CN109022603A - 检测b型肉毒梭菌的实时荧光定量pcr核酸序列以及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测B型肉毒梭菌的实时荧光定量PCR核酸序列以及试剂盒，核酸序列包括上游引物B‑F、下游引物B‑R和探针B‑P，以本发明提供的引物和探针对B型肉毒梭菌进行检测，准确率达到100%，对其它25种肠道致病菌及常见细菌DNA进行扩增时，均未见特异性扩增曲线出现，特异性良好。根据重组质粒标准品构建的荧光定量PCR标准曲线可确定其对B型肉毒梭菌检测灵敏度为6.91×102拷贝/µl。另在荧光定量PCR检测体系中，含B毒素基因的重组质粒浓度在102～109拷贝/µl范围内，扩增反应的Ct值与模版浓度之间存在良好的线性关系。本发明具有反应灵敏、特异性高、快速、便捷、高通量等特点，为B型肉毒梭菌筛检、大规模检疫以及流行病学调查提供了一种有效的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及肉毒梭菌的分子学检测，具体涉及一种检测B型肉毒梭菌的实时荧光定量PCR核酸序列以及试剂盒。
背景技术
肉毒梭菌（C. botulinum）是一种革兰氏阳性、厌氧、有鞭毛、无荚膜、芽孢椭圆形的粗短杆菌。最初于1896年由比利时学者Van Ermengemcong从腊肠中发现，并证实其能产生外毒素-肉毒毒素（Botulinum toxin），引起人和动物中毒。本菌广泛存在于土壤、海洋、湖泊的沉淀物及哺乳动物、鸟类、鱼的肠道、饲料及食品中。肉毒梭菌不能在活的有机体内生长，当环境厌氧，有适当营养时，即可生长繁殖产生肉毒毒素，人畜食入含此毒素的食品、饲料时，即可发生中毒症状。根据肉毒素抗原性将肉毒梭菌分为A-G 7个型，其中A、B、E、F为人中毒型别，C、D型为动物和家禽中毒型别，G型极少见。最近在婴儿肉毒病例中又发现H型。
肉毒毒素是目前已知最剧烈的神经毒素，其引起的食物中毒在我国十几个省、区均有发现，病死率极高，危害食品安全。目前针对肉毒梭菌的检测方法主要有分离培养、小鼠动物实验、针对毒素的间接ELISA等免疫学方法，以及普通PCR等分子生物学方法，多存在费时费力且灵敏度不高等缺点。
实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chainreaction，qPCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。本发明设计了针对B型肉毒梭菌毒素基因的引物和探针，建立了实时荧光定量PCR快速检测体系，为B型肉毒梭菌的快速检测提供一种新的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测B型肉毒梭菌的实时荧光定量PCR核酸序列以及试剂盒，为B型肉毒梭菌的快速检测提供一种新的技术手段。
为实现以上目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
检测B型肉毒梭菌的核酸序列，所述核酸序列包括引物和探针，所述引物为检测肉毒梭菌B毒素基因的上游引物B-F和下游引物B-R，所述探针为检测肉毒梭菌B毒素基因的探针B-P，上游引物B-F、下游引物B-R和探针B-P核苷酸序列分别如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示，具体为：
上游引物B-F：5'- cacaaacattgctagtgtaactgttaataa -3'，（SEQ ID No：1）；
下游引物B-R：5'- ctatagtctcattttcatttaaaactggc -3'，（SEQ ID No：2）；
探针B-P：5'- cagtaatccaggagaagtggagcgaaaaaagg -3'，（SEQ ID No：3）；所述探针B-P的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团BHQ2。上述引物扩增的目标片段长度为130bp。
本发明还提供一种检测B型肉毒梭菌的实时荧光定量PCR试剂盒，包括以下组分：
（1） qPCR反应体系成份，其中包括如序列SEQ ID No：1所示的上游引物B-F、如序列SEQID No：2所示的下游引物B-R和如序列SEQ ID No：3所示的探针B-P，其中探针B-P的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团BHQ2。
（2）阴性对照，采用TE 缓冲液 ，所述TE缓冲液为10mMTris-HCl，1mM EDTA 。
（3）阳性对照，B型肉毒梭菌重组质粒标准品。
（4）稀释缓冲液。选用全式金生物公司的TransNGSTM Library Dilution Buffer。
进一步地，上述qPCR反应体系成份还包括qPCR反应所需要的试剂和酶，优选地，所述qPCR反应体系还包括qPCR SuperMix，所述qPCR SuperMix 含dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。qPCR SuperMix购自全式金生物公司。
本发明还提供了检测B型肉毒梭菌型实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品细菌基因组DNA；
