CN109001467A - 一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂及其制备方法 - Google Patents
一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂及其制备方法，所述试剂包括抗ESPL1蛋白抗体、抗SOCS6蛋白抗体、抗ZFP36蛋白抗体、Tris‑HCl缓冲液、柔性硅纳米线、载体基质液、内源性过氧化物酶阻断剂、DAB显色试剂、H2O2、非免疫羊血清工作液、链霉菌抗生物素‑过氧化物酶溶液、PBS缓冲液；所述制备方法包括：A)柔性硅纳米线的活化；B)配制抗体溶液；C)蛋白抗体与柔性硅纳米线的连接；D)联合蛋白抗体的光催化；E)免疫组化处理。总之，本发明利用ESPL1、SOCS6、ZFP36三种生物标记物联合的方式，用于前列腺癌的预后检测具有灵敏性、特异性和蛋白比活力高等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂及其制备方法。
背景技术
前列腺癌是全球男性生殖系统最常见的恶性肿瘤疾病，对老年男性而言，其发病率在所有恶性肿瘤中居第二位。不同国家的前列腺癌的发病率存在较大差异。美国的前列腺癌发病率已经超越肺癌，成为发病率最高的男性恶性肿瘤。而我国的前列腺癌发病率虽然远低于欧美国家，但近年来呈明显的上升趋势。
当前的临床诊断中主要以前列腺特异抗原(PSA)对前列腺癌和前列腺增生进行鉴别，依据格利森(Gleason)评分来进行前列腺癌病理分级。然而，作为前列腺癌的诊断指标，尽管PSA的敏感性较强，但其特异性不足，研究显示前列腺增生、前列腺炎、急性尿潴留等多种疾病均可引起血浆中PSA增多。因此，开发敏感性高、特异性强、结果稳定的肿瘤标记物是前列腺癌的诊断工作的重点研究方向。
分离酶是由ESPL1(extra spindle pole bodies like 1,separase)基因编码的蛋白酶，它主要在有丝分裂期间切割染色体凝聚素，是姐妹染色单体分离的关键因素之一，姐妹染色单体不分离，必将导致子代细胞出现染色体数目畸变，而染色体数目畸变将会导致肿瘤的形成。
研究显示ESPL1的含量在多种肿瘤组织中的表达出现明显上升，其原因可能是ESPL1过度表达导致动物模型中的非整倍体和肿瘤发生。由于其在细胞周期和DNA损伤修复中的重要性，分离酶的去调节将对细胞的命运和对人体健康产生深远的影响。因此，研究ESPL1在肿瘤细胞差异的细胞周期反应调节机制，有望对前列腺癌预后诊断提供新的辅助诊断标记物。
ZFP36是真核生物基因组中最丰富的一类转录因子，具有广泛的生物学功能：如DNA识别、RNA包装、转录及转录后调控、蛋白折叠和装配及脂质结合，并参与肿瘤的形成和机体免疫干预等。研究显示ZFP36的含量在多种肿瘤组织中出现明显下降，其原因可能是在肿瘤形成过程中，炎症细胞促进肿瘤生长，产生有利于肿瘤生长的微环境，诱发基因突变，促进血管生成。在肿瘤微环境中，炎症细胞、炎症趋化因子、细胞因子调节肿瘤生长、转移和分化，这种调节作用决定着肿瘤的发展方向。
SOCS6是细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)家族蛋白成员之一，与其他SOCS家族成员不同，SOCS6主要涉及受体酪氨酸激酶信号的负调节并涉及细胞增殖、转化和凋亡的调节，在生物体内还能抑制KIT介导的信号通路。SOCS-6通过与干细胞因子受体(KIT)相互作用，SOCS6-蛋白上的SH2结构域直接结合人干细胞因子受体的第567个酪氨酸上，负反馈调节KIT受体介导的信号通路，从而抑制KlT的活化，进而抑制原癌基因的表达。关于SOCS6的研究显示，其蛋白表达水平是细胞正常生长的重要因素，这些研究表明，SOCS6在许多案例中是一个生存信号的负性调节器。研究显示SOCS6的含量在多种肿瘤组织中出现明显下降，尤其是SOCS6表达水平跟前列腺癌患者的预后存在密切的联系。
然而，利用单个基因进行检测的灵敏性和特异性不稳定，并且蛋白比活力较低，虽然通过基因改造制成的融合蛋白能够有效解决上述问题，但是通过基因改造法过程复杂且操作难度较大，自然会造成试剂成本的增加，不利于大规模推广使用。
发明内容
针对以上存在的问题，本发明提供一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂及其制备方法。
