CN108977402B - 一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法，该方法包括以下步骤：获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；和/或者，GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L。本发明通过逐级调控培养，能够获得高含量GG的藻细胞，能够实现GG大规模的工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法，属于微藻细胞养殖技术领域。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
甘油葡萄糖苷(Glucosylglycerol，简称GG)是一类由甘油分子和葡萄糖分子通过糖苷键连接而形成的糖苷类化合物。其最早是在日本传统的发酵食品中发现，比如清酒，在后期研究中发现其有多种重要的生理功能，比如皮肤保湿，预防龋齿，蛋白质稳定等效果。
GG通常是酒酿造过程中产生，但是生成效率低，每300毫升清酒中仅有1毫升左右的GG化合物，且在酿造过程中GG完全溶解在酒中，这对GG分离精制也造成了困难。迫切需要一种可以能够不直接分泌至细胞外的GG合成技术。
在过去科学文献报道说蓝细菌具有合成GG的能力(Reed et al.1985)，但是GG合成能力非常低(Tan et al.2014)，在Warr等(1985)的研究报道中显示在适合的温度等条件下，通过将淡水培养基养殖后再转接到100％海水培养基中继续培养，可以将螺旋藻细胞内GG含量达到7.27％(w/w)。由于细胞内含量直接影响到提取成本，上述的报道技术仍然满足不了产业化应用，如何进一步大幅度提高细胞中GG的含量成为产业化应用的关键技术。
因此，目前迫切需要寻找合适的养殖方法使得藻细胞具有更高含量的甘油葡萄糖苷，以满足获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞养殖的产业化应用。
发明内容
针对以上现有技术，本发明的目的是克服现有技术中微藻细胞内GG含量低的问题，提供了一种获得高含量GG藻细胞的养殖方法，通过高效的养殖工艺获得了GG含量高于10％(w/w)的藻细胞，从而能够实现制备GG的产业化。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一个方面，提供一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：
GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；和/或者，
GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L。
进一步的，在所述获得培养后的藻细胞阶段的步骤后，还包括GG生成阶段：该阶段中的培养基中含有能改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L。
在本发明的第二个方面，提供一种甘油葡萄糖苷的制备方法，该方法包括上述获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法的步骤。
在本发明的第三个方面，还保护采用上述方法制备得到的甘油葡萄糖苷产品。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果是：
(1)本发明人发现藻细胞培养基中含有特定浓度的能改变细胞渗透压的物质，能够显著提高藻细胞中GG含量，藻细胞中GG的含量水平显著高于现有技术。经过大量实验验证和分析，将该特定浓度范围限定为300～1500mmol/L。
(2)针对本发明优选的技术方案，本发明通过逐级调控培养，能够获得高含量GG的藻细胞，在GG拔高阶段一后达到GG含量10％(w/w)以上，在GG拔高阶段二后达到GG含量30％以上，能够实现GG大规模的工业生产。
(3)针对本发明优选的技术方案，通过特定培养条件的四个阶段可以获得高含量GG的藻细胞，降低GG的分离提取成本。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1：本发明不同反应器培养含GG藻细胞的照片。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
微藻：一般是指那些在显微镜下才能辨别形态微小的藻类。
正如背景技术所介绍的，现有技术中藻细胞的养殖工艺存在一定的不足，使得藻细胞内的GG含量较低，无法满足GG产业化，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；以及包括：
GG拔高阶段一：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；和/或者，
GG拔高阶段二：该阶段中的培养基中含有能够改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L。
在本发明中，藻细胞的种类并没有特别的限定，可以包括自养型微藻或异养型微藻，所述自养型微藻为螺旋藻和Microcoleus chthonoplastes PCC7420等藻株，异养型微藻为Synechocystis sp.PCC 6803基因工程藻株等藻株。在本发明优选的实施方式中，所述藻细胞的种类为螺旋藻。
作为一种可选的实施方式，在所述获得培养后的藻细胞阶段的步骤后，还包括GG生成阶段：该阶段中的培养基中含有能改变细胞渗透压的物质，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L。
在本发明较优选的实施方式中，提供了一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；
GG拔高阶段一：将上述阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；
GG拔高阶段二：将GG拔高阶段一中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L。
在本发明最优选的实施方式中，提供了一种获得高含量甘油葡萄糖苷藻细胞的养殖方法，该方法包括以下步骤：
获得培养后的藻细胞阶段；
GG生成阶段：将上述阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为100～300mmol/L；
GG拔高阶段一：将GG生成阶段中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为300＜C1≤800mmol/L；
GG拔高阶段二：将GG拔高阶段一中的藻细胞接种至含有能够改变细胞渗透压的物质的培养基中进行培养，其中，该物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L。
