CN109001177A - 一种尿液中酪氨酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种尿液中酪氨酸的检测方法，具体是一种表面增强拉曼光谱检测方法。将偶氮化的酪氨酸与立方纳米银混合后滴在超疏水银膜上，待其干后在拉曼光谱仪下检测偶氮化酪氨酸的拉曼信号。该方法的优点在于利用立方纳米银的增强效果和超疏水银膜的收缩作用结合酪氨酸的重氮偶联反应来间接检测酪氨酸的浓度。该方法对酪氨酸溶液的检测极限浓度达到10‑ 12mol/L，对尿液中的酪氨酸的检测极限浓度达到10‑8mol/L，实现超痕量检测，具有较高的准确性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及尿液中氨基酸检测技术领域，特别涉及一种尿液中酪氨酸的检测方法。
背景技术
酪氨酸是人体重要的半必需氨基酸，它是人体中合成多种蛋白类激素的重要原料，是机体生物合成儿茶酚胺的前身物质。因酪氨酸代谢异常导致的疾病包括白化病、阿尔茨海默症、苯丙酮酸尿症、白癜风和帕金森等。在正常个体中其含量相对稳定，而在肿瘤患者体液中，酪氨酸含量与健康人相比会有比较大的差异。体液代谢产物同样可以作为早期发现和监测多种肿瘤进程的标志物，肿瘤病人尿液中酚类代谢物排出量增加。在酪氨酸的研究中，以血清中酪氨酸及其代谢产物的研究相对较多，而对人体尿液中酪氨酸研究相对较少。血清肿瘤标志物存在操作繁琐，成本高，有创性，早期检出率不高等缺点。因此，探索酪氨酸含量的分析新技术并应用于尿液样品测定，对癌症的辅助诊断、治疗和监测具有十分重要的临床意义。
表面增强拉曼散射(SERS)技术因其高灵敏度，高选择性，非破坏性，操作简单等优点而被广泛应用。立方纳米银有8个尖角，12条棱边，由于热点效应，使光场局域于边角处，极大增强了该处的电场强度，其规整的平面结构使立方纳米银具有分散性较好的特点，这些特点使得立方纳米银基底具有很好的增强效果。超疏水银膜的收缩过程，可以富集分析物以达到痕量检测。可以实时监测分析物与纳米银胶体混合后在超疏水性银膜上的吸附的动态过程。
中国专利号(CN 107014806A)公开了一种尿液中酪氨酸的检测试纸，利用生物复合酶催化酪氨酸发生特异性显色反应；中国专利(CN 201510962013.1)公开了一种用于检测人体尿液中酪氨酸类肿瘤标志物的试剂，由硝酸汞溶液、硫酸汞溶液、硝酸镍溶液、硫酸钴溶液组成；中国专利(CN 201510537446.2)公开了一种对羟基苯丙氨酸酪氨酸尿液检测试剂，试剂含有H+、Ni2+、Hg+、NO3-离子和磷钼酸和/或磷钼酸可溶性盐。现有的尿液中的酪氨酸的检测的专利的反应原理一般都是通过显色反应，这些方法仍存在许多不足之处，灵敏度低，检测结果不准确，容易受尿液颜色的干扰。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种通过重氮偶联反应，将偶氮化的酪氨酸与立方纳米银混合后滴在超疏水银膜上，利用表面增强拉曼光谱技术检测尿液中的酪氨酸的新方法。本发明快速简单，灵敏度高，立方纳米银拉曼基底材料形貌均匀，拉曼活性高。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种尿液中的酪氨酸检测方法，包括以下步骤：
(1)由一步水热法制备立方纳米银，得到粒径大小分布均匀的立方纳米银；
(2)将对氨基苯硫酚与亚硝酸钠在冰浴条件下反应，生成重氮化合物，再加入碳酸钠调节pH使整个溶液处于碱性环境下，与5-7个不同浓度梯度的酪氨酸混合生成偶氮染料；
(3)制备超疏水银膜；
(4)取步骤(2)制备的不同浓度梯度的偶氮染料分别与步骤(1)制备的立方纳米银混合，滴在步骤(3)中的超疏水银膜上，静置1000s-2000s后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，采集偶氮染料的SERS光谱，建立拉曼光谱强度-酪氨酸浓度的关系绘制标准曲线；
(5)检测未知样品浓度：将未知浓度的待检测的尿液与步骤(1)制备的立方纳米银混合，滴在超疏水银膜上，待其干后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行测试，得到拉曼光谱谱线强度，通过公式算出酪氨酸的浓度。
优选的，所述步骤(4)的静置时间为1500s。
进一步的，步骤(1)的具体步骤为：首先配置银氨溶液，然后将5mL银氨溶液与5mL浓度为20-50mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵、10mL浓度为1-10mmol/L的葡萄糖溶液充分混合后，将上述混合液倒入水热反应釜中置于烘箱中加热反应，反应时间8小时，反应温度为120℃，得到纳米银胶体。