本发明的技术方案为：一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂，按照质量比计包括：0.13-0.25％抗ESPL1蛋白抗体、0.13-0.25％抗SOCS6蛋白抗体、0.13-0.25％抗ZFP36蛋白抗体、10.5-12.5％Tris-HCl缓冲液、4.2-5.6％柔性硅纳米线、7.8-9.3％载体基质液、4.6-5.5％内源性过氧化物酶阻断剂、12.3-14.6％DAB显色试剂、2.0-3.0％H2O2、16.5-18.7％非免疫羊血清工作液、10.2-12.4％链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液、余量为PBS缓冲液。
本发明还提供了一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
A)柔性硅纳米线的活化：
a)取上述比例的柔性硅纳米线，依次加入100-200倍质量比的乙醇溶液、30-50倍质量比的氨基酸表面活性剂溶液和10-15倍质量比的聚二甲基硅氧烷，在水浴加热条件下搅拌浸泡110-160min，过滤，将柔性硅纳米线清水和无水乙醇漂洗至无泡；加入乙醇溶液作为活化的溶剂，可预防在长时间的水浴加热过程中发生干化，氨基酸表面活性剂溶液能够对柔性硅纳米线的表面及内部的吸附空腔进行表面清洁和活化，聚二甲基硅氧烷能够增加柔性硅纳米线的柔软性，有利于折叠，此外还能够增加柔性硅纳米线的疏水性，提高与蛋白抗体的吸附结合率。
b)加入载体基质液，搅拌30-60min，得到活化后的柔性硅纳米线溶液，在0-4℃下冷藏；
B)配制抗体溶液：取Tris-HCl缓冲液均分成三等份，将抗ESPL1蛋白抗体、抗SOCS6蛋白抗体、抗ZFP36蛋白抗体分别稀释至0.1-0.3mg/mL的抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液，置于30-37℃恒温下待用；
C)蛋白抗体与柔性硅纳米线的连接：将抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液分批次逐一加入到所述活化后的柔性硅纳米线溶液中，在4-10℃下搅拌20-30h，得到联合蛋白抗体；
D)联合蛋白抗体的光催化：采用波长为320-350nm的蓝光对所述联合蛋白抗体进行30-45min的光催化处理；柔性硅纳米线本身作为光催化剂，用蓝光进行照射后，可提高负载在其上蛋白抗体的荧光强度，有利于提高免疫组织化学检测结果判断的准确率。
E)免疫组化处理：将切片经脱蜡、水化、抗原修复、加入H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂，然后滴加非免疫羊血清工作液进行封闭，加入经步骤D)光催化处理后的联合蛋白抗体在孵育盒中进行过夜，随后经PBS缓冲液冲洗后，再加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育后，经所述DAB显色试剂染色，再经清水冲洗，复染，脱水后封片。
进一步地，所述载体基质液按照质量百分比计包括：1.3-2.8％硫酸乙酰肝素、3.6-5.1％硫酸粘菌素、3.1-3.6％3-磷酸甘油酸、2.8-4.2％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，余量为生理盐水。硫酸乙酰肝素可以保护蛋白质不被降解；硫酸粘菌素可防止细菌感染；3-磷酸甘油酸具有高能磷酸键，能够为抗体蛋白提供能量，提高其活性；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为羧基的活化试剂，可用于活化蛋白质并促进其形成偶联物。
进一步地，步骤a)中所述柔性硅纳米线的活化方法为：在柔性硅纳米线中加入100-200倍质量比的乙醇溶液，升温至95-100℃，再加入30-50倍质量比的氨基酸表面活性剂溶液，于95-100℃下加热40-70min，降温至40-50℃后再加入10-15倍质量比的聚二甲基硅氧烷，搅拌70-90min。在高温下(95-100℃)有利于分子快速扩散，提高氨基酸表面活性剂溶液与柔性硅纳米线的接触效率，此外，高温还有利于增强柔性硅纳米线的柔韧度。在较高温度(40-50℃)下加入聚二甲基硅氧烷，既能保持在一定温度下聚二甲基硅氧烷的渗透率，有能防止因温度过高而发生物料损失。
