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CN108929258A - 一种Rho激酶抑制剂及其在癌症治疗中的应用 - Google Patents

一种Rho激酶抑制剂及其在癌症治疗中的应用 Download PDF

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CN108929258A
CN108929258A CN201810747118.9A CN201810747118A CN108929258A CN 108929258 A CN108929258 A CN 108929258A CN 201810747118 A CN201810747118 A CN 201810747118A CN 108929258 A CN108929258 A CN 108929258A
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methyl
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hydrocarbon radicals, substituted by hetero atoms, attached to ring carbon atoms
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Abstract

本发明公开了一种Rho激酶抑制剂，结构如式Ⅰ所示：其中：R1、R2选自‑(CH2)nCH3，其中，n＝0～4。本发明通过ROCK I的酶抑制活性实验和癌细胞体外抑制实验证实式Ⅰ所示的化合物具有ROCK I的抑制活性，具有多种癌细胞的抑制活性，有机会成为治疗癌症的化学药物注册分类中的一类新药。

Description

一种Rho激酶抑制剂及其在癌症治疗中的应用
技术领域
本发明涉及一种Rho激酶抑制剂及其在癌症治疗中的应用
背景技术
Rho激酶(Rho-associated kinases,ROCK)是参与细胞有丝分裂粘附、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命现象的重要酶。包括ROCK I和ROCK II，前者主要存在于非神经组织如心脏、肺、骨胳肌等细胞，后者主要存在于中枢神经系统，如海马锥体神经元、大脑皮质、小脑浦肯野细胞等。
大量研究表明，Rho/ROCK信号通路参与了多种癌症疾病，比如乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、脑癌、头颈部癌、睾丸癌和膀胱癌。ROCK的异常表达会引起几种类型癌细胞的入侵和转移，在体内外模型中发现，由ROCK抑制剂引起的Rho/ROCK通路抑制可以有效地抑制肿瘤生长。K.Itoh等发现Y27632可以抑制肌动球蛋白的Rho介导的激活，也可以抑制MM1肝癌细胞的入侵活动，此外，连续给予Y27632可以减少植入到同基因小鼠腹腔内的MM1细胞的散播。S.Liu等观察到在转移性人类乳腺瘤和乳腺肿瘤细胞中，ROCK被超高表达，有趣的是，ROCK的超表达赋予局部性MCF-7乳腺癌细胞一种转移性表现。此外，由Y27632引起的ROCK抑制或以ROCK为靶向的体外细胞迁移和扩散，也可以在体内阻止细胞迁移到人类的骨骼中。RKI1447是2012年发现的一种选择性的ROCK抑制剂，在转基因鼠模型中，RKI1447表现出十分重要的抗乳腺癌的反侵略性和抗肿瘤活性。这些实验证明了ROCK抑制剂在预防肿瘤侵袭、迁移和增殖方面的治疗潜能。
目前使用的ROCK抑制剂大概分成以下几类：异喹啉类、苯并吡唑类、尿素类、氨基嘧啶类。新型ROCK抑制剂的研发进展缓慢，新型ROCK抑制剂的研发具有重要意义。
发明内容
本发明提供的化合物为在已有的抑制剂信息和ROCK的空间结构信息的基础上设计的一类新型结构类型的化合物。ROCK精细结构为A、F和D区共同形成与ATP结合的口袋结构。具体为如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物，
其中，R1、R2选自-(CH2)nCH3，其中，n＝0～4。
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物的合成方法，
在合适的溶剂中，向1,1,1-三氟-5-甲基己烷-2,4-二酮和(E)-(2-硝基丙-1-烯-1-基)苯的溶液中加入DBU后反应得到1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮(中间体1)。
所述的合适的溶剂选自2-丙醇，二氯甲烷，DCM，THF等，优选THF和2-丙醇的溶液。
以乙醇为溶剂，Raney镍为催化剂在合适的压力下将中间体1进行氢化，压力范围为2-10atm，优选4atm。经后续处理后得到2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2H-吡咯-4-基)丙-1-酮(中间体2)。
以THF和乙醇的混合溶液为溶剂，向中间体2中，加入氰基硼氢化钠和溴甲酚绿。反应结束后经硅胶色谱纯化得到2-甲基-1-((2R,3R,4S)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3)。硅胶色谱中的洗脱剂可以为EtOAc-己烷，比例范围可以是65％:35％～95％:5％，优选85％EtOAc-15％己烷。
中间体3和相应的溴取代化合物在DIPEA和乙腈的混合物在50℃下加热1小时，经后续处理后可以得到本发明所述的化合物(式Ⅰ)。
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐作为Rho激酶抑制剂的应用。
本发明还提供了所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐在治疗癌症药物中的应用。
进一步地，所述的癌症选自肝癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌。
本发明还提供了一种药物组合物，包含如式Ⅰ所示的化合物和/或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
本发明的化合物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)制成药物组合物。根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。
为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明教溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。如果需要的话，还可以用通常的涂渍材料使片剂作为糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。
