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CN108998402B - 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于遗传工程技术领域。本发明提供了一种以细胞自身功能膜微域FMMs为空间支架，并借助特异性标记蛋白FloA和FloT构建多酶复合体，搭建人工底物通道，有效降低细胞代谢负担，并且多酶复合体挂靠在质膜上，有利于产物由胞内向胞外转运。本发明构建的重组枯草芽孢杆菌在不影响细胞生命活动的前提下，高效合成GlcNAc，并且还可以将有毒中间代谢产物GlcN‑6‑P局限于质膜附近，降低或消除其对细胞活性的抑制。在复合培养基摇瓶发酵过程中，对照菌株BSGC的乙酰氨基葡萄糖的产量仅为0.45g/L，而BSGAT的乙酰氨基葡萄糖产量增加至5.29g/L，是对照菌株的11.76倍。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

Description

一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于遗传工程技术领域。
背景技术
在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。
微生物在自然进化过程中，主要通过形成多酶复合体，生成底物通道，防止有毒中间代谢物扩散至细胞质，提高代谢途径连续多步反应的催化效率。近年来，研究者提出通过构建空间支架结构，将所需要组装的酶锚定在空间支架上以提高催化效率。然而目前的蛋白支架全部都是外源引入的，且均以质粒形式表达，导致细胞代谢负担重，并且质粒在传代过程中可能会丢失，生产过程不稳定。因此，如何设计和构建细胞代谢负担小、生产过程稳定的三维支架进行途径酶的空间组装是代谢工程领域的一个关键难题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明利用微生物细胞自身的大分子结构类物质，设计和构建了细胞代谢负担小、生产过程稳定的三维支架进行中间酶的组装。尤其本发明以枯草芽孢杆菌细胞自身的功能膜微域为空间支架，利用定位在功能膜微域膜筏中的脚手架蛋白FloA和FloT，将酶锚定在空间支架上，解决了已有蛋白支架加重细胞代谢负担，引起生产过程不稳定等问题，与酶没有锚定在空间支架上的重组菌相比，乙酰氨基葡萄糖发酵产量大大提高。
本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域(FMMs)作为空间支架，分别将乙酰氨基葡萄糖合成途径中的两个关键酶氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS和氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1与功能膜微域中的脚手架蛋白FloT和FloA进行融合表达得到。
在本发明的一种实施方式中，所述脚手架蛋白FloT的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:937138所示。
在本发明的一种实施方式中，所述脚手架蛋白FloA的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:937865所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BSGN6为出发菌株。枯草芽孢杆菌BSGN6敲除了nagP、gamP、gamA、nagA、nagB、ldh、pta等基因，具体参见文献(Liu Y.,Zhu,Y.,Li,J.,Shin,H.D.,Chen,R.R.,Du,G.,Liu,L.&Chen,J.Modularpathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamineproduction.Metabolic engineering 2014,23:42-52.)。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:938736所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:179437所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶与脚手架蛋白FloT之间连接的linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶与脚手架蛋白FloA之间连接的linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种枯草芽孢杆菌中空间支架-多酶复合体系统的构建方法，是以枯草芽孢杆菌细胞自身的功能膜微域(FMMs)为空间支架，通过脚手架蛋白FloA和FloT将需要表达的关键酶固定于功能膜微域上，形成空间支架-多酶复合体系统。
本发明的第三个目的是提供一种所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：(1)构建FloT-GlmS融合表达重组片段，整合至枯草芽孢杆菌的floT位点或glms位点，得到表达FloT-GlmS的重组枯草芽孢杆菌；(2)然后构建FloA-GNA1融合表达重组片段，整合至步骤(1)的重组枯草芽孢杆菌基因组的floA位点，得到共表达FloA-GNA1和FloT-GlmS的重组枯草芽孢杆菌。
本发明的第四个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乙酰氨基葡萄糖中的应用，是以重组枯草芽孢杆菌为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，在35～38℃下在种子培养基中活化，活化后的种子在35～38℃下发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，以其重量为基准，种子培养基包括以下成分：5～15g/L蛋白胨、5～10g/L酵母粉和5～15g/L氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。
在本发明的一种实施方式中，以其重量为基准，发酵培养基包括以下成分：30～60g/L葡萄糖、5～8g/L蛋白胨、10～15g/L酵母粉、5～8g/L硫酸铵、10～15g/L磷酸氢二钾、2～3g/L磷酸二氢钾、4～6g/L碳酸钙和8～12ml/L微量元素溶液。
在本发明的一种实施方式中，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。