更进一步地，步骤a)中采用的是超过声波搅拌棒进行搅拌，超声波频率为25-40KHz，由于柔性硅纳米线的表面积及吸附位点过小，通过普通的搅拌很难对其内部进行充分浸润和活化，因此需要通过超声波进行振捣，提高接触效率。
更进一步地，步骤a)中所述氨基酸表面活性剂溶液为月桂酰基谷氨酸盐溶液、椰油酰基丙氨酸盐溶液、肉豆蔻酸谷氨酸盐溶液、椰油酰甘氨酸盐溶液、椰油酰丙氨酸盐溶液中的一种或任意几种。
进一步地，步骤C)中所述分批次逐一添加的具体方法为：将抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液分别均分为6-10份，按照ESPL1-SOCS6-ZFP36的顺序将蛋白抗体溶液依次单独滴加到柔性硅纳米线溶液中，滴加速度为20-40滴/min，搅拌速度为60-100r/min。如果将三种蛋白抗体溶液同时加入，容易造成柔性硅纳米线的选择性吸附，导致三种蛋白抗体吸附不均匀，最终影响联合检测的准确度，通过单独、少量、轮流、批次滴加的方式可最大化的解决上述问题。
进一步地，步骤D)中所述光催化的具体方法为：采用波长为320-350nm的蓝光的石英光纤芯对所述联合蛋白抗体进行搅拌，搅拌速度为20-30r/min。通过石英光纤芯在联合蛋白抗体进行搅拌，可提高光能的利用率即催化效率。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明将抗ESPL1蛋白抗体、抗SOCS6蛋白抗体、抗ZFP36蛋白抗体采用物理吸附到柔性硅纳米线载体上，形成联合蛋白抗体，其中，相较于传统的微球结构载体，线性结构的柔性硅纳米线可最大化程度的将三种蛋白抗体呈线性联合，相较于微球结构载体上的叠加式联合蛋白，蛋白比活力提高了12.3％，相较于单一蛋白抗体，蛋白比活力提高了42.3-44.7％；
(2)本发明作为载体的柔性硅纳米线本身作为光催化剂，用蓝光进行照射后，可提高负载在其上蛋白抗体的荧光强度，有利于提高免疫组织化学检测结果判断的准确率。
总之，本发明的检测试剂利用ESPL1、SOCS6、ZFP36三种生物标记物联合的方式，为前列腺癌的诊断及前列腺癌患者术后复发转移率，术后复发转移时间和生存时间的预测提供了一种切实可行的方法。
具体实施方式
实施例1
一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂，按照质量比计包括：0.13％抗ESPL1蛋白抗体、0.13％抗SOCS6蛋白抗体、0.13％抗ZFP36蛋白抗体、10.5％Tris-HCl缓冲液、4.2％柔性硅纳米线、7.8％载体基质液、4.6％内源性过氧化物酶阻断剂、12.3％DAB显色试剂、2.0％H2O2、16.5％非免疫羊血清工作液、10.2％链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液、余量为PBS缓冲液；
所述载体基质液按照质量百分比计包括：1.3％硫酸乙酰肝素、3.6％硫酸粘菌素、3.1％3-磷酸甘油酸、2.8％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，余量为生理盐水。硫酸乙酰肝素可以保护蛋白质不被降解；硫酸粘菌素可防止细菌感染；3-磷酸甘油酸具有高能磷酸键，能够为抗体蛋白提供能量，提高其活性；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为羧基的活化试剂，可用于活化蛋白质并促进其形成偶联物。
该测试剂的制备方法，包括以下步骤：
A)柔性硅纳米线的活化：
