CN108992458A - 维生素b12用于制备预防和/或治疗术后认知功能障碍药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及维生素B12、叶酸用于制备防治术后认知功能障碍药物的应用。利用维生素B12、叶酸合剂作为预防POCD药物时，可以预防并减轻患者术后早期及远期的认知功能损害症状，加速POCD患者术后认知功能恢复。

Description

维生素B12用于制备预防和/或治疗术后认知功能障碍药物的 应用

技术领域

本发明涉及维生素B12及其衍生物(Vitamin B12,VB12)用于制备预防或/和治疗术后认知功能障碍药物的应用。

背景技术

术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction,POCD)，是患者在手术后出现的严重的长期并发症之一，主要表现为记忆力、抽象思维等障碍，同时伴有社会活动能力的减退。在接受高风险手术患者，尤其是老年、骨科或心脏外科手术患者群体中，POCD的发病率可高达53％，少数患者(约1％)症状可延续至术后1-2年。同时，POCD也会引起其他类型并发症的发生率升高，手术后1年的死亡率也更高。尤其是目前我国已有2.3亿的老年人口，老龄化问题日益加剧，老年POCD已成为亟待解决的临床难题。

发明内容

发明人研究发现维生素B12参与体内如甲基化等多种代谢反应，进一步意外发现维生素B12叶酸合剂二者相互协同参与体内如甲基化等多种代谢反应，对血管性痴呆等中枢神经系统和认知类疾病具有明确的保护作用，尤其对老年群体具有预防和治疗POCD的效果。

基于上述发现本发明提供了：

(1)维生素B12用于制备预防和/或治疗术后认知功能障碍药物的应用。

所述维生素B12被维生素B12衍生物或维生素B12药学上可接受的盐替换。

所述维生素B12的日给药剂量大于5倍的常规标准化饮食补充维生素的剂量。

(2)维生素B12叶酸合剂用于预防或/和治疗术后认知功能障碍药物的应用。

所述维生素B12的日给药剂量大于5倍的常规标准化补充饮食维生素补充剂量，优选12μg～2mg，所述叶酸的日给药剂量大于5倍的常规标准化补充饮食维生素补充剂量，优选2mg～10mg。

所述维生素B12被维生素B12衍生物或维生素B12药学上可接受的盐替换。

所述叶酸被叶酸药学上可接受的盐替换。

(3)一种治疗POCD的药物，其特征在于，该药物由维生素B12和叶酸制成。

所述药物剂型包括注射、片剂、胶囊、分散剂、速崩剂型、泡腾片、软膏、凝胶或透皮缓释剂剂型等。

所述维生素B12被维生素B12衍生物或维生素B12药学上可接受的盐替换。

所述叶酸被叶酸药学上可接受的盐替换。

利用本发明的方案，尤其是维生素B12叶酸合剂作为预防POCD的药物时，可以预防并减轻患者术后早期及远期的认知功能损害症状，加速POCD患者术后认知功能恢复。

附图说明

图1为老年小鼠与青年小鼠接受POCD造模前后的行为学及血清学变化。首先对比生理状态下青老年小鼠血清维生素B12和叶酸含量差别(图1A，1B)，结果显示老年小鼠血清维生素B12含量显著低于青年小鼠，血清叶酸含量差别不显著。然后对比青年及老年小鼠术后14天新物体识别(图1C)，情景恐惧记忆(图1D)，空间记忆(图1E)，结果显示老年小鼠术后POCD症状明显，青年小鼠术后不易发生POCD。血清学直方图中的所有数据采用 mean±SEM，*P<0.05；行为学直方图中的所有数据采用mean±SD，*P<0.05。

图2为维生素B12和叶酸对老年小鼠POCD的影响；首先观察术前2周开始直至术后口服补充5倍剂量维生素后老年小鼠的血清维生素B12和叶酸含量变化(图2A，2B)，结果显示术后4天小鼠血清维生素B12和叶酸含量均显著下降，后逐渐恢复，而术前补充维生素B12与叶酸组小鼠虽然有同样的变化趋势，但在补充后整个围手术期的血清维生素B12水平显著高于对照数量组，而血清叶酸水平两者没有明显差异。然后观察老年小鼠持续使用维生素B12叶酸合剂补充鼠粮或对照鼠粮2周后实施手术的认知功能行为学表现，分别为：术后14天小鼠新物体识别行为轨迹图及表现统计(图2C)；情景恐惧记忆刺激反应与记忆能力(图2D)；空间参考的学习能力及记忆能力(图2E)，*P<0.05；**P<0.01，直方图中的所有数据采用mean±SEM。图2A、图2B和图2C显示，术前2周开始持续补充维生素B12和叶酸可有效改善老年小鼠POCD症状。