为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋性剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化植物油，高岭土和滑石等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄著胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。
为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。
为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液和悬浮液消毒，并最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。根据需要，在治疗精神分裂症期间，也可加入着色剂、防腐剂、香料、调味剂、香化剂和其它药物等。
本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射，如有必要可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。
本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。
具体实施方式
中间体1：1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮的合成：
将1,1,1-三氟-5-甲基己烷-2,4-二酮(35.0g，0.192mol)和(E)-(2-硝基丙-1-烯-1-基)苯(37.9g，0.232mol)溶于210mL的THF和35mL的2-丙醇溶液中。加入1g1,8-二氮杂双环[5.4.0]-十一碳-7-烯(DBU)，然后将反应混合物在室温下搅拌2小时，在搅拌期间，隔20分钟后再加入0.65g的DBU，1小时后再加入0.25g的DBU。2小时后，TLC(95％CH2Cl2-5％EtOAc)显示大部分起始原料消失。将溶剂在真空中浓缩并加入500mL甲苯。有机相用稀盐酸洗涤，然后再用NaCl溶液洗涤。用Na2SO4干燥后，浓缩溶液，残余物经硅胶层析，用3:1己烷-EtOAc洗脱，得到中间体1的异构体混合物：1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮，产量是53.82g，产率为78％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.03(s,3H),1.05(s,3H),1.79(d,3H),2.39(m,1H),3.16(m,1H),3.46(dd,1H),3.97(d,1H),5.74(m,1H),7.21(t,1H),7.28(m,4H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:17.41,18.56,38.70,42.88,48.41,64.03,80.87,123.34,126.16,128.14,130.12,140.22,176.69,204.04.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:360[M+H]。
中间体2：2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2H-吡咯-4-基)丙-1-酮的合成：
将溶解在500mL乙醇中的中间体1(41.00g，0.114mol)在4atm压力下用81.00gRaney镍(在使用前用乙醇洗涤三次)氢化。过滤催化剂后，浓缩溶液，残余物经硅胶层析，用溶解在CH2Cl2中的8.5％EtOAc的溶液洗脱，得到2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2H-吡咯-4-基)丙-1-酮(中间体2)，32.23g，产率95％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.03(s,3H),1.05(s,3H),1.14(d,3H),2.19-2.34(m,2H),3.71(d,1H),4.28(m,1H),7.21(t,1H),7.28(m,4H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:18.56,20.06,38.70,54.46,58.81,75.60,124.23,124.79,128.52,129.68,141.16,160.67,208.88.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:298[M+H].
中间体3：2-甲基-1-((2R,3R,4S)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮的合成：
将中间体2(21.89g，0.074mol)溶于27mLTHF和54mL乙醇中。加入氰基硼氢化钠(23.50g，0.374mol)和5mg溴甲酚绿。向该蓝色溶液中滴加浓HCl的乙醇溶液(1:2)，以使溶液颜色始终保持浅黄绿色的速率滴加。在不滴加HCl时，溶液颜色持续保持黄色，然后将该溶液再搅拌20分钟。将溶液真空浓缩，然后用CHCl3萃取，用KHCO3溶液洗涤。将有机相分离，用Na2SO4干燥并浓缩。将残余物在硅胶上进行色谱分离，用85％EtOAc-15％己烷洗脱，得到13.75g2-甲基-1-((2R,3R,4S)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3)和7.75g2-甲基-1-((2R,4R)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3”)的混合物。用纯乙酸乙酯进一步洗脱，得到4.18g纯的2-甲基-1-((2R,3S,4S)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3’)。将上述纯的中间体3’(4.18g)溶于10mL乙醇中，加入20滴乙醇钠的乙醇溶液。将该溶液回流过夜。TLC(EtOAc)显示无起始物质。用乙醇中的HCl中和过量的NaOEt，并将溶液真空浓缩。将残余物溶于甲苯中并用KHCO3溶液洗涤。将甲苯溶液用Na2SO4干燥并浓缩，得到3.89g经TLC(EtOAc)纯化的中间体3。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.03(s,3H),1.05(s,3H),1.06(d,3H),1.51(s,1H),2.34(m,1H),2.44(m,1H),3.43(t,1H),3.63(m,1H),4.10(m,1H),7.21(t,1H),7.28(m,4H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:17.94,18.56,38.52,54.97,58.49,64.08,71.00,124.96,128.50,129.49,129.79,141.06,217.91.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:300[M+H]。