a)在柔性硅纳米线中加入100倍质量比的乙醇溶液，升温至95℃，再加入30倍质量比的氨基酸表面活性剂溶液(月桂酰基谷氨酸盐溶液)，于95℃下加热40min，降温至40℃后再加入10倍质量比的聚二甲基硅氧烷，搅拌70min。过滤，将柔性硅纳米线清水和无水乙醇漂洗至无泡；加入乙醇溶液作为活化的溶剂，可预防在长时间的水浴加热过程中发生干化，氨基酸表面活性剂溶液能够对柔性硅纳米线的表面及内部的吸附空腔进行表面清洁和活化，并且在高温下(95℃)有利于分子快速扩散，提高氨基酸表面活性剂溶液与柔性硅纳米线的接触效率，此外，高温还有利于增强柔性硅纳米线的柔韧度。聚二甲基硅氧烷能够增加柔性硅纳米线的柔软性，有利于折叠，此外还能够增加柔性硅纳米线的疏水性，提高与蛋白抗体的吸附结合率，在较高温度(40℃)下加入聚二甲基硅氧烷，既能保持在一定温度下聚二甲基硅氧烷的渗透率，有能防止因温度过高而发生物料损失。均采用的是超过声波搅拌棒进行搅拌，超声波频率为25KHz，由于柔性硅纳米线的表面积及吸附位点过小，通过普通的搅拌很难对其内部进行充分浸润和活化，因此需要通过超声波进行振捣，提高接触效率。
b)加入载体基质液，搅拌30min，得到活化后的柔性硅纳米线溶液，在0-4℃下冷藏；
B)配制抗体溶液：取Tris-HCl缓冲液均分成三等份，将抗ESPL1蛋白抗体、抗SOCS6蛋白抗体、抗ZFP36蛋白抗体分别稀释至0.1mg/mL的抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液，置于30℃恒温下待用；
C)蛋白抗体与柔性硅纳米线的连接：将抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液分别均分为6份，按照ESPL1-SOCS6-ZFP36的顺序将蛋白抗体溶液依次单独滴加到柔性硅纳米线溶液中，滴加速度为20滴/min，搅拌速度为60r/min，在4℃下搅拌20h，得到联合蛋白抗体。如果将三种蛋白抗体溶液同时加入，容易造成柔性硅纳米线的选择性吸附，导致三种蛋白抗体吸附不均匀，最终影响联合检测的准确度，通过单独、少量、轮流、批次滴加的方式可最大化的解决上述问题。
D)联合蛋白抗体的光催化：采用波长为320nm的蓝光的石英光纤芯对所述联合蛋白抗体进行搅拌，搅拌速度为20r/min，对所述联合蛋白抗体进行30min的光催化处理；柔性硅纳米线本身作为光催化剂，用蓝光进行照射后，可提高负载在其上蛋白抗体的荧光强度，有利于提高免疫组织化学检测结果判断的准确率。通过石英光纤芯在联合蛋白抗体进行搅拌，可提高光能的利用率即催化效率。
E)免疫组化处理：将切片经脱蜡、水化、抗原修复、加入H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂，然后滴加非免疫羊血清工作液进行封闭，加入经步骤D)光催化处理后的联合蛋白抗体在孵育盒中进行过夜，随后经PBS缓冲液冲洗后，再加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育后，经所述DAB显色试剂染色，再经清水冲洗，复染，脱水后封片。
对所有的免疫染色切片由两个病理科医师盲法进行独立评分，具体方法为：在Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，若细胞浆中出现棕黄色颗粒则被认为是阳性信号。染色强度分为4级：无色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为4分；阳性细胞率分为5级：0分，阳性细胞率0-5％；1分，阳性细胞率6-10％；2分，阳性细胞率11-50％；3分，阳性细胞率5-75％；4分，阳性细胞率76-100％。每个标本的总分是都是由细胞的染色强度和阳性细胞率得分的乘积所得，0分，阴性；1-4分，弱阳性；5-8分，阳性；9-12分，强阳性。
实施例2
一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂，按照质量比计包括：0.19％抗ESPL1蛋白抗体、0.139％抗SOCS6蛋白抗体、0.19％抗ZFP36蛋白抗体、11.5％Tris-HCl缓冲液、4.9％柔性硅纳米线、8.55％载体基质液、5.05％内源性过氧化物酶阻断剂、13.45％DAB显色试剂、2.5％H2O2、17.6％非免疫羊血清工作液、11.3％链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液、余量为PBS缓冲液；