图3为维生素B12和叶酸对老年小鼠认知功能的影响；对比维生素B12与叶酸合剂，和单独补充维生素B12 或叶酸对老年小鼠POCD预防作用的差异，采用不同补充策略干预2周后，对比老年小鼠术后新物体识别、情景恐惧、空间记忆认知行为表现差异；图3A、图3B、图3C分别表示术后14天不同处理组老年小鼠新物体识别能力、情景恐惧记忆能力、空间参考学习记忆能力三种认知功能表现(control对照组；FA单独叶酸补充组；VB12 单独维生素B12补充组；FA+VB12复合补充维生素B12和叶酸组)。结果显示单独补充维生素B12或叶酸时，仅对巴恩斯迷宫空间记忆能力有改善，而补充合剂还可以对恐惧记忆以及新物体识别能力有显著改善作用。

具体实施方式

本发明所述的“维生素B12常规标准化补充饮食维生素补充剂量”可根据相关标准或饮食建议确定。目前常见的标准补充计量是：14岁及以上成人：每天2.4微克，孕妇2.6微克，哺乳2.8微克，治疗剂量为500微克，3/ 日[1]。本发明所述的“常规标准化补充饮食叶酸补充剂量”可根据相关标准或饮食建议确定。目前常见的标准补充计量是每日14岁及以上成人，400微克，孕妇600微克，哺乳500微克。

本发明的维生素B12是指临床和食品中所用的维生素B12，维生素B12又名钴胺素，在体内有多种活性形式，本发明的维生素B12衍生物包括甲钴胺、氰钴胺、腺苷钴胺、羟钴胺等。

本发明的维生素B12叶酸合剂是指维生素B12和叶酸混合物。

本发明所述的术后认知功能障碍包括术后辨别力、定向力、执行力、注意力、语言能力和学习记忆功能。

以下本发明具体实施例用材料与方法：

1.所使用的动物，均购自常州卡文斯实验动物有限公司，为健康SPF的级C57BL/6(C57)雄性小鼠。老年小鼠为20～22月，体重在35～40g之间。

2.ELISA检测血清维生素B12、叶酸含量

老年小鼠腹腔探查手术实施后4天、8天、15天、29天后所采集的动脉血血清样本用Elisa方法进行维生素B12、叶酸的含量测定。

维生素B12检测：在酶标板上反应，标准品和样品中的维生素B12与PNPP底物工作液显色，最后加终止液，在450nm处测OD值，Vitamin B12浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Vitamin B12浓度。

叶酸的检测：采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗小鼠叶酸单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的叶酸与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠叶酸，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，叶酸浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中叶酸浓度。上述所有试剂均购自上海西唐生物科技有限公司。

3.POCD模型

给予手术小鼠2％(氧流量1L/min)异氟醚吸入诱导麻醉，待翻正反射消失后，置于加热板上，并固定四肢。异氟醚麻醉维持浓度为1.2-1.4％(氧流量1L/min)。清洁腹部皮肤，消毒，延腹正中线分层作纵向1.5-2cm切口，分离左右腹直肌，暴露小肠段。用润湿的无菌纱布保护切口，并将5cm同一肠系膜动脉袢供血范围的小肠游离至腹部切口外，并用润湿的无菌纱布覆盖暴露肠段。隔纱布搓捻肠段10min。揉搓结束后，还纳肠段，分层缝合腹部切口，消毒。切口局部注射0.1ml 4％罗哌卡因，并涂抹利多卡因软膏。手术全程控制在25-30min。术后三天内每日在腹部切口处涂抹利多卡因软膏镇痛。

4.行为学检测方法：

4.1新物体识别：

1)适应过程：将实验小鼠放入空的行为箱中，使其适应10min，24h后训练；2)训练过程：在行为箱中放入两个相同的物体，将小鼠放入，让其在箱内探索10min，记录小鼠对每个物体的探索时间；3)测试过程：小鼠训练完成2h后，将行为箱中的其中一个物体换成新物体，让小鼠在箱内探索5min，记录小鼠对新物体和旧物体的探索时间。

4.2情景恐惧记忆：

1)训练过程：第一天将小鼠放在恐惧箱中使其适应环境。第二天将小鼠放入相同恐惧箱，测试其基础运动状态120s，记录Freezing时间，然后给小鼠一个足部电击刺激(非条件刺激，持续2s，0.7mA)进行恐惧情景训练，共 5个循环；2)测试过程：于恐惧环境训练24h后，将小鼠放入相同恐惧箱，记录其在一定时间内出现Freezing行为的时间、次数，计算Freezing百分比。