进一步的，步骤(2)的具体步骤为：将1mL对氨基苯硫酚(10-3mol/L)与1mL亚硝酸钠5％-8％(质量分数)在冰浴下反应生成重氮化合物，再加入1mL碳酸钠8％-10％(质量分数)调节pH使整个溶液处于碱性条件下，与2mL不同浓度的酪氨酸混合生成偶氮染料。
进一步的，步骤(3)具体步骤为：超疏水银膜是通过银镜反应在玻璃片上镀一层银，首先配置银氨溶液，将一定量的氨水加入到50mL 2％(质量分数)的AgNO3溶液中，再加入2mL 6％(质量分数)葡萄糖溶液于银氨溶液中，然后将清洗干净的玻璃板放入上述溶液中于75℃水浴加热10分钟后，将制备好的银膜浸泡于十二烷基硫醇的乙醇溶液(10-3mol/L)中12小时后，从溶液中取出风干。
进一步的，步骤(4)中，所述5-7个浓度梯度的酪氨酸溶液样品的浓度变化值为10- 6mol/L-10-12mol/L。
进一步的，步骤(4)中酪氨酸的浓度为10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L，10-12mol/L。
进一步的，所述立方纳米银的粒径为40-80nm。
进一步的，拉曼测试的激发波长为785nm。
与现有方法相比，本发明具有的有益效果在于：
1.本发明采用酪氨酸的重氮偶联反应间接检测酪氨酸的浓度，得到的偶氮染料作为探针分子，通过偶氮染料的特征峰来间接判断酪氨酸的存在。该方法简便、高效、灵敏度高，不仅仅能定性分析出尿液中酪氨酸的存在，还能定量检测人尿液中酪氨酸的含量，对于肿瘤病人的早期筛查存在潜在价值。
2.本发明采用一步水热法制备出颗粒大小均匀的立方纳米银基底，立方纳米银有8个尖角，12条棱边，由于热点效应，使光场局域于边角处，极大增强了该处的电场强度，产生热点效应，这使它具有较高的活性和增强效果。
3.本发明选用超疏水银膜作为衬底进行拉曼检测。利用超疏水银膜的收缩作用提高了酪氨酸的检测极限。因为超疏水银膜的收缩过程，可以将扩散分析物富集以检测痕量分子。同时，探针分子在超疏水银膜上的收缩过程是一个从湿态到干态的动态过程，干态是最佳的检测状态。
附图说明
图1是实施例1的立方纳米银的透射电镜(TEM)图；
图2是实施例1不同时间段的酪氨酸偶氮染料(10-6mol/L)的动态拉曼光谱图；
图3是实施例2的酪氨酸偶氮染料三个特征峰强度随时间变化图；
图4是实施例2的不同浓度(10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L，10-12mol/L)酪氨酸的表面增强拉曼光谱图；
图5是实施例1的偶氮化合物的特征峰强度(1142±2cm-1，1393±2cm-11432±2cm-1)与酪氨酸浓度的线性关系示意图；
图6是应用实施例1的不同浓度(10-4mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L，10-7mol/L，10- 8mol/L)尿液中的酪氨酸的偶氮盐的表面增强拉曼光谱；
图7是应用实施例1的尿液中的偶氮化合物特征峰强度1393±2cm-1与尿液中酪氨酸浓度的线性关系示意图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
(1)水热法制备立方纳米银
首先配置银氨溶液，取0.01mol/L的硝酸银水溶液，滴加稀氨水2％(质量分数，下同)溶液从澄清到沉淀再到沉淀恰好消失为止。5mL配好的银氨溶液和5mL十六烷基三甲基溴化铵(20mmol/L)再加上10mL葡萄糖溶液(10mmol/L)，充分搅拌混合均匀后倒入25mL的水热反应釜中，将反应釜置于烘箱中120℃反应8h。反应结束后自然冷却至室温，通过10000rpm离心20min，洗涤三次，除去多余的十六烷基三甲基溴化铵。得到直径为75nm，颗粒大小均匀的立方纳米银，如图1所示。
(2)酪氨酸的重氮偶联反应
在冰浴中，首先取1mL对氨基苯硫酚(10-3mol/L)于试管中，加1mL亚硝酸钠水溶液(5％)，搅拌1min.然后将1mL碳酸钠(8％)与2mL浓度为10-6mol/L的酪氨酸同时快速加进试管中搅拌反应1min，生成偶氮染料。结构如下所示：
(3)酪氨酸浓度的测定
取1.5μL偶氮化的酪氨酸与立方纳米银混合后滴加在超疏水银膜上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，激发波长为785nm，采集偶氮盐的SERS光谱。用10-6mol/L偶氮化的酪氨酸作为探针分子，从湿态测到干态，发现探针分子处于干态的时候拉曼信号是最稳定的，如图2所示。在1000s前，几乎没有拉曼信号，这是因为在初始阶段，溶胶中的纳米粒子在无规则的做布朗运动，这时处于湿态；1500s的时候拉曼强度达到最大，但是随后拉曼强度又急速下降，这个过程时间太短而不能准确测量探针分子信号；静置1500s时，拉曼信号最强，2000s后，探针分子的拉曼信号处于一个平稳状态，峰强处于一个平台不再波动，这时处于干态。