在本发明中，所述能够改变细胞渗透压的物质为无机盐和/或有机盐的一种或多种组合。
优选的，所述无机盐为氯化钠、硫酸钠、氯化钾或其他无机盐类中的一种或多种；所述有机盐为甲酸钠、乙酸铵或其他有机盐类中的一种或多种。
在本发明中，各培养阶段的光照采用自然光或变光均可，为使培养效果最优，在本发明优选的实施方式中，各培养阶段的光照光波长范围均为400～700nm。
在最优选的实施方式中，GG生成阶段、GG拔高阶段一和GG拔高阶段二是诱导GG、积累GG以及不让已经合成的GG受其他环境条件影响被消费掉的过程，是分三步逐级提高GG含量的过程。
在获得培养后的藻细胞阶段中：
获得培养后的藻细胞有多种途径或方法，在此并没有特别的限定，但为了能够快速有效的制造大量的藻细胞，本发明提出一种优选的藻种养殖方法，该方法包括：将藻细胞接种于低盐的淡水培养基中进行培养，其中盐浓度小于100mmol/L。
优选的，该阶段的培养时间为3-20天。
优选的，该阶段的培养温度为：15-40℃，进一步优选的，该阶段的培养温度为20-40℃。
优选的，所述低盐的淡水培养基中含有氮、磷、铁、镁、钠、钾以及微藻成长所需要的微量元素。
优选的，所述低盐的淡水培养基的配方为Zarrouk培养基，详细成分见表1和表2。该低盐的淡水培养基能够使得藻细胞大量的繁殖，为大量合成和积累GG作基础。
表1Z氏培养基配方
表2母液配方
该阶段中选取了适宜波长的光照和碳源，以供光合作用。
对于碳源，在自养条件下选用含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为10％(v/v)以内，优选的，二氧化碳的浓度为1～5％(v/v)，或者选用无机碳酸盐，或者同时选用含有二氧化碳的混合空气与无机碳酸盐；在异养条件下，在低盐的淡水培养基中额外加入葡萄糖、麦芽糖、甘油、醋酸等。
在GG生成阶段中：
藻细胞选用上述获得培养后的藻细胞阶段培养后成长起来的细胞，在正常的情况下，在接入GG生成阶段的培养基之前细胞内部是不含有GG组分，或者即使含有也是很少的。
作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG，除了获得培养后的藻细胞阶段中所述微藻成长所需的营养元素以外，还需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，通常是选用能够改变细胞渗透压的物质，比如加入100～300mmol/L浓度的能够改变细胞渗透压的物质，该物质可以是氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。
光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
基于此，对该阶段的培养条件进行优化，以期获得含有GG的藻细胞，为拔高阶段提供良好基础。
优选的，该阶段的培养时间为3-20天，进一步优选的，该阶段的培养时间为5-10天。
优选的，培养温度为：15-40℃，进一步优选的，培养温度为20-40℃。
优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m-2·s-2。
进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
在GG拔高阶段一中：
在最优选的实施方式中，藻细胞特征是经过GG生成阶段培养后已经含有一定量的GG。在GG生成阶段中长时间持续培养，细胞会分泌一些对细胞成长起到阻碍作用的物质，从而导致细胞代谢活性降低，细胞内的GG合成能力下降。而将经过培养后含有一定量GG的细胞接入GG拔高阶段一的培养基后，细胞能够恢复活性继续成长，为GG合成反应提供驱动力，提高了GG累积的效率。
GG拔高阶段一的培养基条件，基本上与GG生成阶段相同，作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成GG。除了微藻成长所需的营养元素以外，需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导GG合成反应的物质，这种GG诱导物质的添加量至少要维持与GG生成阶段相同，增大GG诱导物质添加量更有效的促进GG的合成反应，比如加入300＜C1≤800mmol/L浓度的氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导GG合成反应都可以。
光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进GG的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进GG的积累，温度差也更能促进GG的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进GG的积累。
基于此，对GG拔高阶段一的培养条件进行优化，以期获得较高含量GG的藻细胞。
优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。
优选的，培养温度为：15-40℃；进一步优选的，黑暗期间温度设置15-25℃，光照期间温度设置25-40℃。
优选的，此阶段选择间歇光照，光暗比为1:1，光暗时长分别为6-18h和6-18h，光强500-3000μE·m-2·s-2。
进一步优选的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的混合气既能降低氧气浓度又能促进GG的积累。
在最优选的实施方式中，通过GG拔高阶段一培养后，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。
在GG拔高阶段二中：
对于自养型微藻，选用与GG拔高阶段一相同培养条件，区别是能够改变细胞渗透压的物质在培养基中的浓度为800＜C2≤1500mmol/L。
对于异养型微藻或者经过基因工程技术改造后提高细胞壁的小分子透过性的微藻细胞，在本培养基内除了使能够改变细胞渗透压的物质浓度为800＜C2≤1500以外，还需添加合成GG的反应底物，比如甘油或者可以利用的糖，比如葡萄糖、麦芽糖，但不限于上述两种糖，可以进一步提高微藻细胞的GG含量。优选的，所述甘油或者葡萄糖，通过流加等方式维持甘油的浓度0.5-2g/L，葡萄糖的浓度为0.5-5g/L。
优选的，培养时间为大于2天，优选时间为3-5天。
本发明人发现，不同的培养方法和培养条件对藻细胞内GG的含量影响较大，本发明通过特定的培养方法(包括昼夜组合方式、高盐培养藻种后再高盐度养殖，高光条件等)
和逐级调控的模式，能够获得高含量GG的藻细胞。
本发明中的各个步骤所使用的反应器不限，如图1所示，可以是密闭式反应器，也可以是开放式跑道池。对于异养型微藻细胞，用封闭式反应器更有效的防止杂菌污染。
在本发明的具体实施例中采用下述方法进行检测藻细胞内GG含量，该方法包括提取方法和检测方法：