4.3巴恩斯迷宫：

1)训练过程：第1天将小鼠放在3.5L玻璃烧杯中，置于巴恩斯迷宫中心，打开白光和白噪声，使小鼠适应环境30s。用烧杯缓慢地将小鼠引导到目标洞中，让小鼠从目标洞独自钻到逃脱笼中。第2天将小鼠放置在不透光的圆柱罩内，15s后打开蜂鸣器同时移走圆柱罩，让小鼠在迷宫中的探索3min。期间，若小鼠到达逃脱笼，则使其在逃脱笼中待1min再放入存放笼；若小鼠未到达逃脱笼，则使用第一天的方法将其引导到逃脱笼中。每只小鼠每轮训练5-7min，共计15轮(第1天3轮，第2-4天每日4轮)；2)测试过程：于训练结束24h后，将小鼠放置在在不透光的圆柱罩内，置于巴恩斯迷宫中心，开启蜂鸣器，移走圆柱罩，让老鼠自由地在迷宫中探索2min，记录小鼠在每个象限中停留的时间及其探索孔洞的时间。使用视频跟踪软件(Anymaze 5.0，美国，Stoeling公司)记录小鼠探索过程，记录小鼠找到目标洞的时间、次数及进入错误洞的时间、次数等。

实施例1：

该实施例维生素B12叶酸合剂补充方法：

鼠粮：AIN93G标准化鼠粮(购自OpenSource DietsTM，普通数量涵盖普通维生素包Vitamin Mix10037，包括维生素B12 25μg/kg，叶酸2mg/kg)，维生素B12叶酸合剂补充鼠粮(购自OpenSource DietsTM，使用5倍剂量补充维生素B12和叶酸维生素营养包，包括维生素B12 125μg/kg,叶酸10mg/kg)。

对照组(control)持续喂养AIN93G标准化鼠粮及洁净水，维生素B12叶酸合剂补充组(Vitamin组)持续喂养维生素B12叶酸合剂补充鼠粮及洁净水，于补充14天后实施POCD造模。

发明人用ELISA方法检测喂食标准化鼠粮的老年和青年小鼠血清维生素B12、叶酸含量，对比显示老年小鼠血清维生素B12含量较青年小鼠下降约30％(图1A)，叶酸含量不变(图1B)，对比术后14天新物体识别、情景恐惧记忆、空间参考记忆能力，老年小鼠认知行为能力较青年小鼠受损显著(图1C、1D和1E)。

实施例2：

该实施例含维生素B12及叶酸补充后的效果及对老年小鼠术后认知功能的影响。

补充维生素B12和叶酸的老年小鼠整个围术期血清维生素B12水平显著高于对照组(图2A)，两组叶酸水平没有明显差异(图2B)。

老年小鼠连续补充维生素B12和叶酸两周，实施POCD造模，术后14天认知能力较标准化饮食组显著改善，例如新物体识别能力(图2C)，情景恐惧记忆能力(图2D)，空间参考记忆能力(图2E)表现显著提高。

上述结果显示通过使用维生素B12及叶酸合剂，可以有效改善老年群体POCD易感状态，预防POCD发生，并加速术后认知功能恢复。

实施例3：

方法：该实施例制备含有125μg/kg剂量单独补充VB12的鼠粮，或正常对照鼠粮，喂食2周后行手术，术后继续服用不同饮食，直至检测认知行为，对比单独补充VB12，叶酸，或复合补充VB12+叶酸不同策略补充VB12 对防治POCD的效果差异。结果如图3所示，显示出术前单独补充2周5倍生理剂量维生素B12或单独补充5倍生理剂量叶酸的小鼠，其术后14天新巴恩斯迷宫空间记忆能力(图2C)显著改善，但对情景恐惧记忆(图2B) 及新物体识别能力(图2A)没有改善作用。

Claims (12)

1.维生素B12用于制备预防和/或治疗术后认知功能障碍药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述维生素B12被维生素B12衍生物或维生素B12药学上可接受的盐替换。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述维生素B12的日给药剂量大于5倍的常规标准化饮食补充维生素的剂量。

4.维生素B12叶酸合剂用于预防或/和治疗术后认知功能障碍药物的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述维生素B12的日给药剂量大于5倍的常规标准化补充饮食维生素补充剂量，所述叶酸的日给药剂量大于5倍的常规标准化补充饮食叶酸补充剂量。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述维生素B12的日给药剂量为12μg～2mg，所述叶酸的日给药剂量为2mg～20mg。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述维生素B12被维生素B12衍生物或维生素B12药学上可接受的盐替换。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述叶酸被叶酸药学上可接受的盐替换。

9.一种治疗POCD的药物，其特征在于，该药物由维生素B12和叶酸制成。

10.如权利要求9所述的治疗POCD的药物，其特征在于，所述药物剂型为注射剂、片剂、胶囊、分散剂、速崩剂型、泡腾片剂型、软膏剂型、凝胶剂型或透皮缓释剂剂型。

11.如权利要求9所述的治疗POCD的药物，其特征在于，所述维生素B12被维生素B12衍生物或维生素B12药学上可接受的盐替换。

12.如权利要求9所述的治疗POCD的药物，其特征在于，所述叶酸被叶酸药学上可接受的盐替换。