细菌基因组DNA的抽提使用Promega技术有限公司的试剂盒，按照说明书进行操作，-20℃保存备用。也可使用现有技术中已知的提取DNA的方法进行提取。
（2）对提取的样品DNA进行qPCR扩增；其中使用如序列SEQ ID No：1所示的上游引物B-F、如序列SEQ ID No：2所示的下游引物B-R和如序列SEQ ID No：3所示的探针B-P，所述探针B-P的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团BHQ2。
表1 qPCR反应体系：
| 名称 | 终浓度 | 加样量（μl） |
| qPCR SuperMix | 2× | 12.5 |
| 引物B-F | 10µM | 0.25 |
| 引物B-R | 10µM | 0.25 |
| 探针B-P | 10µM | 0.5 |
| 模板DNA | ≥103拷贝/µl | 0.5 |
| ddH2O | 10.5 | |
| 总计 | 25 |
反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性10s，60℃延伸30s，共45个循环。
（3）结果判定：
结果分析条件设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。Ct值≤35，而且出现明显的扩增曲线为阳性，表明样品中存在B型肉毒梭菌；无Ct值，且无扩增曲线，为阴性。若样本Ct值>35，建议重做，重做结果无Ct值为阴性，否则为阳性。
本发明的有益效果：
1本发明所提供的引物和探针可用于B型肉毒梭菌的定性及定量分析，反应灵敏、特异性良好。
2可同时对大量样品进行检测，2h内就可以观察结果，具备快速、灵敏、便捷、高通量等特点，为B型肉毒梭菌筛检、大规模检疫以及流行病学调查提供了一种有效的检测手段。
附图说明
图1为 B毒素基因重组质粒标准品荧光信号图。
图2为B毒素基因重组质粒标准品对数值-Ct对应标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述，但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
以下实施例中所用材料、试剂等无特别说明均可从商业途径得到。
实施例1 检测B型肉毒梭菌的专用引物和探针的设计
根据GenBank上公布的肉毒梭菌B型毒素基因序列，使用CLUSTLAW 软件对肉毒梭菌的B毒素基因进行多重比对，选择其稳定的保守区域作为检测靶标序列，并针对这个序列设计一对引物和一条探针，其中引物B-F的序列如SEQ ID No：1所示；引物B-R的序列如SEQ IDNo：2所示；探针B-P的序列如SEQ ID No：3所示。探针B-P的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团BHQ2。最后与GenBank 进行blast比对确定引物和探针的特异性后，交由上海生工生物技术有限公司进行合成。
实施例2检测B型肉毒梭菌的荧光定量PCR的试剂盒的组成
（1）qPCR反应体系成份，其中包括如序列SEQ ID No：1所示的上游引物B-F、如序列SEQID No：2所示的下游引物B-R和如序列SEQ ID No：3所示的探针B-P，其中探针B-P的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团BHQ2；所述qPCR反应体系还包括qPCRSuperMix，所述qPCR SuperMix 含dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。qPCR SuperMix购自全式金生物公司。
（2）阴性对照，采用TE 缓冲液 ，组成如下：10mMTris-HCl，1mM EDTA
（3）阳性对照，B型肉毒梭菌重组质粒标准品。
（4）稀释缓冲液。选用全式金生物公司的TransNGSTM Library Dilution Buffer。
实施例3质粒标准品的构建与制备
以B-F和B-R为引物，进行PCR扩增，目的产物片段经过切胶纯化回收后连接到pMD-18T载体，转化JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，用PCR验证并测序最终确认。
实施例4 实时荧光定量PCR反应体系的建立
使用TransStart Probe qPCR SuperMix（全式金生物公司）进行qPCR核酸扩增。反应体系按照表1建立，使用Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪，扩增条件为95℃预变性2min，95℃变性10s，60℃延伸30s，共45个循环，对于Ct值≤35的扩增结果判定为阳性。
实施例5标准曲线的建立及重复性检验
按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒（Omega公司），用紫外分光光度计测定抽提质粒浓度，根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度：每µl样品中检测基因的拷贝数=浓度（ng/µl）×阿佛伽德罗常数×10-9/(660×重组质粒碱基数)。用稀释缓冲液（全式金生物公司TransNGSTM Library Dilution Buffer。）将上述质粒依次稀释成1.0×102拷贝/µl～1.0×109拷贝/µl共8个浓度梯度，每个梯度标准品设3个重复，阴性对照模版用TE缓冲液，进行实时荧光定量PCR检测。