在本发明的一种实施方式中，以其重量为基准，微量元素溶液包括以下成分：0.8～1.2g/L硫酸锰、0.2～0.6g/L氯化钴、0.1～0.3g/L钼酸钠、0.1～0.3g/L硫酸锌、0.1～0.3g/L氯化铝、0.1～0.3g/L氯化铜、0.04～0.06g/L硼酸和3～8mol/L盐酸。
在本发明的一种实施方式中，活化后的种子以5～15％的接种量转入发酵培养基中进行培养。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种以细胞自身FMMs为空间支架，并借助其特异性标记蛋白(脚手架蛋白)FloA和FloT设计和构建多酶复合体，搭建人工底物通道，能够有效降低细胞代谢负担，并且由于多酶复合体挂靠在质膜上，有利于产物由胞内向胞外转运。本发明构建的重组枯草芽孢杆菌在不影响细胞生命活动的前提下，高效合成GlcNAc，并且还可以将有毒中间代谢产物GlcN-6-P局限于质膜附近，降低或消除其对细胞活性的抑制。在使用复合培养基摇瓶发酵过程中，对照菌株BSNC的乙酰氨基葡萄糖的产量仅为0.45g/L，而BSNAT的乙酰氨基葡萄糖产量增加至5.29g/L，是对照菌株BSGC的11.76倍。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为质膜上FloT-EGFP标记的FMMs的分布和动态特征；A.质膜上FloT-EGFP的单张单全内反射荧光显微术成像图，标尺＝300nm；B.(A)中圆圈所示荧光点的动力学分析和三维荧光图像的时间序列图，标尺＝500nm；C.(A)中圆圈所示荧光点的运动轨迹；
图2为脚手架蛋白FloA和FloT的相关性分析；A.细胞共表达FloA-EGFP和FloT-mCherry的全内反射荧光显微术图像，标尺＝1μm；B.(A)中圆圈所示FloA-EGFP和FloT-mCherry荧光点的运动轨迹；
图3为发酵过程中，BSGAT和BSGC菌株的细胞生长情况；
图4为发酵过程中，BSGAT和BSGC菌株发酵液中的乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的含量；
图5为发酵过程中，BSGAT和BSGC菌株发酵液中剩余葡萄糖的浓度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：验证枯草芽孢杆菌的FMMs可以作为稳定的空间支架
在枯草芽孢杆菌BSGN6的基础上，于枯草芽孢杆菌BSGN6基因组脚手架蛋白编码基因floT(NCBI-Gene ID:937138)位点整合FloT和绿色荧光蛋白EGFP的融合基因表达框。用整合位点floT序列(长度1kb，去除C端终止密码子)、EGFP基因序列(0.7kb)(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，博来霉素抗性基因zeo序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、FloT下游序列(长度1kb)构建整合框。经同源重组，将上述得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGN6基因组中。通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到表达FloT-EGFP的重组枯草芽孢杆菌。
将表达FloT-EGFP的重组枯草芽孢杆菌固定于载玻片上，并置于全内反射荧光显微镜100×的油镜下(数值孔径＝1.45,Olympus)使用488nm的激光进行激发，发射波为500-550nm，连续采集100帧图像，曝光时间为300ms。如图1所示，在整个观察期间，FloT-EGFP荧光点呈颗粒状、分布不均匀(图1A)，且可以长时间稳定地存在于质膜上(图1B)。进一步通过单颗粒示踪技术对FloT-EGFP荧光点的动力学特征进行分析，发现荧光点仅在0.2×0.2平方微米的范围内进行侧向摆动。上述结果说明FloT-EGFP标记的FMMs在时间和空间上具有很好的稳定性，可以作为空间支架。
实施例2：验证枯草芽孢杆菌脚手架蛋白FloA和FloT位于相同的FMMs
在枯草芽孢杆菌BSGN6的基础上，于枯草芽孢杆菌BSGN6基因组脚手架蛋白编码基因floA(NCBI-Gene ID:937865)位点整合FloA和绿色荧光蛋白EGFP的融合基因表达框。用整合位点floA序列(长度1kb，去除C端终止密码子)、EGFP基因序列(0.7kb)，氯霉素抗性基因CmR序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、FloA下游序列(长度1kb)构建整合框。经同源重组，将上述得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGN6基因组中。通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到表达FloA-EGFP的重组枯草芽孢杆菌。
在上述FloA-EGFP的重组枯草芽孢杆菌基础上，于FloA-EGFP的重组枯草芽孢杆菌脚手架蛋白编码基因floT(NCBI-Gene ID:937138)位点整合FloT和红色荧光蛋白mCherry的融合基因表达框。用整合位点floT序列(长度1kb，去除C端终止密码子)、mCherry基因序列(0.7kb)，博来霉素抗性基因zeo序列、FloT下游序列(长度1kb)构建整合框。经同源重组，将上述得到的整合框整合至FloA-EGFP的重组枯草芽孢杆菌中。通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到共表达FloA-EGFP和FloT-mCherry的重组枯草芽孢杆菌。
将上述共表达FloA-EGFP和FloT-mCherry的重组枯草芽孢杆菌固定在载玻片上，并置于全内反射荧光显微镜100×的油镜下(数值孔径＝1.45，Olympus)使用488nm的激光对EGFP进行激发，发射波为500-550nm，使用561nm的激发波对mCherry进行激发，发射波为580-630nm，两个通道分别连续采集100帧图像，曝光时间均为300ms。如图2所示，FloA-EGFP和FloT-mCherry共定位程度较高，且两者存在共扩散现象。上述结果说明，FloA和FloT位于相同的FMMs中，可以作为固定途径酶的骨架。
实施例3：构建重组枯草芽孢杆菌BSGAT
在枯草芽孢杆菌BSGN6的基础上，于枯草芽孢杆菌BSGN6基因组脚手架蛋白编码基因floT(NCBI-Gene ID:937138)位点整合FloT和GlcN-6-P合成酶编码基因glmS(核苷酸序列如NCBI-Gene ID:938736所示)的融合基因表达框。用整合位点floT序列(长度1kb，去除C端终止密码子)、N端带有(GGGGS)3linker的glmS基因序列(1.8kb)，氯霉素抗性基因CmR序列、FloT下游序列(长度1kb)构建FloT-GlmS融合基因整合框。经同源重组，将上述得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌BSGN6基因组中。通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到表达FloT-GlmS的重组枯草芽孢杆菌，并敲除氯霉素抗性。
