CN108948161A

CN108948161A - 大豆与本氏烟草中四个植物nac转录因子nac089基因及其表达载体的应用

Info

Publication number: CN108948161A
Application number: CN201810758001.0A
Authority: CN
Inventors: 窦道龙; 景茂峰; 艾干; 白甜; 郑芷若
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2018-07-11
Filing date: 2018-07-11
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2038-07-11
Also published as: CN108948161B

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了大豆与本氏烟草中四个植物NAC转录因子NAC089基因及其表达载体在植物抵抗疫霉侵染中的应用。以本氏烟为例。在本氏烟中瞬时表达大豆与本氏烟中的NAC089基因，可以显著提高本氏烟对疫霉的抗性。在没有特别好的防治疫霉的方法的现状下，对NAC089基因的克隆对于利用基因工程手段培育具有疫霉抗性的作物品种具有重要意义。

Description

大豆与本氏烟草中四个植物NAC转录因子NAC089基因及其表达载体的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了大豆与本氏烟草中四个植物NAC转录因子NAC089基因及其表达载体在植物抵抗疫霉侵染中的应用。

背景技术

辣椒疫霉菌是一种广谱的病原菌，能够在辣椒、烟草等多种经济作物上造成严重危害。辣椒疫霉隶属于卵菌，该类病原菌虽然在形态上与真菌相似，但在进化上却和硅藻及蓝藻关系较近，为茸鞭生物界，因此一般真菌杀菌剂往往对大豆疫霉和其它卵菌无效。植物抗病品种的应用，由于克服了药害以及环境污染等问题，成为农业生产上实现抗病的重要手段。

植物与病原菌的长期协同进化过程中，植物为了抵抗病原菌，进化出了大量的抗病相关基因，其中包括许多在抗病过程中起作用的NAC转录因子。NAC089是其中的一个比较特殊的转录因子，其不但含有NAC结构域，还含有跨膜结构域，在内质网介导的免疫系统中起重要作用。将NAC089导入到作物中，可以提高作物对辣椒疫霉的抗性。以本氏烟草为例，在本氏烟草中瞬时表达大豆和本氏烟草中的NAC089基因，可以显著提高本氏烟草对辣椒疫霉的抗性。在没有特别好的防治辣椒疫霉的方法的现状下，对于NAC089的克隆对于利用基因工程手段培育具有辣椒疫霉抗性的作物品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的为了弥补目前防治作物疫病的不足，提供了大豆与本氏烟草中四个植物NAC转录因子NAC089基因及其表达载体在植物抵抗疫霉侵染中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

来自本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和大豆(Glycine max)Williams 82两种植物材料的四个NAC转录因子NAC089基因，NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1，GmNAC089-2，所述NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1和GmNAC089-2基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1—4所示。

上述四个NAC转录因子NAC089基因编码的蛋白质为NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1，GmNAC089-2,其氨基酸序列为SEQ ID NO.5—8。

含有上述NAC转录因子NAC089基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

含有上述NAC转录因子NAC089基因的重组表达载体为pBinGFP₂:NbNAC089-1，pBinGFP₂:NbNAC089-2，pBinGFP₂:GmNAC089-1和pBinGFP₂:GmNAC089-2。构建所述NAC转录因子基因NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1，GmNAC089-2的重组表达载体pBinGFP₂:NbNAC089-1，pBinGFP₂:NbNAC089-2，pBinGFP₂:GmNAC089-1，pBinGFP₂:GmNAC089-2。以植物表达载体pBinGFP₂为出发载体，将NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1，GmNAC089-2基因分别插入pBinGFP₂的Sam1酶切位点获得。

所述NAC转录因子NAC089基因及其表达载体可以用于构建抗疫霉(如辣椒疫霉和大豆疫霉等)作物品种。

一种构建抗疫霉作物品种的方法，将上述的基因或重组表达载体导入作物植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗疫霉作物品种。

本发明优点和积极效果表现在：

本发明从大豆与本氏烟草中克隆到了四个植物NAC转录因子NAC089基因，将其插入表达载体pBinGFP₂。将所述载体导入作物中，可以提高作物对疫霉的抗性。所述NAC转录因子可以用于基因工程，构建抗疫病的作物，同时为我们在农业生产中制定抗病策略、控制病害提供有力指导。

附图说明

图1在本氏烟草中瞬时表达NAC089基因提高本氏烟草对辣椒疫霉的抗性。

图2本氏烟草左右面叶片分别表达GFP与NAC089蛋白后接种辣椒疫霉36h后的病斑直径统计。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限制本发明的保护范围。

实施例1在本氏烟中瞬时表达NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1，GmNAC089-2提高本氏烟对辣椒疫霉的抗性

1.供试菌株

供试菌株辣椒疫霉LT263由南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室保存(本领域技术人员广泛使用的常规菌株)。菌株保存于10％V8固体培养基，保存温度为10℃。