当目的基因重组质粒浓度为6.91×102拷贝/µl及以上时，其荧光信号强度高于检测阈值。当目的基因重组质粒浓度小于6.91×102拷贝/µl时，均未出现扩增荧光信号，故此法对含有目的基因重组质粒的检测下限为6.91×102拷贝/µl。另在该PCR检测体系中，含B毒素基因的重组质粒浓度在102～ 109拷贝/µl范围内，扩增反应的Ct值与模版浓度之间均存在良好的线性关系，如图1和图2所示。
实施例6检测特异性评价
方法特异性评价，包括以下步骤：
（一）样品来源
表2 实验菌株
| 序号 | 菌名 | 拉丁名 | Strain | qPCR |
| 1 | 肉毒梭菌B | Clostridium botulinum | Isolated strain | ＋ |
| 1 | 蜡样芽胞杆菌 | Bacillus cereus | Isolated strain | － |
| 2 | 艰难梭菌 | Clostridium difficile | Isolated strain | － |
| 3 | 第三梭菌 | Clostridium tertium | Isolated strain | － |
| 4 | 产气荚膜梭菌 | Clostridium perfringens | Isolated strain | － |
| 5 | 索氏梭菌 | Clostridium sordellii | Isolated strain | － |
| 6 | 阴沟肠杆菌 | Enterobacter cloacae | Isolated strain | － |
| 7 | 猪链球菌 | Streptococcus suis | Isolated strain | － |
| 8 | 小肠结肠耶尔森菌 | Yersinia enterocxolitica | ATCC23715 | － |
| 9 | 粪肠球菌 | Enterococcus faecalis | ATCC35667 | － |
| 10 | 屎肠球菌 | Enterococcus faecium | Isolated strain | － |
| 11 | 单增李斯特菌 | Listeria monocytogenes | Isolated strain | － |
| 12 | 肠出血性大肠杆菌 | Enterohemorrhagic E. coli | EDL933 | － |
| 13 | 肠致病性大肠杆菌 | Enteropathogenic E. coli | Isolated strain | － |
| 14 | 肠聚集性大肠杆菌 | Enteroaggregative E. coli | Isolated strain | － |
| 15 | 肠产毒性大肠杆菌 | Enterotoxigenic E. coli | Isolated strain | － |
| 16 | 肠侵袭性大肠杆菌 | Enteroinvasive E. coli | Isolated strain | － |
| 17 | 空肠弯曲菌 | Campylobacter jejuni | ATCC33291 | － |
| 18 | 霍乱弧菌 | Vibrio cholerae | Isolated strain | － |
| 19 | 伤寒沙门菌 | Salmonella typhi | H98125 | － |
| 20 | 猪霍乱沙门菌 | Salmonella choleraesuis | ATCC14028 | － |
| 21 | 弗劳地枸橼酸杆菌 | Citrobacter freundii | Isolated strain | － |
| 22 | 阪崎肠杆菌 | Enterobacter sakazakii | ATCC51329 | － |
| 23 | 福氏志贺菌 | Shigella flexneri | Isolated strain | － |
| 24 | 宋内志贺菌 | Shigella sonnei | ATCC25931 | － |
| 25 | 金黄色葡萄球菌 | Staphylococcus aureus | ATCC6538 | － |
表2中分离株（Isolated strain）均来自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所实验室保存菌。
（二）细菌基因组DNA提取；
细菌基因组DNA的抽提使用Promega公司的试剂盒，按照说明书进行操作，-20℃保存备用。
（三）特异性检测试验
以步骤（一）和步骤（二）中获得的细菌DNA为模板，水为空白对照，进行qPCR反应，反应体系按照表1建立，使用Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪，扩增条件为95℃预变性2min，95℃变性10s，60℃延伸30s，共45个循环。
结果显示用该体系对蜡状芽孢杆菌、艰难梭菌、第三梭菌、产气荚膜梭菌、索氏梭菌、阴沟肠杆菌、猪链球菌、小肠结肠耶尔森菌、粪肠球菌、屎肠球菌、单增李斯特菌、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠聚集性大肠杆菌（EaggEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、空肠弯曲菌、霍乱弧菌、伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阪崎肠杆菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌、金黄色葡萄球菌等25种病原菌基因组DNA进行检测时均未产生特异性扩增曲线，说明该检测体系的特异性良好。