实施例2
(1)水热法制备立方纳米银
首先配置银氨溶液，取0.01mol/L的硝酸银水溶液，滴加稀氨水2％(质量分数，下同)溶液从澄清到沉淀再到沉淀恰好消失为止。5mL配好的银氨溶液和5mL十六烷基三甲基溴化铵(20mmol/L)再加上10mL葡萄糖溶液(10mmol/L)，充分搅拌混合均匀后倒入25mL的水热反应釜中，将反应釜置于烘箱中120℃反应8h，反应结束后自然冷却至室温，通过10000rpm离心20min，洗涤三次，除去多余的十六烷基三甲基溴化铵，得到直径为50nm，颗粒大小均匀的立方纳米银，如图1所示。
(2)酪氨酸的重氮偶联反应
在冰浴中，首先取1mL对氨基苯硫酚(10-3mol/L)于试管中，加1mL亚硝酸钠水溶液(5％)，搅拌1min，然后将1mL碳酸钠(8％)与2mL不同浓度的酪氨酸(10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L，10-12mol/L)同时快速加进试管中搅拌反应1min，生成偶氮染料。
(3)酪氨酸浓度的测定
取1.5μL偶氮化的酪氨酸与立方纳米银混合后滴加在超疏水银膜上，静置1500s后，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，激发波长为785nm，采集偶氮盐的SERS光谱，如图3所示，测定不同浓度的酪氨酸的表面增强拉曼光谱。如图4所示，随着酪氨酸浓度逐渐增加，其对应的拉曼光谱信号也逐渐增强，根据偶氮化合物的特征峰1142±2cm-1，1393±2cm-1，1432±2cm-1与酪氨酸浓度的关系绘制标准曲线。如图5所示，各特征峰的浓度与信号强度的线性拟合度较好，其中以1432±2cm-1处特征峰绘制的标准曲线线性拟合度最好。
实施例3
(1)水热法制备立方纳米银
首先配置银氨溶液，取0.01mol/L的硝酸银水溶液，滴加稀氨水2％(质量分数，下同)溶液从澄清到沉淀再到沉淀恰好消失为止。5mL配好的银氨溶液和5mL十六烷基三甲基溴化铵(30mmol/L)再加上10mL葡萄糖溶液(5mmol/L)，充分搅拌混合均匀后倒入25mL的水热反应釜中，将反应釜置于烘箱中120℃反应8h。反应结束后自然冷却至室温，通过10000rpm离心20min，洗涤三次，除去多余的十六烷基三甲基溴化铵。得到直径为75nm，颗粒大小均匀的立方纳米银，如图1所示。
(2)酪氨酸的重氮偶联反应
在冰浴中，首先取1mL对氨基苯硫酚(10-3mol/L)于试管中，加1mL亚硝酸钠水溶液(8％)，搅拌3min.然后将1mL碳酸钠(10％)与2mL不同浓度的酪氨酸(10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L，10-12mol/L)同时快速加进试管中搅拌反应1min，生成偶氮染料。
(3)酪氨酸浓度的测定
取1.5μL偶氮化的酪氨酸与立方纳米银混合后滴加在超疏水银膜上，静置1500s后，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，激发波长为785nm，采集偶氮盐的SERS光谱。
应用实施例1检测尿液中酪氨酸的含量
在该应用中，前面的步骤与实施例2中的步骤(1)相同。
(1)取健康青年的尿液样，用不同浓度的酪氨酸溶液稀释为10-4mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L。在冰浴中，首先取1mL对氨基苯硫酚(10-3mol/L)于试管中，加1mL亚硝酸钠水溶液(5％)，搅拌1min。然后将1mL碳酸钠(10％)与2mL不同浓度的酪氨酸尿液溶液(10-4mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L，10-7mol/L，10-8mol/L)同时快速加入试管中搅拌1min，生成偶氮染料，同时直接制备空白健康青年的尿液作为对照。