2.供试本氏烟草幼苗的准备

本氏烟草(Nicotiana benthamiana)播种于装有蛭石(2-4mm)的塑料花盆(d＝10cm)里，放到14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长。使其生长7天，生长出两片真叶后，将其移栽至蛭石黑土体积比例为5：1的培养土里生长30天，取相同3，4，5叶位的叶片用作表达GFP和NAC089蛋白，然后接种辣椒疫霉。

3.供试大豆幼苗的准备

鉴别寄主大豆播种于装有蛭石(2-4mm)的塑料花盆(d＝10cm)里，每盆种15粒种子，放到14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长，7天后两片真叶长出后留10颗苗用于接种。所用品种为Williams。

4.提取大豆和本氏烟草RNA，并获得NAC089基因的cDNA

收集大豆和本氏烟草的叶片，采摘后液氮速冻后放入研钵冷却研磨。参照天根总RNA抽提纯化试剂盒推荐方法进行大豆和本氏烟草总RNA提取和纯化。参照诺维赞公司RNA反转录试剂盒提供的方法，以Oligo(dT)为引物反转录合成cDNA。以上述cDNA为模板，用相应上下游引物进行PCR扩增，引物序列依次如SEQ ID NO.9—16所示。

PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR反应缓冲液；1.5μL 1.5mM MgCl₂；0.5μL 2.5mMdNTPs；0.25μL Taq DNA聚合酶(5.0U/μL)；0.5μL引物；0.5μL模板；无菌水补足至25μL。

反应程序为：94℃5min预变性；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1:30min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

电泳：用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用紫外凝胶成像仪上切取目的片段(大小约为1023bp)。PCR产物通过TaKaRa凝胶回收试剂盒回收，并送金斯瑞公司进行测序。扩增获得四个NAC转录因子NAC089基因，NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1，GmNAC089-2，测序结果显示所述NbNAC089-1基因的序列如SEQ ID NO.1所示、所述NbNAC089-2基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述GmNAC089-1基因的序列如SEQ ID NO.3所示，所述GmNAC089-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。四个NAC转录因子NAC089基因NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1和GmNAC089-2编码的蛋白质的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.5—8所示。

5、构建pBinGFP₂:NbNAC089-1，pBinGFP₂:NbNAC089-2，pBinGFP₂:GmNAC089-1，pBinGFP₂:GmNAC089-2表达载体

将pBinGFP₂空载体质粒SamI进行酶切。利用诺韦赞公司的同源重组酶将cDNA和载体连接。

反应体系如下：2μL 10×CEⅡ反应缓冲液；2μL上述PCR回收产物；2μL上述酶切后的空载体；1μL同源重组酶；无菌水补足至10μL。

反应程序为：37℃条件下反应30min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在Kan抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定。将鉴定到的阳性克隆测序，正确即获得了pBinGFP₂:NbNAC089-1，pBinGFP₂:NbNAC089-2，pBinGFP₂:GmNAC089-1，pBinGFP₂:GmNAC089-2表达载体。

6、获得农杆菌感受态细胞

在LB固体培养基平板上划线培养农杆菌GV3101菌株，28℃条件下倒置培养18-20h；将单菌落置于LB液体培养基(含有100mg/L Rif)，28℃条件下振荡培养18-20h；100倍体积的不含抗生素的LB液体培养基(含有100mg/L Rif)加入菌液中，28℃条件下振荡培养OD600至0.3-0.5；冰上冷却后，4℃条件下4000r/min离心5min，弃上清；加入20mmol/L的CaCl₂溶液使沉淀悬浮，4℃条件下4000r/min离心5min，弃上清；加入20mmol/L的CaCl₂溶液再次使菌体沉淀悬浮备用。

7、pBinGFP₂:NbNAC089-1，pBinGFP₂:NbNAC089-2，pBinGFP₂:GmNAC089-1，pBinGFP₂:GmNAC089-2表达载体和pBinGFP₂空载体转化农杆菌

利用电转法将pBinGFP₂:NbNAC089-1，pBinGFP₂:NbNAC089-2，pBinGFP₂:GmNAC089-1，pBinGFP₂:GmNAC089-2表达载体和pBinGFP₂空载体转化农杆菌细胞；利用70％酒精冲洗电击杯三次，然后完全风干酒精。将100ng表达载体加入农杆菌感受态，冰上放置30min。将农杆菌感受态细胞转移至电击杯中，利用2.5kV的电压进行电击转化。电击完成后将农杆菌感受态细胞加入到400μL LB液体培养基中，28℃振荡培养2h。吸取20μL菌液，均匀涂抹在含有50mm卡那霉素和25mm的利福平固体LB培养基平板上，28℃倒置培养48h。挑取单菌落进行菌落PCR，获取阳性克隆。

8、在本氏烟草中瞬时表达GFP和NAC089蛋白

将上述阳性克隆放置于LB液体培养基中，28℃震荡培养30h。将菌液收集，用8000rpm离心2min，利用10mM MgCl₂清洗三次。最后用10mM的MgCl₂稀释菌液至OD₆₀₀值0.3。将菌液与含有沉默抑制子P19的菌液1：1体积比混合。用1mL注射器注射分别注射满同一本氏烟草叶片的左面和右面。