在上述以敲除抗性的重组枯草芽孢杆菌基础上，于重组枯草芽孢杆菌脚手架蛋白编码基因floA(NCBI-Gene ID:937865)位点整合FloA和GlcN-6-P乙酰化酶编码基因GNA1的融合基因表达框。用整合位点floA序列(长度1kb，去除C端终止密码子)、N端带有(GGGGS)3linker的GNA1基因序列(0.5kb)，氯霉素抗性基因CmR序列、FloA下游序列(长度1kb)构建FloA-GNA1融合基因整合框。经同源重组，将上述得到的整合框整合至FloT-GlmS的重组枯草芽孢杆菌中。通过氯霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证、测序，确认整合成功得到共表达FloA-GNA1和FloT-GlmS的重组枯草芽孢杆菌，并抗性敲除，最终获取菌株BSNAT。
采用上述类似方法，只是整合位点floT序列和整合位点floA序列的C端终止密码子不删除，构建FloT(TAA)-GlmS、FloA(TAA)-GNA1非融合基因整合框，采用上述类似的方法获取对照菌株BSNC。
实施例4：重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖
种子培养基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
发酵培养基的成分包括：60g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙10ml/L微量元素溶液。
其中微量元素溶液以其重量为基准，包括如下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05g/L硼酸和5mol/L盐酸。
使用高效液相色谱法检测乙酰氨基葡萄糖的含量，高效液相色谱法测试条件：仪器型号Agilent 1200，RID检测器，柱子：有机酸柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温40℃，进样体积为10μL。
发酵液中葡萄糖浓度的检测：SBA生物传感分析仪。
菌株生长情况检测：使用紫外-可见分光光度计定时测定发酵液的吸光光度值OD600。
在种子培养基中将枯草芽孢杆菌BSGAT和BSGC于37℃、220rpm下培养8h，然后将种子以5％的接种量转入发酵培养基，于250mL摇瓶中37℃、220rpm条件下培养48h。发酵结束时，检测发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。
摇瓶发酵结束后，BSGAT乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的产量为5.29g/L，是对照菌株BSGC的11.76倍，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc ggcggtggcg gcagc 45
<210> 2
<211> 717
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 2
atgggtaagg gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60
gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120
aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaagcttc ctgttccttg gccaacactt 180
gtcactactc ttacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240
cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggagaggac catcttcttc 300
aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga caccctcgtc 360
aacagaatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag 420
ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480
atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540
cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600
ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660
cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717
<210> 3
<211> 503
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 3
tagagatacc gttcgtatag catacattat acgaagttat cttgatatgg ctttttatat 60
gtgttactct acatacagaa aggaggaact aaacatggcc aagttgacca gtgccgttcc 120
ggtgctcacc gcgcgcgacg tcgccggagc ggtcgagttc tggaccgacc ggctcgggtt 180
ctcccgggac ttcgtggagg acgacttcgc cggtgtggtc cgggacgacg tgaccctgtt 240
catcagcgcg gtccaggacc aggtggtgcc ggacaacacc ctggcctggg tgtgggtgcg 300
cggcctggac gagctgtacg ccgagtggtc ggaggtcgtg tccacgaact tccgggacgc 360
ctccgggccg gccatgaccg agatcggcga gcagccgtgg gggcgggagt tcgccctgcg 420
cgacccggcc ggcaactgcg tgcacttcgt ggccgaggag caggactgaa taacttcgta 480
tagcatacat tatacgaacg gta 503
<210> 4
<211> 1133
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 4