(2)取1.5μL尿液中偶氮化的酪氨酸与1.5μL立方纳米银混合后滴加在超疏水银膜上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，激发波长为785nm，采集尿液中酪氨酸偶氮盐的SERS光谱。如图6所示，从图中可见，直接检测空白尿液，偶氮化合物拉曼信号不明显，但是还存在，说明正常人尿液中也存在着微量的酪氨酸；而加入不同浓度酪氨酸后的尿液可以观测到明显的偶氮化合物的拉曼信号，表明该方法可应用于尿液中的酪氨酸的分析检测。如图7所示，1393±2cm-1特征峰的浓度与拉曼信号强度的线性拟合度较好，说明尿液中的尿素对于酪氨酸的影响较小。为了验证标准曲线的准确性，通过制备在线性范围3个不同浓度的样品进行回收测试，得到相关的SERS信号，然后计算测量浓度与相关浓度的比率，即回收率(％)。回收率实验如列表1所示，通过1393±2cm-1处特征峰绘制的标准曲线计算出的尿液中酪氨酸的回收率，由下表可知，通过下表可知，利用本发明检测的酪氨酸具有较高的灵敏度，且误差较小，回收率高说明利用表面增强拉曼光谱的方法检测尿液中的酪氨酸是可行的。
表1是尿液中酪氨酸回收率的测试
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
由一步水热法制备立方纳米银，得到粒径大小分布均匀的立方纳米银；
将对氨基苯硫酚与亚硝酸钠水溶液在冰浴条件下反应，生成重氮化合物，再加入碳酸钠调节pH使整个溶液处于碱性环境下，分别与5-7个不同浓度梯度的酪氨酸混合生成偶氮染料；
制备超疏水银膜；
取步骤（2）制备的不同浓度梯度的偶氮染料分别与步骤（1）制备的立方纳米银混合，滴在超疏水银膜上，静置1000s-2000s后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，采集偶氮染料的SERS光谱，建立拉曼光谱强度-酪氨酸浓度的关系绘制标准曲线；
检测未知样品浓度：将未知浓度的待检测的尿液与步骤（1）制备的立方纳米银混合，滴在超疏水银膜上，待其干后使用雷尼绍拉曼光谱仪进行测试，得到拉曼光谱强度，通过公式算出酪氨酸的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于，步骤（1）中水热法制备立方纳米银的方法具体包括以下步骤：首先配置银氨溶液，然后将5mL的银氨溶液与5mL的浓度为20-50mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵、10mL浓度为1-10mmol/L的葡萄糖溶液充分混合后得到混合液，将上述混合液倒入水热反应釜中后置于烘箱中加热反应，反应时间为8小时，反应温度为120℃，离心洗涤，得到纳米银胶体。
3.根据权利要求1所述的一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于：所述步骤（4）的静置时间为1500s。
4.根据权利要求1所述的一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：将1mL浓度为10-3mol/L的对氨基苯硫酚与1mL质量分数为5%-8%的亚硝酸钠水溶液在冰浴下，搅拌1min-3min后，反应生成重氮化合物，再加入1mL-2mL质量分数为8%-10%的碳酸钠调节pH使整个溶液处于碱性条件下，与2mL不同浓度梯度的酪氨酸混合生成偶氮染料。
5.根据权利要求1所述的一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于：步骤（4）中，所述5-7个浓度梯度的酪氨酸溶液样品的浓度变化值为10-6mol/L-10-12mol/L。
6.根据权利要求5所述的一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于：酪氨酸溶液样品的浓度取值为10-6mol/L、10-7mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L，10-10mol/L，10-11mol/L，10-12mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：超疏水银膜是通过银镜反应在玻璃片上镀一层银，首先配置银氨溶液，将质量分数为2%的氨水溶液滴加到50mL质量分数为2％的AgNO3溶液中，直至溶液从澄清到沉淀恰好消失为止，加入2mL质量分数为6％的葡萄糖溶液于银氨溶液中；然后将清洗干净的玻璃板放入上述溶液中于75℃水浴加热10min后，将制备好的银膜浸泡于浓度为10-3mol/L的十二烷基硫醇的乙醇溶液中12小时后，从溶液中取出风干。
8.根据权利要求1所述的一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于：所述立方纳米银的粒径为40-80nm。
9.根据权利要求1所述的一种尿液中的酪氨酸检测方法，其特征在于：拉曼测试的激发波长为785nm。
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