实施例7模拟粪便标本制备及检测
取健康婴儿粪便，分装0.1 g /管，共 5管。其中一管加入100μlddH2O作为空白对照，其余4管各加入60μlddH2O煮沸5分钟，13000rpm离心5分钟，取上清液，每管依次加入103～106 倍比稀释的B型肉毒梭菌重组质粒标准品溶液40μl。每个浓度设3个重复，进行实时荧光定量PCR检测。
结果显示，当目的基因重组质粒浓度为2.1384×103拷贝/µ l及以上时，其荧光信号强度高于检测阈值。当目的基因重组质粒浓度小于2.1384×103拷贝/µl时均未出现扩增荧光信号，故此法对模拟粪便标本中含有目的基因重组质粒的检测下限为2.1384×103拷贝/µ l。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可做出不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 检测B型肉毒梭菌的实时荧光定量PCR核酸序列以及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物B-F(人工序列)
<400> 1
cacaaacatt gctagtgtaa ctgttaataa 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物B-R(人工序列)
<400> 2
ctatagtctc attttcattt aaaactggc 29
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 探针B-P(人工序列)
<400> 3
cagtaatcca ggagaagtgg agcgaaaaaa gg 32
Claims (10)
1.检测B型肉毒梭菌的核酸序列，所述核酸序列包括引物和探针，其特征是所述引物为检测肉毒梭菌B毒素基因的上游引物B-F和下游引物B-R，所述探针为检测肉毒梭菌B毒素基因的探针B-P，上游引物B-F、下游引物B-R和探针B-P核苷酸序列分别如序列SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示，所述探针B-P的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团BHQ2。
2.根据权利要求1所述的检测B型肉毒梭菌的核酸序列，其特征是引物扩增的目标片段长度为130bp。
3.一种检测B型肉毒梭菌的试剂盒，其特征是所述试剂盒包括：
（1）qPCR反应体系成份，其中包括如序列SEQ ID No：1所示的上游引物B-F、如序列SEQID No：2所示的下游引物B-R和如序列SEQ ID No：3所示的探针B-P，所述探针B-P的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团BHQ2；
（2）阴性对照；
（3）阳性对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是所述qPCR反应体系成份还包括qPCRSuperMix，所述qPCR SuperMix 含dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR反应缓冲液。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征是所述阴性对照为TE 缓冲液 ， TE缓冲液为10mMTris-HCl，1mM EDTA 。
6.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征是所述阳性对照为B型肉毒梭菌重组质粒标准品。
7.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征是所述试剂盒还包括稀释缓冲液。
8.一种检测B型肉毒梭菌型实时荧光定量PCR检测方法，其特征是包括以下步骤：
（1）提取待测样品细菌基因组DNA；
（2）对提取的样品DNA进行qPCR扩增；其中使用如序列SEQ ID No：1所示的上游引物B-F、如序列SEQ ID No：2所示的下游引物B-R和如序列SEQ ID No：3所示的探针B-P，所述探针B-P的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团BHQ2；
（3）分析PCR产物。
9.根据权利要求8所述检测方法，其特征是PCR反应体系25µl计为：
模版DNA 0.5µl
10µM引物B-F 0.5µl
10µM引物B-R 0.5µl
10µM探针B-P 0.5µl
2×qPCR SuperMix 12.5µl
ddH2O 10.5µl。
10.根据权利要求8或9所述检测方法，其特征是PCR反应条件为：95℃2min后，95℃10s，60℃30s一个循环，共45个循环。
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