9、瞬时表达GFP和NAC089蛋白的本氏烟抗病性检测

将确认表达蛋白的叶片剪下，放置于滤纸保湿的托盘内。用7mm打孔器在辣椒疫霉LT263的平板生长边缘打孔，将打下的菌碟菌面向下得左右对称放置在本氏烟叶片的左右两侧。将托盘放置于25℃培养箱，黑暗，36h。取出叶片，然后用手持紫外荧光仪照射叶片。颜色变深的区域即为辣椒疫霉LT263的侵染区域。用量尺测量侵染区域的直径，表达GFP蛋白的叶面为对照，比较四种蛋白对本氏烟抗性的影响。发现来自大豆和本氏烟草的四种NAC089蛋白显著提高了本氏烟草对辣椒疫霉LT263的抗性。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 大豆与本氏烟草中四个植物NAC转录因子NAC089基因及其表达载体的应用

<130> 2018

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1411

<212> DNA

<213> 本氏烟草(Nicotiana benthamiana)

<400> 1

atgttaccag caaagtccgt cattcaatca gataatgaat ggttcttctt ttctcctcgt 60

ggaaggaagt atccaaacgg gtcgcaaagt aaaagggcaa ctgaatctgg ttactggaag 120

gccacaggaa aagaacgtaa tgtgaaatct ggttcgaatc tcattggcac aaagagaact 180

ctggtgttcc acactggtcg agcacctaaa ggacagagga cacattggat aatgcatgaa 240

tattgcatga gcggaaacac taattatcag aagccttcac caggacttga caggttccga 300

aattcaatta tgttaccgct tccgcactct ggagattttt attatgttac cactttccgc 360

actctggaga tttttattgc acatattgat tctatggttg tctgccgcct ccggaagaat 420

agtgagtttc atttgaatgg caccccaaga aatcaaagga atcaactgtc tgctaccgct 480

actgcaaccg ctcagtctgg agcaggacaa ttgggcagct tggaattggt cactgtaggg 540

ggttgctgtt gttcaaagga agggagtagc agtttttatt cccattcggt tgagcagatg 600

gactctggat cggaatctga taaaccaact aaagagttct ctcagcacga ttcttctggc 660

cacttcaagg actgtgatgg tgaagaggac tggtttgctg atataatgaa agatgatatc 720

attaagctag acgattcttc gttgaatgac caacctattt ccatggttcc cagtaggcct 780

gaatcctcga tatcaactca tgaagctaga gctgcgatgt ccggtgtggc tcctttccag 840

ggcactgcta atcgaagact cagactagta agggaaaaag tagtggtgtg tccagtaaag 900

ggatccagaa gatatgaagc taccaaaaag aataaaatgg gagtgagcac aagtagttca 960

ggaagatggc tgagaaacat gttttcagta aaaacaatga agcaatacgt gatgcctata 1020

tttctggttg cctttatatt actggtcatg cttcttagta tgttgggagt ctcacagcaa 1080

gtgaaatggc ttaggtgtgt tttcgttttg acgagcagct gaagttaaat acctatctgg 1140

tatgttgttt tagtaatatt tagtgtggga gttgaaaaag gaatgagttg tttgtggtat 1200

ttgagcttaa cacttaatta tttcaattca gaagtacagg gctgtaaata gaatgtgtaa 1260

tagaggtaga actttagatg gtggctataa acaaccattt gtttgtactt tgatttgcct 1320

gcatgaatta ttacaacagc tgaaatgtta tgcccttgaa aaatctgaat ttttacaagg 1380

aaaatccctt gtgttacaac atataattgt g 1411

<210> 2

<211> 1257

<212> DNA

<213> 本氏烟草(Nicotiana benthamiana)