gtaccgttcg tatagcatac attatacgaa gttatcggaa tggacgatcg gcaatagtta 60
cccttattat caagataaga aagaaaagga tttttcgcta cgctcaaatc ctttaaaaaa 120
acacaaaaga ccacattttt taatgtggtc ttttattctt caactaaagc acccattagt 180
tcaacaaacg aaaattggat aaagtgggat atttttaaaa tatatattta tgttacagta 240
atattgactt ttaaaaaagg attgattcta atgaagaaag cagacaagta agcctcctaa 300
attcacttta gataaaaatt taggaggcat atcaaatgaa ctttaataaa attgatttag 360
acaattggaa gagaaaagag atatttaatc attatttgaa ccaacaaacg acttttagta 420
taaccacaga aattgatatt agtgttttat accgaaacat aaaacaagaa ggatataaat 480
tttaccctgc atttattttc ttagtgacaa gggtgataaa ctcaaataca gcttttagaa 540
ctggttacaa tagcgacgga gagttaggtt attgggataa gttagagcca ctttatacaa 600
tttttgatgg tgtatctaaa acattctctg gtatttggac tcctgtaaag aatgacttca 660
aagagtttta tgatttatac ctttctgatg tagagaaata taatggttcg gggaaattgt 720
ttcccaaaac acctatacct gaaaatgctt tttctctttc tattattcca tggacttcat 780
ttactgggtt taacttaaat atcaataata atagtaatta ccttctaccc attattacag 840
caggaaaatt cattaataaa ggtaattcaa tatatttacc gctatcttta caggtacatc 900
attctgtttg tgatggttat catgcaggat tgtttatgaa ctctattcag gaattgtcag 960
ataggcctaa tgactggctt ttataatatg agataatgcc gactgtactt tttacagtcg 1020
gttttctaaa acgatacatt aataggtacg aaaaagcaac tttttttgcg cttaaaacca 1080
gtcataccaa taacttaaat aacttcgtat agcatacatt atacgaacgg tag 1133

Claims (9)

1.一种重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是通过将氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS与枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域中的脚手架蛋白FloT进行融合表达，以及将氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1与枯草芽孢杆菌自身的功能膜微域中的脚手架蛋白FloA进行融合表达得到；
所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BSGN6为出发菌株，所述的枯草芽孢杆菌BSGN6是B.subtilis 168删除了基因gamA、nagA、nagB、nagP、gamP、ldh和pta所获得的。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述脚手架蛋白FloT的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:937138所示。
3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述脚手架蛋白FloA的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:937865所示。
4.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶GlmS的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:938736所示。
5.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰化酶GNA1的编码基因的核苷酸序列如NCBI-Gene ID:179437所示。
6.一种权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建FloT-GlmS融合表达重组片段，整合至枯草芽孢杆菌的floT位点或glms位点，得到表达FloT-GlmS的重组枯草芽孢杆菌；(2)然后构建FloA-GNA1融合表达重组片段，整合至步骤(1)的重组枯草芽孢杆菌基因组的floA位点，得到共表达FloA-GNA1和FloT-GlmS的重组枯草芽孢杆菌；
所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌BSGN6为出发菌株，所述的枯草芽孢杆菌BSGN6是B.subtilis 168删除了基因gamA、nagA、nagB、nagP、gamP、ldh和pta所获得的。
7.权利要求1～5任一项所述的重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乙酰氨基葡萄糖中的应用，其特征在于，是以所述的重组枯草芽孢杆菌为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体是将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，以其重量为基准，种子培养基包括以下成分：5～15g/L蛋白胨、5～10g/L酵母粉和5～15g/L氯化钠；发酵培养基包括以下成分：30～60g/L葡萄糖、5～8g/L蛋白胨、10～15g/L酵母粉、5～8g/L硫酸铵、10～15g/L磷酸氢二钾、2～3g/L磷酸二氢钾、4～6g/L碳酸钙和8～12ml/L微量元素溶液。
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