其中，提取方法包括以下步骤：
(1)取2mL藻液，10,000rpm/min离心30min，将沉淀与上清液分开。
(2)向细胞沉淀加入200μL水混匀，随后加入800μL无水乙醇再次混匀，65℃水浴4h。
(3)10,000rpm/min离心10min，弃沉淀，上清用N2吹干，加入合适的ddH2O稀释后测定。
GG检测方法包括以下步骤：
(1)将样品进行适当的稀释。
(2)稀释液使用0.22μm的滤器进行过滤获得离子色谱检测前样品。
(3)使用离子色谱ICS-5000+(Thermo Fisher)进行样品测定，检测器为配套的电化学检测器，柱子为内径4×250mm的DinexTM CarboPacTM PA10色谱柱。使用前柱子用25mMNaOH在1.0mL/min条件下平衡，待电化学检测器的基线稳定后开始样品测定。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一种获得高含量甘油葡萄糖苷螺旋藻细胞的养殖方法，该方法使用的反应器为10L板式反应器。该方法具体实施包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
(2)GG拔高阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为400mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
通过步骤(2)培养后，经检测，可以获得GG含量15％(w/w)以上的藻细胞。
实施例2
一种获得高含量甘油葡萄糖苷螺旋藻细胞的养殖方法，该方法使用的反应器为10L板式反应器。该方法具体实施包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
(2)GG拔高阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为900mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
通过步骤(2)培养后，经检测，可以获得GG含量30％(w/w)以上的藻细胞。
实施例3
一种获得高含量甘油葡萄糖苷螺旋藻细胞的养殖方法，该方法使用的反应器为10L板式反应器。该方法具体实施包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
其中，所述淡水培养基的具体配方为Zarrouk培养基(详见表1和表2)。
(2)GG拔高阶段一：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为400mmol/L。
此阶段的培养时间为5-7天。
(3)GG拔高阶段二：
藻细胞选用上述步骤(2)培养后成长起来的细胞，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为900mmol/L。
此阶段的培养时间为5天。
通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG含量32％(w/w)以上的藻细胞。
实施例4
一种获得高含量甘油葡萄糖苷螺旋藻细胞的养殖方法，该方法使用的反应器为10L板式反应器。该方法具体实施包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于低盐的淡水培养基Zarrouk培养基(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
其中，所述淡水培养基的具体配方为Zarrouk培养基(详见表1和表2)。(2)GG生成阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度22℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强1000μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为200mmol/L。
此阶段的培养时间为5-7天。
(3)GG拔高阶段一：
该阶段的藻细胞特征是经过步骤(2)培养后已经含有一定量的GG，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：淡水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为400mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG含量11％(w/w)以上的藻细胞。
(4)GG拔高阶段二：
对于自养型微藻-螺旋藻，选用与步骤(3)相同培养条件，区别在于：将步骤(3)获得的微藻细胞接入步骤(4)的新鲜培养基，所述新鲜培养基为含900mmol/L氯化钠的Zarrouk培养基。
此阶段的培养时间为5天。
通过步骤(4)培养后，经检测，可以获得GG含量32％(w/w)以上的藻细胞。
实施例5
一种获得高含量甘油葡萄糖苷螺旋藻藻细胞的养殖方法，该方法使用的反应器为100L管式反应器。该方法具体实施包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于淡水培养基中，初始接种浓度为0.15g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温28℃，光照程序为：持续光照，光照强度为200μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为2％(v/v)，以及向培养基中加入100mmol NaHCO3。
此阶段的培养时间为3-5天。
其中，所述淡水培养基的具体配方为：Zarrouk培养基。
(2)GG生成阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度23℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强600μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为150mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
(3)GG拔高阶段一：
该阶段的藻细胞特征是经过步骤(2)培养后已经含有一定量的GG，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：淡水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为500mmol/L。
此阶段的培养时间为3天。
通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。
(4)GG拔高阶段二：