<400> 2

atggaagatg tatcaggttc tacagatgag aaaaaaggca gagaaatagt agaaagaagt 60

gaaaataatg gtaatgacga caagaatgtg gaaatttcag tagctacagc ttctactatg 120

tttccggggt ttcggttttg tcccacggat gaagagctga tatcgtatta cttaaagaag 180

aaagttgaag ggtctgatag atgtgttgaa gttatttctg aagttgagat ttggaaacat 240

gaaccttggg atctcccaga taaatccatt gttcaatcag ataatgaatg gttcttcttc 300

tctcctcgtg gaaggaaata cccgaatggc tcgcaaagta aaagggcgac tgagtctggt 360

tactggaagg ccacaggaaa aaaacgtaat gtgaagtctg gttcaaatat gattggcaca 420

aaaagaaccc tggtgttcca cacgggtagg gcaccgaaag gacagagaac acaatggata 480

atgcatgaat attgcatgac tggaaactct tattatcagg attcagtggt tgtttgccgc 540

ctccggaaga ataatgagtt tcatttgaat gacacccacg aaaacagaag gaatcatctg 600

ggaaatgact gcgccactgc tttgtctgga gcaggaaagt tgaacagttt ggagttgata 660

aatggagggg attgctgttc aaaagagggt agcagcagtt ttagttctca ttcggttgag 720

aagattgaat ctgggtcaga ttccgataag ctgactaaag agttgccgca gcaacagtcc 780

tctagtcaat ggaaggattg tgatgaagag gactgttttg ctgatataat gaaagatgat 840

atcgttaagc tagatgattc ttcatataag gcaagataca atgtgttgcc aatagccaat 900

aggaagcttg aatcatctac aaattcatca acccaggaat tccaagatgt aatgtctcat 960

aggctgcctt tccagggtac tgctaatcga agactaagac tacaaacgga aatagtgccc 1020

cgtcgagtag ggagatatga agctaataag aagaatggcc atgctgtgga tgctagtaga 1080

catttaagga ataacattat tccagtaaga agaataaagc aatggtcgat acctctgctt 1140

ctggtttcct tggcgttact ggtcatattt ctttgtatgt ttggaattcc ccacctaaaa 1200

tggcttaggc atcttcttgt tattactcca gctgaggttg ataccagacc tgcatag 1257

<210> 3

<211> 1683

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 3

atgggtgagg cttcaggagc tggttctgct gattgtttca gccagatgat gtcgtcgatg 60

ccgggttttc gcttccatcc cacggatgag gagttggtga tgtactatct gaagcggaag 120

atttgtggga agaggctgaa gctcgacgtg attcgtgaaa ccgatgtgta taagtgggat 180

cctgaggatt tgcctgggca atctatattg aaaactggag ataggcaatg gttctttttc 240

tgtcacagag ataggaagta tcctaatggt ggaaggtcta accgagcaac cagacgtggg 300

tattggaaag caacgggaaa ggatcgtaac gtgatatgca attctaggtc agttggagtg 360

aaaaagaccc tggttttcta tgctggcaga gctcctagtg gtgagcggac tgattgggtt 420

atgcatgaat ataccttgga tgaagaggag cttaagagat gcctgggtgt taaggactat 480

tatgcacttt acaaggttta caagaaaagt ggacctggtc caaaaaatgg tgaacagtat 540

ggcgcaccat ttaatgaaga acagtgggca gatgatgaca tagtagattt taatatcaac 600

tcagctgatc aggaggctcc aaatgatgtt gataatggta atgtactgca gcctttgctt 660

gatgatgaaa tcgacaacat cattagggga attttggatg atgagcttgt ccttgatcag 720

cagcatgtga atggttatcc tgactttcct caggttgtta gtgaagaaac acaaagtact 780

gttgtggatc agttctctga ggctgtgatg ttccctgagc cagtcagaat cacacagcct 840

agcaaccaat tttttgatgc acagcctagc tttgacttca atcagccagt tacttctcat 900

ttgcatgttt ctgaagcatc tgaggtcact tctgcttcca gcattaaagc aaaggagctt 960

gattttaatg aggatggctt cttggaaatt aatgatctca ttgatactga acctatattg 1020

gcaaatatgg aaaatcctgt ggagtaccag cagtttgaag atgggttaag tgaacttgat 1080

ctgttccaag atgcacagat gtttcttcgt gacctggggc caattattca cgaaacagat 1140

tcacatgcat atacaaatgc atttgtcagc agcaatattg aaagtcaaag ttaccagttg 1200

ctgccaaatc cagaggatgc caatcaaact gtcggtgaat tctggatgca cggtgaaaga 1260

aacaccccaa gtgcatcaga aggctttgtt gattctttct cgctatcatc cccaggtgtt 1320

gtatatgaat ctgttggctt tcctacggaa ggcaataaca atcaaagtag cactgtggaa 1380