所述载体基质液按照质量百分比计包括：2.05％硫酸乙酰肝素、4.35％硫酸粘菌素、3.35％3-磷酸甘油酸、3.5％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，余量为生理盐水。硫酸乙酰肝素可以保护蛋白质不被降解；硫酸粘菌素可防止细菌感染；3-磷酸甘油酸具有高能磷酸键，能够为抗体蛋白提供能量，提高其活性；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为羧基的活化试剂，可用于活化蛋白质并促进其形成偶联物。
该测试剂的制备方法，包括以下步骤：
A)柔性硅纳米线的活化：
a)在柔性硅纳米线中加入150倍质量比的乙醇溶液，升温至97℃，再加入40倍质量比的氨基酸表面活性剂溶液(椰油酰基丙氨酸盐溶液)，于97℃下加热55min，降温至45℃后再加入12.5倍质量比的聚二甲基硅氧烷，搅拌80min。过滤，将柔性硅纳米线清水和无水乙醇漂洗至无泡；加入乙醇溶液作为活化的溶剂，可预防在长时间的水浴加热过程中发生干化，氨基酸表面活性剂溶液能够对柔性硅纳米线的表面及内部的吸附空腔进行表面清洁和活化，并且在高温下(97℃)有利于分子快速扩散，提高氨基酸表面活性剂溶液与柔性硅纳米线的接触效率，此外，高温还有利于增强柔性硅纳米线的柔韧度。聚二甲基硅氧烷能够增加柔性硅纳米线的柔软性，有利于折叠，此外还能够增加柔性硅纳米线的疏水性，提高与蛋白抗体的吸附结合率，在较高温度(45℃)下加入聚二甲基硅氧烷，既能保持在一定温度下聚二甲基硅氧烷的渗透率，有能防止因温度过高而发生物料损失。均采用的是超过声波搅拌棒进行搅拌，超声波频率为32.5KHz，由于柔性硅纳米线的表面积及吸附位点过小，通过普通的搅拌很难对其内部进行充分浸润和活化，因此需要通过超声波进行振捣，提高接触效率。
b)加入载体基质液，搅拌45min，得到活化后的柔性硅纳米线溶液，在0-4℃下冷藏；
B)配制抗体溶液：取Tris-HCl缓冲液均分成三等份，将抗ESPL1蛋白抗体、抗SOCS6蛋白抗体、抗ZFP36蛋白抗体分别稀释至0.1-0.3mg/mL的抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液，置于33℃恒温下待用；
C)蛋白抗体与柔性硅纳米线的连接：将抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液分别均分为8份，按照ESPL1-SOCS6-ZFP36的顺序将蛋白抗体溶液依次单独滴加到柔性硅纳米线溶液中，滴加速度为30滴/min，搅拌速度为80r/min，在7℃下搅拌25h，得到联合蛋白抗体。如果将三种蛋白抗体溶液同时加入，容易造成柔性硅纳米线的选择性吸附，导致三种蛋白抗体吸附不均匀，最终影响联合检测的准确度，通过单独、少量、轮流、批次滴加的方式可最大化的解决上述问题。
D)联合蛋白抗体的光催化：采用波长为335nm的蓝光的石英光纤芯对所述联合蛋白抗体进行搅拌，搅拌速度为25r/min，对所述联合蛋白抗体进行37.5min的光催化处理；柔性硅纳米线本身作为光催化剂，用蓝光进行照射后，可提高负载在其上蛋白抗体的荧光强度，有利于提高免疫组织化学检测结果判断的准确率。通过石英光纤芯在联合蛋白抗体进行搅拌，可提高光能的利用率即催化效率。
E)免疫组化处理：将切片经脱蜡、水化、抗原修复、加入H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂，然后滴加非免疫羊血清工作液进行封闭，加入经步骤D)光催化处理后的联合蛋白抗体在孵育盒中进行过夜，随后经PBS缓冲液冲洗后，再加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育后，经所述DAB显色试剂染色，再经清水冲洗，复染，脱水后封片。
对所有的免疫染色切片由两个病理科医师盲法进行独立评分，具体方法为：在Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，若细胞浆中出现棕黄色颗粒则被认为是阳性信号。染色强度分为4级：无色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为4分；阳性细胞率分为5级：0分，阳性细胞率0-5％；1分，阳性细胞率6-10％；2分，阳性细胞率11-50％；3分，阳性细胞率5-75％；4分，阳性细胞率76-100％。每个标本的总分是都是由细胞的染色强度和阳性细胞率得分的乘积所得，0分，阴性；1-4分，弱阳性；5-8分，阳性；9-12分，强阳性。
实施例3
