化所述胶乳微球时，依次滴加完所述表面活性剂、N-HS和EDC，于37℃反应0.5h～1.5h。
在其中一个实施例中，所述HMGB1抗体标记的胶乳微球的制备所使用的缓冲液为MES缓冲液。
本发明还提供一种利用上述HMGB1检测试剂盒检测待测样品中HMGB1的含量的方法。
具体地，按体积比为1:(1～3)将所述试剂1和所述试剂2混合后，加入所述待测样品，混匀反应后测定吸光度，得出所述待测样品中HMGB1的含量。
本发明上述试剂盒具有以下优点：
1)成本低，操作简便，使用上述试剂盒可快速检测出HMGB1的含量，灵敏度高。
2)通过对试剂配比的优化设置，有效地降低HMGB1抗体的使用量，使HMGB1抗体的使用量仅在100μg/mL左右，能够节约试剂成本。
3)控制试剂1中胶乳微球的体积终浓度为0.1％～0.15％，可降低试剂使用的本底水平，提高检测结果精准度。
4)利用纳米级表面修饰的微球粒子原料，粒子直径为20nm-50nm，改善了HMGB1抗体标记胶乳颗粒增强试剂盒的检测灵敏度，使检测灵敏度达到1.0ng/mL。
5)超声悬浮和紫外灭菌相结合，可以保证试剂盒达到无菌状态，避免防腐剂的使用及其带来的对人体和环境的危害。
附图说明
图1为本发明实施例3的胶乳反应线性关系图；
图2为本发明实施例10的胶乳反应标准曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1制备HMGB1抗原
构建重组质粒，筛选阳性重组质粒，培养高效表达His-SBP-HMGB1融合蛋白的细菌。在6000×g、4℃的条件下，离心含菌的培养液30min，收集细菌并于-20℃保存备用；取适量菌体重悬于破菌缓冲液(含50mmol/L Tris-HCL、250mmol/L NaCl和10mmol/L咪唑，pH值为8.0)中，冰浴超声，10000×g、4℃离心20min，收集上清液备用；用蠕动泵上样镍柱进行亲和层析，先用破菌缓冲液清洗非特异结合蛋白，然后用洗脱缓冲液(含50mmol/L Tris-HCl、250mmol/L NaCl和300mmol/L咪唑，pH值为8.0)洗脱，并收集目的蛋白——HMGB1，作为HMGB1抗原备用。用紫外分光光度计测试收集的蛋白浓度，用12％琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度。
实施例2制备HMGB1多克隆抗体
将HMGB1抗原用生理盐水稀释到0.5mg/ml～2mg/ml的浓度，与弗氏佐剂按1:1比例混匀。将混合物对兔子皮下进行多点注射和后腿肌肉注射，首次注射剂量为0.5mg～1mg。每1～2周采集血清，通过琼脂扩散试验进行血清效价测定，如未达到预期效价，进行加强免疫，加注射剂量为首次注射的1/2，一般需加强免疫2～4次。当血清效价达到需求后，对兔子进行血清收集，将收集的血清于-20℃保存备用。
取100mgHMGB1加入到3g溴化氰活性的琼脂糖介质(CNBr-activated Sepharose4B)中，在碱性条件下制备成体积约10mlHMGB1亲和层析柱，备用。利用亲和柱纯化HMGB1抗体血清，得到HMGB1多克隆抗体。
实施例3标记胶乳颗粒
a、准备胶乳溶液
用胶乳母液(5v/v％，20nm～50nm粒径)制备1mL终浓度为0.11v/v％的胶乳溶液(22μL胶乳母液+978μL50mM MES缓冲液)，pH值为6.0。
b、活化胶乳基团
1mL胶乳溶液中按顺序加入三种溶液：4.5μL表面活性剂(用50mM MES、pH值为6.0的溶液或纯水配制成5％母液)；4.5μL N-HS溶液(浓度为10mg/mL)；4.5μL EDC溶液(浓度为10mg/ml)。溶液加入完毕后，乳胶溶液静置于37℃反应1h。
c、抗体偶联标记
加入100μg HMGB1抗体(20μL的5mg/mL抗体母液)，置于37℃反应2h，并缓慢搅拌。
d、封闭胶乳基团
加入100μL封闭液(1M Tris-HCl，pH值为8.0)，静置于37℃反应30min。
e、重悬胶乳沉淀