gatgttgcta caagtagctt ctcctctgct ctctgggcct ttgttgagtc aatacctaca 1440

actcctgcat cagctgctga aagtgctttg gtgaaccgag cattgaatcg aatgtctagc 1500

ttcagcaggt tgaagatcaa gcacacaaac attgctgcag caggtaaaga cactgcaact 1560

atgaagagag caggcagaaa gggacttcca ttcctcttct tccctattat tattgcttta 1620

tgtgcttttt gttgggtttt tgttggaaac ttaagactat tggggagatg tgtctctcct 1680

tga 1683

<210> 4

<211> 1812

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 4

atgggttcgg tggactgtta tccgtctcgt gtggacgatg cggccgtggt gtctctagat 60

tcgctgccgt tagggttccg attccgacct accgacgagg aactcgtcaa ttactacctg 120

cgacagaaga tcaacggtaa tggtcgcgag gtttgggtta tccgagaaat tgatgtctgc 180

aaatgggagc cttgggacat gcccggtttg tcggtggtac agactaagga tccggagtgg 240

ttcttcttct gtccacagga ccgaaagtat ccaaatgggc atcgattgaa cagagcgacg 300

aataatgggt attggaaggc gacggggaag gatcgtaaaa tcaagtctgg gacgattttg 360

attggaatga agaagacttt ggtgttctac actggtcgag cacccaaggg gaataggacc 420

aattgggtta tgcatgagta tcgccccact ttgaaggagc ttgatggtac caatcctgga 480

cagaatccat atgtcctttg tcgcttgttt aagaaacatg atgagagcct tgaagtttca 540

cactgtgatg aagcagagcc gactgcttcc actcctgtgg ctgcctatta ctccacagag 600

gaaatacaat ctgatctggc tgttgttgca ggatcgccgt cacaagttac agaagatgat 660

aagcatcagt caatgatccc tgcacactct gaggaagcaa tatccaatgt tgtaaccccg 720

gttgatcgcc gtactgatgg atatgatgct tgtgatgcac aaaatcaaat tgagttacca 780

actgcggagg agtttcaacc attgaacttt gatatatatt atgacccaag aagcgagcta 840

ctggatggca aattattctc ccctgtactt gcacatattc aaccagaatt tcattatcaa 900

gcaaacatcg aatcagatgg tcgatatggg cttcaatatg gtacaaatga gacaaacatg 960

tcagactttt tgaattcagt tgttaactgg gatcaagtac cctttgagga tcccaattgt 1020

caacagcaga gctacccctt gtttaatgtt aaggataaca tattaaacag cgacttagat 1080

tctgaacttg ccaatatgac atgtatgcaa gctggttatg cagagggggc aattgacgga 1140

aggattcctt tgttgataac ttcagaattt tgcagcacca ctggcatccc cgttgactgt 1200

gttggtgacg agcagaaaag caatgttggg ttatttcaaa acaattccca gagagctttt 1260

actgatgtta atatgggtca agtatacaat gtagttgatg attatgagca acaaagaatc 1320

tgtagtgcag ttgctagtgg caatactgga atcataagga ggcatcgtga ggtacgaaat 1380

gaacagctaa gcataaactc aacacaaggt actgcacaga ggagaattcg tttgtcaatg 1440

gctacacatg gctcaaataa gacggtgaaa agtgaaagtt gtgcacaaga agagctttat 1500

gcaaaaccag tcattgctgt gggggagaaa ggttcagaaa atcatgcttc tgatgaaagt 1560

gctactctta ctaatgatgg gaatgaactg cagaagacac ccgagtcaac cggcaaaaga 1620

aagatttctc aacaagttac aaaagcaggc tccaccttgg ggttgaaaga ccttttcttg 1680

ctcagaaggg tgcctcacat ttcaaaggct tcctcaaatc gcaccaagtg ctcttctgtt 1740

tttgtacttt ctgcctttgt aatggtctca ttagtggtct ttactgacat ttggggatat 1800

cttaaatttt aa 1812

<210> 5

<211> 373

<212> PRT

<213> 本氏烟草(Nicotiana benthamiana)

<400> 5

Met Leu Pro Ala Lys Ser Val Ile Gln Ser Asp Asn Glu Trp Phe Phe

1 5 10 15

Phe Ser Pro Arg Gly Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Gln Ser Lys Arg

20 25 30

Ala Thr Glu Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Glu Arg Asn Val

35 40 45

Lys Ser Gly Ser Asn Leu Ile Gly Thr Lys Arg Thr Leu Val Phe His

50 55 60

Thr Gly Arg Ala Pro Lys Gly Gln Arg Thr His Trp Ile Met His Glu

65 70 75 80

Tyr Cys Met Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Gln Lys Pro Ser Pro Gly Leu

