CN109001462A - 一种同型半胱氨酸检测试剂盒 - Google Patents
一种同型半胱氨酸检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及体外诊断技术领域，尤其是一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，试剂R1组分为丝氨酸0.5‑20mmol/L、HCY还原剂0.5‑10mmol/L、NADH 0.5‑1.8g/L、LDH 10‑200KU/L、缓冲液20‑100mmol/L；试剂R2组分为胱硫醚β‑合成酶0.5‑10KU/L、胱硫醚β‑分解酶10‑50KU/L、缓冲液20‑100mmol/L。本试剂盒用于体外定量检测人血清中同型半胱氨酸(Hcy)的含量，Hcy与心血管疾病密切相关，是心血管疾病发病的一个重要危险因子，用于心血管疾病危险因素的辅助诊断，并指导临床治疗。具有稳定性好、使用方便、制备简单的优点。
Description
技术领域
本发明涉及半胱氨酸检测技术领域，尤其涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸(又称高半胱氨酸，homocysteine,Hcy)是蛋氨酸代谢过程中的中间产物。同型半胱氨酸在体内的分解代谢，受两方面因素影响最大。一是与先天遗传有关的某些生物酶的缺乏，另一个就是体内叶酸、维生素B6、维生素B12等营养元素的缺乏。这两种缺乏都会影响同型半胱氨酸转化为其他物质，导致高同型半胱氨酸血症。Hcy的测定，对心血管疾病、尿毒症、动脉粥样硬化、糖尿病、老年痴呆症等疾病的判定中，有重要的临床意义。
通常认为成人空腹血浆总Hcy水平正常值为4～12μmol/L，理想值为<10μmol/L，高于15μmol/L则被认为是高同型半胱氨酸败血症；老年人(≥60岁)空腹血浆总Hcy水平正常值为15～20μmol/L，高于20μmol/L被认为是高同型半胱氨酸败血症。
目前，实验室常用的Hcy测定方法有色谱法、酶联免疫法、荧光偏振免疫法及酶循环法。色谱法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，现在公认其为测定血浆Hcy浓度的首选方法， 但因色谱法(HPLC及GC-MS)需要的设备复杂且昂贵，难以适应常规临床化学实验室应用；酶联免疫测定法自动化水平低，大部分需要手工操作，耗时较长，且容易造成误差；荧光偏振免疫检测 (FPIA) 方法灵敏度高，检测速度快，但价格昂贵，检测成本高，不适用常规生化检测；酶循环法是一种无需预处理样本，适用于全自动生化分析仪，具有快速、准确、灵敏的特点，因此受到临床广泛推广。但是普通的同型半胱氨酸检测试剂中由于存在多种酶，会使该试剂 的稳定性受到影响，不利于试剂的长期保存，从而造成浪费的不良后果。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种同型半胱氨酸检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，试剂R1组分丝氨酸0.5-20mmol/L、HCY还原剂0.5-10mmol/L、NADH 0.5-1.8g/L、LDH 10-200KU/L、缓冲液20-100mmol/L；试剂R2组分为胱硫醚β-合成酶0.5-10KU/L、胱硫醚β-分解酶10-50KU/L、缓冲液20-100mmol/L。
其使用方法：首先把结合或聚合状态的Hcy,包括复杂的二硫键的聚合状态的Hcy以及蛋白结合的Hcy还原成游离型的Hcy，然后游离型的Hcy与丝氨酸在胱硫醚合成酶（CBS）的作用下形成胱硫醚，形成的胱硫醚在胱硫醚裂解酶（CBL）的作用下形成Hcy、丙酮酸和氨，丙酮酸与NADH（辅酶）在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下反应，NADH转化为NAD+在340nm下每分钟转化的速率直接与Hcy的浓度正相关。
优选的，缓冲液为Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种按任意比组成的混合物，缓冲液的PH值为7.1-7.5。
优选的，试剂R1和R2中还加入有电解质，电解质为氯化钠、氯化钾或氯化钙，电解质的质量百分比为0.2-2％。
优选的，试剂R1和R2中还加入有表面活性剂，表面活性剂选择Tween系列或聚氧乙烯苯基醚，表面活性剂的质量百分比为0.1-1.0％。
优选的，试剂R1和R2中还加入有防腐剂，防腐剂为为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种，防腐剂的浓度为0.1-0.5％(w/v)。
优选的，试剂R1和R2中还加入有稳定剂，稳定剂为BSA、蔗糖、山梨糖或海藻糖，稳定剂的浓度为2-5％(w/v)。
优选的，试剂R1和R2中还加入有促凝剂，促凝剂是聚乙二醇6000，促凝剂浓度为0.1-1％(w/v)。
优选的，HCY还原剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP），二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇（β-ME）,浓度为0.5-10mmol/L。
本发明提出的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，测定条件为：
| 主波长 | 340nm | 副波长 | 405nm |
| 反应温度 | 37℃ | 反应类型 | 速率法 |
| 反应方向 | 下降 | 校准类型 | Linear |
测定步骤为：
结果计算：Hcy（μmol/L）= CS× （μmol/L）
本发明提出的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，有益效果在于：本试剂盒用于体外定量检测人血清中同型半胱氨酸 (Hcy)的含量，Hcy 与心血管疾病密切相关，是心血管疾病发病的一个重要危险因子，用于心血管疾病危险因素的辅助诊断，并指导临床治疗。具有稳定性好、使用方便、制备简单的优点。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1：