封闭反应完毕后，6000×g离心5min～10min(需要注意的是尽量以最小离心力和最短时间离心沉淀胶乳，以离心上清不浑浊为离心终点)；离心沉淀用1mL悬浮液(含50g/L海藻糖、10g/L BSA、50mM PB，pH值为7.4)超声悬浮(用小探头冰浴超声，停5s，超声10s，重复处理4min～5min)。
f、制备无防腐剂检测试剂盒
紫外照射超声悬浮液，杀灭液体表面及空气周围的细菌，无菌封装。
g、测试试剂性能
不同时间段取250μL胶乳重悬液作为检测试剂1，加入750μL检测液(含9g/L NaCl、10g/L PEG 6000、0.5g/L吐温-20、50mM PB，pH值为7.4)作为检测试剂2，在546nm检测波长下，取10μl浓度为500ng/ml的HMGB1样品，用可见紫外分光光度计测定5min反应时间内的吸光度变化。
结果如图1所示，从图1可以看出，胶乳试剂在反应时的本底为0.5左右，当HMGB1浓度为500ng/ml时，反应5min后吸光度差值为1，能够达到检测的预期效果。
实施例4 HMGB1检测试剂盒
试剂1：由以下组分组成：HMGB1抗体标记的聚苯乙烯胶乳微球、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)、磷酸盐；各物质终浓度为：0.11v/v％聚苯乙烯胶乳微球(颗粒直径为20nm～50nm)，100μg/mL HMGB1抗体、50g/L海藻糖，10g/L BSA，50mM PB，pH值为7.4。
试剂1具体配制过程如下：
(1)用5v/v％聚苯乙烯胶乳母液(聚苯乙烯的粒径为20nm～50nm)制备1mL终浓度为0.11v/v％的胶乳溶液(20μl胶乳母液+980μl 50mM MES溶液，pH值为6.0)。
(2)1mL胶乳溶液中按顺序加入三种溶液：4.5μL表面活性剂(5％脂肪酸甲酯磺酸钠)、4.5μL N-HS溶液(10mg/mL)、4.5μL EDC溶液(10mg/mL)。溶液加入完毕后，乳胶溶液静置于37℃反应1h。
(3)加入100μg HMGB1抗体(20μL的5mg/mL抗体母液)，置于37℃反应2h，并缓慢搅拌。
(4)加入100μL封闭液(1M Tris-HCl，pH值为8.0)，静置于37℃反应30min。
(5)封闭反应完毕后，6000×g离心5min～10min；离心沉淀用1mL悬浮液(含50g/L海藻糖、10g/L BSA、50mM PB，pH值为7.4)超声悬浮后，紫外灭菌，即得试剂1。
试剂2中含有：氯化钠、聚乙二醇6000、吐温-20、磷酸盐，各物质终浓度为：9g/LNaCl，10g/L PEG 6000，0.5g/L吐温-20，50mM PB，pH值为7.4。
实施例5乳胶颗粒选择与胶乳浓度优化
比较直径20nm～50nm与50nm～100nm两种聚苯乙烯微球标记效果，并配置体积浓度为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％四种不同浓度进行标记，观察标记过程中胶乳状态的变化和最终标记结果。
实验证明0.1％胶乳浓度和直径为20nm～50nm的效果较好，标记过程中胶乳状态稳定。
实施例6 HMGB1抗体标记量及反应条件优化
根据微球表面基团含量范围40μmol/g～100μmol/g，算得抗体量约需150μg/mL～300μg/mL(按照抗体分子量150kd，胶乳浓度0.1％，基团含量100μmol/g，基团活化标记率1％～2％计算)。分别按照100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL的HMGB1抗体浓度进行标记试验。
结果显示，当抗体浓度大于150μg/mL时，胶乳体系变得很不稳定。优化反应条件，恒温37℃反应并不断缓慢摇匀，抗体浓度为100μg/mL～150μg/mL效果较佳。为避免试剂浪费，优选100μg/mL抗体使用量。
实施例7胶乳离心与悬浮条件优化
本实施例为实施4试剂1配制过程中步骤(5)胶乳离心与悬浮条件优化。优选20nm～50nm聚苯乙烯微粒，体积浓度为0.1％，抗体量100μg/mL进行标记，封闭完毕后离心。分别以3000×g、6000×g、9000×g、12000×g离心收集标记胶乳颗粒。