85 90 95

Asp Arg Phe Arg Asn Ser Ile Met Leu Pro Leu Pro His Ser Gly Asp

100 105 110

Phe Tyr Tyr Val Thr Thr Phe Arg Thr Leu Glu Ile Phe Ile Ala His

115 120 125

Ile Asp Ser Met Val Val Cys Arg Leu Arg Lys Asn Ser Glu Phe His

130 135 140

Leu Asn Gly Thr Pro Arg Asn Gln Arg Asn Gln Leu Ser Ala Thr Ala

145 150 155 160

Thr Ala Thr Ala Gln Ser Gly Ala Gly Gln Leu Gly Ser Leu Glu Leu

165 170 175

Val Thr Val Gly Gly Cys Cys Cys Ser Lys Glu Gly Ser Ser Ser Phe

180 185 190

Tyr Ser His Ser Val Glu Gln Met Asp Ser Gly Ser Glu Ser Asp Lys

195 200 205

Pro Thr Lys Glu Phe Ser Gln His Asp Ser Ser Gly His Phe Lys Asp

210 215 220

Cys Asp Gly Glu Glu Asp Trp Phe Ala Asp Ile Met Lys Asp Asp Ile

225 230 235 240

Ile Lys Leu Asp Asp Ser Ser Leu Asn Asp Gln Pro Ile Ser Met Val

245 250 255

Pro Ser Arg Pro Glu Ser Ser Ile Ser Thr His Glu Ala Arg Ala Ala

260 265 270

Met Ser Gly Val Ala Pro Phe Gln Gly Thr Ala Asn Arg Arg Leu Arg

275 280 285

Leu Val Arg Glu Lys Val Val Val Cys Pro Val Lys Gly Ser Arg Arg

290 295 300

Tyr Glu Ala Thr Lys Lys Asn Lys Met Gly Val Ser Thr Ser Ser Ser

305 310 315 320

Gly Arg Trp Leu Arg Asn Met Phe Ser Val Lys Thr Met Lys Gln Tyr

325 330 335

Val Met Pro Ile Phe Leu Val Ala Phe Ile Leu Leu Val Met Leu Leu

340 345 350

Ser Met Leu Gly Val Ser Gln Gln Val Lys Trp Leu Arg Cys Val Phe

355 360 365

Val Leu Thr Ser Ser

370

<210> 6

<211> 418

<212> PRT

<213> 本氏烟草(Nicotiana benthamiana)

<400> 6

Met Glu Asp Val Ser Gly Ser Thr Asp Glu Lys Lys Gly Arg Glu Ile

1 5 10 15

Val Glu Arg Ser Glu Asn Asn Gly Asn Asp Asp Lys Asn Val Glu Ile

20 25 30

Ser Val Ala Thr Ala Ser Thr Met Phe Pro Gly Phe Arg Phe Cys Pro

35 40 45

Thr Asp Glu Glu Leu Ile Ser Tyr Tyr Leu Lys Lys Lys Val Glu Gly

50 55 60

Ser Asp Arg Cys Val Glu Val Ile Ser Glu Val Glu Ile Trp Lys His

65 70 75 80

Glu Pro Trp Asp Leu Pro Asp Lys Ser Ile Val Gln Ser Asp Asn Glu

85 90 95

Trp Phe Phe Phe Ser Pro Arg Gly Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Gln

100 105 110

Ser Lys Arg Ala Thr Glu Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Lys

115 120 125

Arg Asn Val Lys Ser Gly Ser Asn Met Ile Gly Thr Lys Arg Thr Leu

130 135 140

Val Phe His Thr Gly Arg Ala Pro Lys Gly Gln Arg Thr Gln Trp Ile

145 150 155 160

Met His Glu Tyr Cys Met Thr Gly Asn Ser Tyr Tyr Gln Asp Ser Val

165 170 175

Val Val Cys Arg Leu Arg Lys Asn Asn Glu Phe His Leu Asn Asp Thr

180 185 190

His Glu Asn Arg Arg Asn His Leu Gly Asn Asp Cys Ala Thr Ala Leu

195 200 205

Ser Gly Ala Gly Lys Leu Asn Ser Leu Glu Leu Ile Asn Gly Gly Asp

210 215 220

Cys Cys Ser Lys Glu Gly Ser Ser Ser Phe Ser Ser His Ser Val Glu

225 230 235 240

Lys Ile Glu Ser Gly Ser Asp Ser Asp Lys Leu Thr Lys Glu Leu Pro

245 250 255

Gln Gln Gln Ser Ser Ser Gln Trp Lys Asp Cys Asp Glu Glu Asp Cys

260 265 270

Phe Ala Asp Ile Met Lys Asp Asp Ile Val Lys Leu Asp Asp Ser Ser

275 280 285

Tyr Lys Ala Arg Tyr Asn Val Leu Pro Ile Ala Asn Arg Lys Leu Glu

290 295 300

Ser Ser Thr Asn Ser Ser Thr Gln Glu Phe Gln Asp Val Met Ser His

305 310 315 320

Arg Leu Pro Phe Gln Gly Thr Ala Asn Arg Arg Leu Arg Leu Gln Thr

325 330 335

Glu Ile Val Pro Arg Arg Val Gly Arg Tyr Glu Ala Asn Lys Lys Asn

340 345 350

Gly His Ala Val Asp Ala Ser Arg His Leu Arg Asn Asn Ile Ile Pro

355 360 365

Val Arg Arg Ile Lys Gln Trp Ser Ile Pro Leu Leu Leu Val Ser Leu

370 375 380

Ala Leu Leu Val Ile Phe Leu Cys Met Phe Gly Ile Pro His Leu Lys

385 390 395 400

Trp Leu Arg His Leu Leu Val Ile Thr Pro Ala Glu Val Asp Thr Arg

405 410 415

Pro Ala

<210> 7

<211> 560

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 7

Met Gly Glu Ala Ser Gly Ala Gly Ser Ala Asp Cys Phe Ser Gln Met

1 5 10 15

Met Ser Ser Met Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu

20 25 30

Val Met Tyr Tyr Leu Lys Arg Lys Ile Cys Gly Lys Arg Leu Lys Leu

35 40 45

Asp Val Ile Arg Glu Thr Asp Val Tyr Lys Trp Asp Pro Glu Asp Leu

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Ile Leu Lys Thr Gly Asp Arg Gln Trp Phe Phe Phe

65 70 75 80

Cys His Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Gly Arg Ser Asn Arg Ala

85 90 95

Thr Arg Arg Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Arg Asn Val Ile

100 105 110

Cys Asn Ser Arg Ser Val Gly Val Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Ala