一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂，按照质量比计包括：0.25％抗ESPL1蛋白抗体、0.25％抗SOCS6蛋白抗体、0.25％抗ZFP36蛋白抗体、12.5％Tris-HCl缓冲液、5.6％柔性硅纳米线、9.3％载体基质液、5.5％内源性过氧化物酶阻断剂、14.6％DAB显色试剂、3.0％H2O2、18.7％非免疫羊血清工作液、12.4％链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液、余量为PBS缓冲液；
所述载体基质液按照质量百分比计包括：2.8％硫酸乙酰肝素、5.1％硫酸粘菌素、3.6％3-磷酸甘油酸、4.2％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，余量为生理盐水。硫酸乙酰肝素可以保护蛋白质不被降解；硫酸粘菌素可防止细菌感染；3-磷酸甘油酸具有高能磷酸键，能够为抗体蛋白提供能量，提高其活性；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为羧基的活化试剂，可用于活化蛋白质并促进其形成偶联物。
该测试剂的制备方法，包括以下步骤：
A)柔性硅纳米线的活化：
a)在柔性硅纳米线中加入200倍质量比的乙醇溶液，升温至100℃，再加入50倍质量比的氨基酸表面活性剂溶液(肉豆蔻酸谷氨酸盐溶液)，于100℃下加热70min，降温至50℃后再加入15倍质量比的聚二甲基硅氧烷，搅拌90min。过滤，将柔性硅纳米线清水和无水乙醇漂洗至无泡；加入乙醇溶液作为活化的溶剂，可预防在长时间的水浴加热过程中发生干化，氨基酸表面活性剂溶液能够对柔性硅纳米线的表面及内部的吸附空腔进行表面清洁和活化，并且在高温下(100℃)有利于分子快速扩散，提高氨基酸表面活性剂溶液与柔性硅纳米线的接触效率，此外，高温还有利于增强柔性硅纳米线的柔韧度。聚二甲基硅氧烷能够增加柔性硅纳米线的柔软性，有利于折叠，此外还能够增加柔性硅纳米线的疏水性，提高与蛋白抗体的吸附结合率，在较高温度(50℃)下加入聚二甲基硅氧烷，既能保持在一定温度下聚二甲基硅氧烷的渗透率，有能防止因温度过高而发生物料损失。均采用的是超过声波搅拌棒进行搅拌，超声波频率为40KHz，由于柔性硅纳米线的表面积及吸附位点过小，通过普通的搅拌很难对其内部进行充分浸润和活化，因此需要通过超声波进行振捣，提高接触效率。
b)加入载体基质液，搅拌60min，得到活化后的柔性硅纳米线溶液，在0-4℃下冷藏；
B)配制抗体溶液：取Tris-HCl缓冲液均分成三等份，将抗ESPL1蛋白抗体、抗SOCS6蛋白抗体、抗ZFP36蛋白抗体分别稀释至0.3mg/mL的抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液，置于37℃恒温下待用；
C)蛋白抗体与柔性硅纳米线的连接：将抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液分别均分为10份，按照ESPL1-SOCS6-ZFP36的顺序将蛋白抗体溶液依次单独滴加到柔性硅纳米线溶液中，滴加速度为40滴/min，搅拌速度为100r/min，在10℃下搅拌30h，得到联合蛋白抗体。如果将三种蛋白抗体溶液同时加入，容易造成柔性硅纳米线的选择性吸附，导致三种蛋白抗体吸附不均匀，最终影响联合检测的准确度，通过单独、少量、轮流、批次滴加的方式可最大化的解决上述问题。
D)联合蛋白抗体的光催化：采用波长为350nm的蓝光的石英光纤芯对所述联合蛋白抗体进行搅拌，搅拌速度为30r/min，对所述联合蛋白抗体进行45min的光催化处理；柔性硅纳米线本身作为光催化剂，用蓝光进行照射后，可提高负载在其上蛋白抗体的荧光强度，有利于提高免疫组织化学检测结果判断的准确率。通过石英光纤芯在联合蛋白抗体进行搅拌，可提高光能的利用率即催化效率。
E)免疫组化处理：将切片经脱蜡、水化、抗原修复、加入H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂，然后滴加非免疫羊血清工作液进行封闭，加入经步骤D)光催化处理后的联合蛋白抗体在孵育盒中进行过夜，随后经PBS缓冲液冲洗后，再加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育后，经所述DAB显色试剂染色，再经清水冲洗，复染，脱水后封片。