实验结果证明低离心力(例如3000×g)在5min～10min不能将标记胶乳完全离心沉淀，高离心力使胶乳沉淀板结，后续悬浮效果不佳，选用6000×g离心效果较佳。悬浮液中成分优选50g/L海藻糖、10g/L BSA和50mM PB效果较好。
实施例8试剂2配比优化
本实施例主要考察PEG6000浓度对反应效果的影响。分别配制5g/L、10g/L、15g/L、20g/L的PEG6000的试剂2，优选试剂1优化配比，并配制适当浓度的HMGB1抗原溶液，比较5min内反应效果。
结果显示，PEG6000浓度较低时，紫外吸收变化小；PEG6000浓度较高时，致使反应体系不稳定。PEG6000浓度为10g/L为较优选择。
实施例9试剂1和试剂2在检测中加入比例确定
本实施例中考察试剂加入量对反应体系稳定性的影响。在1mL反应体系中，考察500μL试剂1+500μL试剂2(1:1)、333μL试剂1+667μL试剂2(1:2)、250μL试剂1+750μL试剂2(1:3)这三种情况下，反应体系稳定与反应本底问题。
试验结果如下表1所示，表明，当试剂1加入量增大时，造成反应体系本底上升，对检测结果造成偏差。三种方案中优选250μL试剂1+750μL试剂2(1:3)。
表1试剂加入比例对吸光度的影响
| 序号 | 试剂1：试剂2(体积比) | 初始吸光度 | 5min后吸光度 | 吸光度差值 |
| 1 | 1:3 | 0.523 | 0.534 | 0.011 |
| 2 | 1:2 | 0.702 | 0.852 | 0.15 |
| 3 | 1:1 | 1.197 | 1.547 | 0.35 |
实施例10标准曲线的建立与线性范围的确定
测定条件：全自动生化仪，250μL试剂1，750μL试剂2，检测波长546nm。
测定方法(两点终点法)：取实施例4的试剂1和试剂2，250μL试剂1加入到750μL试剂2中，然后加入10μL样本，反应5s后开始读点测定吸光度A1，5min之后再次读点测定吸光度A2，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1。
制作标准曲线：采用本申请的HMGB1标准品，浓度分别为S6：300ng/mL，S5：180ng/mL，S4：90ng/mL，S3：35ng/mL，S2：10ng/mL，S1：0ng/mL。按照上述步骤测得差值ΔA，绘制标准曲线，如图2所示，其中x轴代表HMGB1的浓度，y轴代表吸光度的差值。计算出回归方程为y＝0.0015x+0.0939，相关系数R2为0.9996。本发明试剂盒在0-300ng/mL线性范围内相关性较好。
实施例11实际样品的检测
取6个人血浆样品，用市售HMGB1粗略测定其含量。每个样品平分为两份，往其中一份中下按表1分别加入HMGB1标样量。用实施例4的试剂盒的对12份未加标样的样品和加标样的样品重复测定3次，测定方法为：取250μL试剂1加入到750μL试剂2中，然后加入10μL样本，反应5s后，测定吸光度，计算样本中HMGB1的量，对结果取平均值。加标的一份所得结果减去未加标一份所得结果，其差值同加入标准物质的理论值相比计算样品加标回收率，结果如下表1。从表1可以看出平均回收率为99.6％，说明试剂盒在实际样品中检测的准确性很高。
表2 HMGB1加标样后的回收率
| 编号 | 样品量(ng) | 标样量(ng) | 测得量(ng) | 回收率(％) |
| 1 | 113.6 | 20 | 20.4 | 102.0 |
| 2 | 85 | 20 | 19.8 | 99.1 |
| 3 | 127.4 | 20 | 19.8 | 99.5 |
| 4 | 194.6 | 40 | 39.4 | 98.5 |
| 5 | 198.2 | 40 | 39.6 | 99.0 |
| 6 | 205.2 | 40 | 39.8 | 99.5 |
实施例12稳定性的测定