115 120 125

Gly Arg Ala Pro Ser Gly Glu Arg Thr Asp Trp Val Met His Glu Tyr

130 135 140

Thr Leu Asp Glu Glu Glu Leu Lys Arg Cys Leu Gly Val Lys Asp Tyr

145 150 155 160

Tyr Ala Leu Tyr Lys Val Tyr Lys Lys Ser Gly Pro Gly Pro Lys Asn

165 170 175

Gly Glu Gln Tyr Gly Ala Pro Phe Asn Glu Glu Gln Trp Ala Asp Asp

180 185 190

Asp Ile Val Asp Phe Asn Ile Asn Ser Ala Asp Gln Glu Ala Pro Asn

195 200 205

Asp Val Asp Asn Gly Asn Val Leu Gln Pro Leu Leu Asp Asp Glu Ile

210 215 220

Asp Asn Ile Ile Arg Gly Ile Leu Asp Asp Glu Leu Val Leu Asp Gln

225 230 235 240

Gln His Val Asn Gly Tyr Pro Asp Phe Pro Gln Val Val Ser Glu Glu

245 250 255

Thr Gln Ser Thr Val Val Asp Gln Phe Ser Glu Ala Val Met Phe Pro

260 265 270

Glu Pro Val Arg Ile Thr Gln Pro Ser Asn Gln Phe Phe Asp Ala Gln

275 280 285

Pro Ser Phe Asp Phe Asn Gln Pro Val Thr Ser His Leu His Val Ser

290 295 300

Glu Ala Ser Glu Val Thr Ser Ala Ser Ser Ile Lys Ala Lys Glu Leu

305 310 315 320

Asp Phe Asn Glu Asp Gly Phe Leu Glu Ile Asn Asp Leu Ile Asp Thr

325 330 335

Glu Pro Ile Leu Ala Asn Met Glu Asn Pro Val Glu Tyr Gln Gln Phe

340 345 350

Glu Asp Gly Leu Ser Glu Leu Asp Leu Phe Gln Asp Ala Gln Met Phe

355 360 365

Leu Arg Asp Leu Gly Pro Ile Ile His Glu Thr Asp Ser His Ala Tyr

370 375 380

Thr Asn Ala Phe Val Ser Ser Asn Ile Glu Ser Gln Ser Tyr Gln Leu

385 390 395 400

Leu Pro Asn Pro Glu Asp Ala Asn Gln Thr Val Gly Glu Phe Trp Met

405 410 415

His Gly Glu Arg Asn Thr Pro Ser Ala Ser Glu Gly Phe Val Asp Ser

420 425 430

Phe Ser Leu Ser Ser Pro Gly Val Val Tyr Glu Ser Val Gly Phe Pro

435 440 445

Thr Glu Gly Asn Asn Asn Gln Ser Ser Thr Val Glu Asp Val Ala Thr

450 455 460

Ser Ser Phe Ser Ser Ala Leu Trp Ala Phe Val Glu Ser Ile Pro Thr

465 470 475 480

Thr Pro Ala Ser Ala Ala Glu Ser Ala Leu Val Asn Arg Ala Leu Asn

485 490 495

Arg Met Ser Ser Phe Ser Arg Leu Lys Ile Lys His Thr Asn Ile Ala

500 505 510

Ala Ala Gly Lys Asp Thr Ala Thr Met Lys Arg Ala Gly Arg Lys Gly

515 520 525

Leu Pro Phe Leu Phe Phe Pro Ile Ile Ile Ala Leu Cys Ala Phe Cys

530 535 540

Trp Val Phe Val Gly Asn Leu Arg Leu Leu Gly Arg Cys Val Ser Pro

545 550 555 560

<210> 8

<211> 604

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max)

<400> 8

Met Gly Ser Val Asp Cys Tyr Pro Ser Arg Val Asp Asp Ala Ala Val

1 5 10 15

Val Ser Leu Asp Ser Leu Pro Leu Gly Phe Arg Phe Arg Pro Thr Asp

20 25 30

Glu Glu Leu Val Asn Tyr Tyr Leu Arg Gln Lys Ile Asn Gly Asn Gly

35 40 45

Arg Glu Val Trp Val Ile Arg Glu Ile Asp Val Cys Lys Trp Glu Pro

50 55 60

Trp Asp Met Pro Gly Leu Ser Val Val Gln Thr Lys Asp Pro Glu Trp

65 70 75 80

Phe Phe Phe Cys Pro Gln Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly His Arg Leu

85 90 95

Asn Arg Ala Thr Asn Asn Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Arg

100 105 110

Lys Ile Lys Ser Gly Thr Ile Leu Ile Gly Met Lys Lys Thr Leu Val

115 120 125

Phe Tyr Thr Gly Arg Ala Pro Lys Gly Asn Arg Thr Asn Trp Val Met

130 135 140

His Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Lys Glu Leu Asp Gly Thr Asn Pro Gly