对所有的免疫染色切片由两个病理科医师盲法进行独立评分，具体方法为：在Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，若细胞浆中出现棕黄色颗粒则被认为是阳性信号。染色强度分为4级：无色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为4分；阳性细胞率分为5级：0分，阳性细胞率0-5％；1分，阳性细胞率6-10％；2分，阳性细胞率11-50％；3分，阳性细胞率5-75％；4分，阳性细胞率76-100％。每个标本的总分是都是由细胞的染色强度和阳性细胞率得分的乘积所得，0分，阴性；1-4分，弱阳性；5-8分，阳性；9-12分，强阳性。
实施例4
本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于采用抗ESPL1蛋白抗体一种抗体。
实施例5
本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于采用抗SOCS6蛋白抗体一种抗体。
实施例6
本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于采用抗ZFP36蛋白抗体一种抗体。
实施例7
本实施例与实施例2基本相同，不同之处在于，采用聚苯乙烯微球替换柔性硅纳米线。
试验例
选取广州市第一人民医院住院及门诊PCa患者200例，患者平均年龄65岁，将临床手术切下的前列腺癌组织或增生组织、穿刺活检组织，液氮速冻收集保存，获得200份病理组织样本。
(1)关于实施例1-6蛋白表达的灵敏性和特异性比较，结果如表1所示。
表1：单独蛋白和联合蛋白表达的灵敏性和特异性比较
| 组别 | 蛋白 | 灵敏性 | 特异性 |
| 实施例1 | ESPL1-SOCS6-ZFP3 | 74.5％ | 82.5％ |
| 实施例2 | ESPL1-SOCS6-ZFP3 | 77.3％ | 88.2％ |
| 实施例3 | ESPL1-SOCS6-ZFP3 | 72.4％ | 83.6％ |
| 实施例4 | ESPL1 | 56.1％ | 65.5％ |
| 实施例5 | SOCS6 | 47.9％ | 58.3％ |
| 实施例6 | ZFP36 | 42.7％ | 56.7％ |
结果：由表1可看出，三种蛋白联合后，其表达的灵敏性和特异性均高于三种蛋白单独表达的结果，其中，实施例2的方案中结果最优，灵敏性和特异性分别高达77.3％和88.2％。
(2)关于实施例2、实施例4-7蛋白比活力比较，结果如表2所示。
表2：实施例2、实施例4-7蛋白比活力比较
| 组别 | 蛋白 | 载体 | 蛋白比活力 |
| 实施例2 | ESPL1-SOCS6-ZFP36 | 柔性硅纳米线 | 84.9％ |
| 实施例4 | ESPL1 | 柔性硅纳米线 | 40.2％ |
| 实施例5 | SOCS6 | 柔性硅纳米线 | 41.3％ |
| 实施例6 | ZFP36 | 柔性硅纳米线 | 42.6％ |
| 实施例7 | ESPL1-SOCS6-ZFP36 | 聚苯乙烯微球 | 72.6％ |
结果：由表2可看出，由柔性硅纳米线联合的蛋白比活力最高，为84.9％，其次为由聚苯乙烯微球联合的蛋白比活力，为72.6％，都远高于单独蛋白的比活力。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂，其特征在于，按照质量比计包括：0.13-0.25％抗ESPL1蛋白抗体、0.13-0.25％抗SOCS6蛋白抗体、0.13-0.25％抗ZFP36蛋白抗体、10.5-12.5％Tris-HCl缓冲液、4.2-5.6％柔性硅纳米线、7.8-9.3％载体基质液、4.6-5.5％内源性过氧化物酶阻断剂、12.3-14.6％DAB显色试剂、2.0-3.0％H2O2、16.5-18.7％非免疫羊血清工作液、10.2-12.4％链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液、余量为PBS缓冲液。