Tris-HCl缓冲液 80 mmol/L
丝氨酸 0.5mmol/L
TCEP 1mmol/L
NADH 0.5g/L
LDH 50KU/L
proclin300 1g/L
BSA 20g/L
PEG6000 10 g/L
NaCl 2g/L
Tween20 1 g/L
其余为纯化水 PH=7.2
试剂R2：
Tris-HCl缓冲液 60 mmol/L
胱硫醚β-合成酶 1KU/L
胱硫醚β-分解酶 10KU/L
BSA 25g/L
proclin300 1g/L
PEG6000 5g/L
NaCl 2g/L
Tween20 2g/L
其余为纯化水 PH=7.5
实施例2
一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1：
HEPES缓冲液 100 mmol/L
丝氨酸 1mmol/L
DTT 2mmol/L
NADH 0.8g/L
LDH 80KU/L
NaN3 1g/L
海藻糖 30g/L
PEG6000 20 g/L
NaCl 2g/L
Tween20 1 g/L
其余为纯化水 PH=7.2
试剂R2：
HEPES缓冲液 100 mmol/L
胱硫醚β-合成酶 5KU/L
胱硫醚β-分解酶 25KU/L
BSA 20g/L
蔗糖 10 g/L
NaN3 1g/L
PEG6000 10g/L
NaCl 2g/L
Tween20 2g/L
其余为纯化水 PH=7.2
实施例3
一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1：
MOPS缓冲液 50 mmol/L
丝氨酸 10mmol/L
TCEP 5mmol/L
NADH 1g/L
LDH 100KU/L
NaN3 2g/L
海藻糖 30g/L
PEG6000 30 g/L
KCl 5g/L
聚氧乙烯苯基醚 5g/L
其余为纯化水 PH=7.5
试剂R2：
MOPS缓冲液 100 mmol/L
胱硫醚β-合成酶 10KU/L
胱硫醚β-分解酶 50KU/L
BSA 25g/L
山梨糖 10g/L
NaN3 2g/L
PEG6000 20g/L
KCl 2g/L
聚氧乙烯苯基醚 2g/L
其余为纯化水 PH=7.5
实施例4
一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1：
PBS缓冲液 100mmol/L
丝氨酸 10mmol/L
TCEP 2mmol/L
β-ME 1 mmol/L
NADH 1g/L
LDH 60KU/L
NaN3 2g/L
山梨糖 20g/L
PEG6000 15 g/L
KCl 3g/L
聚氧乙烯苯基醚 3g/L
其余为纯化水 PH=7.2
试剂R2：
PBS缓冲液 50mmol/L
胱硫醚β-合成酶 2KU/L
胱硫醚β-分解酶 20KU/L
BSA 25g/L
NaN3 2g/L
PEG6000 20g/L
KCl 2g/L
聚氧乙烯苯基醚 2g/L
其余为纯化水 PH=7.4
同型半胱氨酸检测试剂盒性能分析：
表1精密度实验
表2 准确度试验
表3 线性范围分析实验
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，其特征在于：试剂R1组分丝氨酸0.5-20mmol/L、HCY还原剂0.5-10mmol/L、NADH 0.5-1.8g/L、LDH 10-200KU/L、缓冲液20-100mmol/L；试剂R2组分为胱硫醚β-合成酶0.5-10KU/L、胱硫醚β-分解酶10-50KU/L、缓冲液20-100mmol/L。
2.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，其使用方法：首先把结合或聚合状态的Hcy,包括复杂的二硫键的聚合状态的Hcy以及蛋白结合的Hcy还原成游离型的Hcy，然后游离型的Hcy与丝氨酸在胱硫醚合成酶（CBS）的作用下形成胱硫醚，形成的胱硫醚在胱硫醚裂解酶（CBL）的作用下形成Hcy、丙酮酸和氨，丙酮酸与NADH（辅酶）在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下反应，NADH转化为NAD+在340nm下每分钟转化的速率直接与Hcy的浓度正相关。
3.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：缓冲液为Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种按任意比组成的混合物，缓冲液的PH值为7.1-7.5。
4.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有电解质，电解质为氯化钠、氯化钾或氯化钙，电解质的质量百分比为0.2-2％。
5.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有表面活性剂，表面活性剂选择Tween系列或聚氧乙烯苯基醚，表面活性剂的质量百分比为0.1-1.0％。
6.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有防腐剂，防腐剂为为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种，防腐剂的浓度为0.1-0.5％(w/v)。
7.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有稳定剂，稳定剂为BSA、蔗糖、山梨糖或海藻糖，稳定剂的浓度为2-5％(w/v)。
8.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有促凝剂，促凝剂是聚乙二醇6000，促凝剂浓度为0.1-1％(w/v)。
9.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，HCY还原剂可以是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇（β-ME）。
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