对于自养型微藻-螺旋藻，选用与步骤(3)相同培养条件，区别在于：将步骤(3)获得的微藻细胞接入步骤(4)的新鲜培养基，所述新鲜培养基为含有900mmol氯化钠的Zarrouk培养基。
此阶段的培养时间为3天。
通过步骤(4)培养后，经检测，可以获得GG含量33％(w/w)以上的藻细胞。
实施例6
一种获得高含量甘油葡萄糖苷螺旋藻的养殖方法，该方法使用的反应器为100L管式反应器。该方法具体实施包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于淡水培养基中，初始接种浓度为0.1g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温30℃，光照程序为：持续光照，光照强度为200μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为2％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
其中，所述淡水培养基的具体配方为：Zarrouk培养基。
(2)GG生成阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度25℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强650μE·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为200mmol/L。
此阶段的培养时间为3-5天。
(3)GG拔高阶段一：
该阶段的藻细胞特征是经过步骤(2)培养后已经含有一定量的GG，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：淡水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为500mmol/L。
此阶段的培养时间为3天。
通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG含量10％(w/w)以上的藻细胞。
(4)GG拔高阶段二：
对于自养型微藻-螺旋藻，选用与步骤(3)相同培养条件，区别在于：将步骤(3)获得的微藻细胞接入步骤(4)的新鲜培养基，所述新鲜培养基为含950mmol/L氯化钠的Zarrouk培养基。
此阶段的培养时间为3-5天。
通过步骤(4)培养后，经检测，可以获得GG含量31％(w/w)以上的藻细胞。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种获得高含量甘油葡萄糖苷螺旋藻细胞的养殖方法，其特征是，该方法使用的反应器为100L管式反应器，该方法包括以下步骤：
(1)获得培养后的藻细胞阶段：
将该藻细胞接种于淡水培养基中，初始接种浓度为0.15g/L，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：恒温28℃，光照程序为：持续光照，光照强度为200μE·m-2·s-1，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳体积浓度为2％，以及向培养基中加入100mmol NaHCO3；
此阶段的培养时间为3-5天；
其中，所述淡水培养基的具体配方为：Zarrouk培养基；
(2)GG生成阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：光照时温度32℃，黑暗时温度23℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强600μE·m-2·s-1，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.2VVM，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳体积浓度为5％；
其中，所述淡水培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为150mmol/L；
此阶段的培养时间为3-5天；
(3)GG拔高阶段一：
该阶段的藻细胞特征是经过步骤(2)培养后已经含有一定量的GG，此阶段的培养条件与步骤(2)的基本相同，区别在于：淡水培养基为步骤(2)中的淡水培养基中继续加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为500mmol/L；
此阶段的培养时间为3天；
通过步骤(3)培养后，经检测，可以获得GG质量含量10％以上的藻细胞；
(4)GG拔高阶段二：
对于自养型微藻-螺旋藻，选用与步骤(3)相同培养条件，区别在于：将步骤(3)获得的微藻细胞接入步骤(4)的新鲜培养基，所述新鲜培养基为含有900mmol氯化钠的Zarrouk培养基；
此阶段的培养时间为3天。
2.一种甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征是：该方法包括权利要求1所述的获得高含量甘油葡萄糖苷螺旋藻细胞的养殖方法。
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2018
- 2018-08-10 CN CN201810908060.1A patent/CN108977402B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104651287A (zh) * | 2013-11-22 | 2015-05-27 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种用于合成甘油葡糖苷的工程菌和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ggpS基因过表达对集胞藻PCC 6803甘油葡萄糖苷和甘油合成的影响;马培珍等;《生物工程学报》;20160325;第32卷(第3期);第347-354页 * |
| Molecular biology of cyanobacterial salt acclimation;Hagemann, Martin;《FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS》;20110131;第35卷(第1期);摘要和第100页 * |
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| 马培珍.基因工程蓝细菌产甘油葡萄糖苷潜力研究.《硕士学位论文》.2017, * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108977402A (zh) | 2018-12-11 |
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