2.如权利要求1所述的一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)柔性硅纳米线的活化：
a)取上述比例的柔性硅纳米线，依次加入100-200倍质量比的乙醇溶液、30-50倍质量比的氨基酸表面活性剂溶液和10-15倍质量比的聚二甲基硅氧烷，在水浴加热条件下搅拌浸泡110-160min，过滤，将柔性硅纳米线清水和无水乙醇漂洗至无泡；
b)加入载体基质液，搅拌30-60min，得到活化后的柔性硅纳米线溶液，在0-4℃下冷藏；
B)配制抗体溶液：取Tris-HCl缓冲液均分成三等份，将抗ESPL1蛋白抗体、抗SOCS6蛋白抗体、抗ZFP36蛋白抗体分别稀释至0.1-0.3mg/mL的抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液，置于30-37℃恒温下待用；
C)蛋白抗体与柔性硅纳米线的连接：将抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液分批次逐一加入到所述活化后的柔性硅纳米线溶液中，在4-10℃下搅拌20-30h，得到联合蛋白抗体；
D)联合蛋白抗体的光催化：采用波长为320-350nm的蓝光对所述联合蛋白抗体进行30-45min的光催化处理；
E)免疫组化处理：将切片经脱蜡、水化、抗原修复、加入H2O2和内源性过氧化物酶阻断剂，然后滴加非免疫羊血清工作液进行封闭，加入经步骤D)光催化处理后的联合蛋白抗体在孵育盒中进行过夜，随后经PBS缓冲液冲洗后，再加入链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液孵育后，经所述DAB显色试剂染色，再经清水冲洗，复染，脱水后封片。
3.如权利要求1所述的一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂，其特征在于，所述载体基质液按照质量百分比计包括：1.3-2.8％硫酸乙酰肝素、3.6-5.1％硫酸粘菌素、3.1-3.6％3-磷酸甘油酸、2.8-4.2％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，余量为生理盐水。
4.如权利要求2所述的一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述柔性硅纳米线的活化方法为：在柔性硅纳米线中加入100-200倍质量比的乙醇溶液，升温至95-100℃，再加入30-50倍质量比的氨基酸表面活性剂溶液，于95-100℃下加热40-70min，降温至40-50℃后再加入10-15倍质量比的聚二甲基硅氧烷，搅拌70-90min。
5.如权利要求2或4所述的一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤a)中采用的是超过声波搅拌棒进行搅拌，超声波频率为25-40KHz。
6.如权利要求2或4所述的一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤a)中所述氨基酸表面活性剂溶液为月桂酰基谷氨酸盐溶液、椰油酰基丙氨酸盐溶液、肉豆蔻酸谷氨酸盐溶液、椰油酰甘氨酸盐溶液、椰油酰丙氨酸盐溶液中的一种或任意几种。
7.如权利要求2所述的一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤C)中所述分批次逐一添加的具体方法为：将抗ESPL1蛋白抗体溶液、抗SOCS6蛋白抗体溶液、抗ZFP36蛋白抗体溶液分别均分为6-10份，按照ESPL1-SOCS6-ZFP36的顺序将蛋白抗体溶液依次单独滴加到柔性硅纳米线溶液中，滴加速度为20-40滴/min，搅拌速度为60-100r/min。
8.如权利要求2所述的一种用于前列腺癌的基因联合预后检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤C)中所述分批次逐一添加的具体方法为：按照ESPL1-SOCS6-ZFP36的顺序将蛋白抗体溶液依次单独滴加到柔性硅纳米线溶液中，滴加速度为20-40滴/min，搅拌速度为60-100r/min。
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