将实施例4的试剂1和试剂2放置于4℃冰箱保存，连续隔天观察其状态一个月，发现无肉眼可见变化。按实施例10所述方法每隔7天进行检测，反应性稳定。说明本发明实施例的试剂盒稳定性好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种HMGB1检测试剂盒，其特征在于，包括试剂1和试剂2；所述试剂1包括HMGB1抗体标记的胶乳微球、助悬剂、牛血清白蛋白和第一缓冲液；
所述试剂2包括氯化钠、分散剂、表面活性剂和第二缓冲液。
2.根据权利要求1所述的HMGB1检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1包括以下终浓度的组分：60μg/mL～120μg/mL HMGB1抗体、0.1v/v％～0.15v/v％胶乳微球、30g/L～60g/L助悬剂、5g/L～20g/L牛血清白蛋白和40mM/mL～60mM/mL第一缓冲液，所述试剂1的pH值为7～8。
3.根据权利要求1所述的HMGB1检测试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球为表面活化的聚苯乙烯胶乳微球，所述聚苯乙烯胶乳微球的表面活化基团为羧基，所述胶乳微球的颗粒直径为20nm～50nm。
4.根据权利要求1所述的HMGB1检测试剂盒，其特征在于，所述助悬剂选自海藻糖、葡萄糖、乳糖和蔗糖中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的HMGB1检测试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液选自PB缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液和甘氨酸缓冲液中的至少一种。
6.根据权利要求1～5任一所述的HMGB1检测试剂盒，其特征在于，所述试剂2包括以下终浓度的组分：5g/L～9g/L氯化钠、5g/L～10g/L分散剂、0.2g/L～0.8g/L表面活性剂和40mM/mL～60mM/mL第二缓冲液，所述试剂2的pH值为7～8。
7.根据权利要求6所述的HMGB1检测试剂盒，其特征在于，所述试剂1和所述试剂2的用量体积比为1:(1～3)。
8.权利要求1～7任一所述的HMGB1检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括所述试剂1的制备步骤和所述试剂2的制备步骤；
其中，所述试剂1的制备步骤包括以下步骤：
将所述助悬剂、所述牛血清白蛋白、所述第一缓冲液和所述HMGB1抗体标记的胶乳微球混合，并超声悬浮，得超声悬浮液；
将所述超声悬浮液进行紫外灭菌、无菌封装，得到所述试剂1；
所述试剂2的制备步骤：
将所述试剂2的各组分混合均匀，得到所述试剂2。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述试剂1的制备步骤还包括所述HMGB1抗体标记的胶乳微球的制备，包括如下步骤：
取胶乳微球加入到缓冲液中，然后加入表面活性剂和活化剂，活化所述胶乳微球，制成混合液A；所述活化剂为羧基活化剂或氨基活化剂；
往所述混合液A中加入HMGB1抗体，进行偶联标记反应，制成含HMGB1抗体标记的胶乳微球的溶液B；
往所述溶液B中加入封闭液，封闭反应完成后，进行离心，所得沉淀即为所述HMGB1抗体标记的胶乳微球。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述试剂1的制备方法中的所述表面活性剂选自TritonX-100、吐温-20和脂肪酸甲酯磺酸钠中的至少一种。
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2018
- 2018-07-04 CN CN201810721943.1A patent/CN109030817A/zh active Pending
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