145 150 155 160

Gln Asn Pro Tyr Val Leu Cys Arg Leu Phe Lys Lys His Asp Glu Ser

165 170 175

Leu Glu Val Ser His Cys Asp Glu Ala Glu Pro Thr Ala Ser Thr Pro

180 185 190

Val Ala Ala Tyr Tyr Ser Thr Glu Glu Ile Gln Ser Asp Leu Ala Val

195 200 205

Val Ala Gly Ser Pro Ser Gln Val Thr Glu Asp Asp Lys His Gln Ser

210 215 220

Met Ile Pro Ala His Ser Glu Glu Ala Ile Ser Asn Val Val Thr Pro

225 230 235 240

Val Asp Arg Cys Thr Asp Gly Tyr Asp Ala Cys Asp Ala Gln Asn Gln

245 250 255

Ile Glu Leu Pro Thr Ala Glu Glu Phe Gln Pro Leu Asn Phe Asp Ile

260 265 270

Tyr Tyr Asp Asp Pro Arg Ser Glu Leu Leu Asp Gly Lys Leu Phe Ser

275 280 285

Pro Val Leu Ala His Ile Gln Pro Glu Phe His Tyr Gln Ala Asn Ile

290 295 300

Glu Ser Asp Gly Arg Tyr Gly Leu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Thr Asn

305 310 315 320

Met Ser Asp Phe Leu Asn Ser Val Val Asn Trp Asp Gln Val Pro Phe

325 330 335

Glu Asp Pro Asn Cys Gln Gln Gln Ser Tyr Pro Leu Phe Asn Val Lys

340 345 350

Asp Asn Ile Leu Asn Ser Asp Leu Asp Ser Glu Leu Ala Asn Met Thr

355 360 365

Cys Met Gln Ala Gly Tyr Ala Glu Gly Ala Ile Asp Gly Arg Ile Pro

370 375 380

Leu Leu Ile Thr Ser Glu Phe Cys Ser Thr Thr Gly Ile Pro Val Asp

385 390 395 400

Cys Val Gly Asp Glu Gln Lys Ser Asn Val Gly Leu Phe Gln Asn Asn

405 410 415

Ser Gln Arg Ala Phe Thr Asp Val Asn Met Gly Gln Val Tyr Asn Val

420 425 430

Val Asp Asp Tyr Glu Gln Gln Arg Ile Cys Ser Ala Val Ala Ser Gly

435 440 445

Asn Thr Gly Ile Ile Arg Arg His Arg Glu Val Arg Asn Glu Gln Leu

450 455 460

Ser Ile Asn Ser Thr Gln Gly Thr Ala Gln Arg Arg Ile Arg Leu Ser

465 470 475 480

Met Ala Thr His Gly Ser Asn Lys Thr Val Lys Ser Glu Ser Cys Ala

485 490 495

Gln Glu Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Val Ile Ala Val Gly Glu Lys Gly

500 505 510

Ser Glu Asn His Ala Ser Asp Glu Ser Ala Thr Leu Thr Asn Asp Gly

515 520 525

Asn Glu Leu Gln Lys Thr Pro Glu Ser Thr Gly Lys Arg Lys Ile Ser

530 535 540

Gln Gln Val Thr Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Leu Lys Asp Leu Phe

545 550 555 560

Leu Leu Arg Arg Val Pro His Ile Ser Lys Ala Ser Ser Asn Arg Thr

565 570 575

Lys Cys Ser Ser Val Phe Val Leu Ser Ala Phe Val Leu Val Ser Leu

580 585 590

Val Val Phe Thr Asp Ile Trp Gly Tyr Leu Lys Phe

595 600

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

atgttaccag caaagtccgt 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

cacaattata tgttgtaaca c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

atggaagatg tatcaggttc 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

ctatgcaggt ctggtatca 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

atgggtgagg cttcaggagc 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

tcaaggagag acacatctcc cca 23

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

atgggttcgg tggactgtta 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

ttaaaattta agatatcccc aa 22

Claims

1.一种NAC转录因子NAC089基因，该基因为NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1和GmNAC089-2中的任意一种，所述NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1和GmNAC089-2的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1—NO.4所示。

2.由权利要求1所述基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.5—NO.8所示。

3.含有权利要求1所述NAC转录因子NAC089基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体为pBinGFP₂:NbNAC089-1，pBinGFP₂:NbNAC089-2，pBinGFP₂:GmNAC089-1和pBinGFP₂:GmNAC089-2中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于该重组表达载体为将NbNAC089-1、NbNAC089-2，GmNAC089-1和GmNAC089-2中的任意一种插入pBinGFP₂载体的SmaI酶切位点间所得。

6.权利要求1所述的NAC转录因子NAC089基因在构建抗疫霉作物品种中的应用。

7.权利要求3～5中任一所述的重组表达载体在构建抗疫霉作物品种中的应用。

8.一种构建抗疫霉作物品种的方法，其特征在于将权利要求1中所述的基因或权利要求3～5中任一所述的重组表达载体导入作物植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗疫霉作物品种。