实施例1：N,N-二丁基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺的合成：
将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，N,N-二丁基溴乙酰胺(21.50g，0.086mol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55mL)的混合物在50℃下加热1小时。TLC(EtOAc)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用KHCO3溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的气味消失，得到最终产物N,N-二丁基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺，产量38.85g，产率为98％。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.90(t,6H),1.03(s,3H),1.05(s,3H),1.06(d,3H),1.30(m,4H),1.51(m,4H),2.05-2.26(m,2H),3.21-3.44(m,6H),3.74(s,1H),4.14-4.31(m,2H),7.21(t,1H),7.28(m,4H).13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ:14.00,16.36,18.56,20.75,28.88,38.52,45.35,51.11,57.03,57.65,64.51,65.96,125.28,127.07,128.47,130.16,140.97,172.34,217.97.LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:470[M+H]
实施例2：N,N-二乙基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺的合成
将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，N,N-二乙基溴乙酰胺(0.086mol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55mL)的混合物在50℃下加热1小时。TLC(EtOAc)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用KHCO3溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的气味消失，得到最终产物N,N-二乙基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺，产量32.96g，产率为94％。LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:413[M+H]。
实施例3：N,N-二丙基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺的合成
将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，N,N-二丙基溴乙酰胺(0.086mol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55mL)的混合物在50℃下加热1小时。TLC(EtOAc)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用KHCO3溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的气味消失，得到最终产物N,N-二丙基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺，产量34.08g，产率为91％。LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:441[M+H]。
实施例4：N,N-二甲基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺的合成
将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，N,N-二甲基溴乙酰胺(0.086mol)，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55mL)的混合物在50℃下加热1小时。TLC(EtOAc)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用KHCO3溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的气味消失，得到最终产物N,N-二甲基-2-(3-异丁酰基-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺，产量30.39g，产率为93％。LC-MS(ESI,pos,ion)m/z:385[M+H]。
实施例5～实施例9：
合成方法如实施例1～实施例4所述，得到实施例5～9如下表所示：
试验例1：ROCK I的酶抑制活性实验
一、实验原理：
ROCK I抑制活性的测量采用了Invitrogen公司的Z′-LYTETM技术，该技术基于荧光共振能量转移(FRET)原理，以磷酸化和非磷酸化多肽对蛋白水解切割的敏感性差异为基础。
二、实验方法：
1、试剂的准备
激酶缓冲液：将2ml的5X激酶缓冲液用水稀释到10ml；
化合物：将所要测试的化合物用水稀释到一个浓度梯度；
ROCK激酶/底物的混合溶液：配制2250μLROCK/底物的混合溶液；
酶的浓度为10ng/ml，底物的浓度为4μM，溶剂为激酶缓冲液；
磷酸化多肽溶液：将2μL的丝氨酸/苏氨酸磷酸化7肽加到498μL的激酶缓冲液中，充分混匀；
ATP溶液：配制1110μL的ATP溶液，浓度为50μM，溶剂为激酶缓冲液；
显色剂：按1:32768的比例稀释显色剂A。
2、实验步骤
(1)将2.5μL配制好的化合物溶液加到黑色384孔板；
(2)加入5μL ROCK激酶/底物的混合溶液；
(3)加入2.5μL的ATP溶液；
(4)将384孔板在室温下震荡并培养1小时；
(5)将5μL显色剂加入到孔板中，继续反应1小时；
(6)将孔板置于酶标仪中读数。
三、实验结果：
使用不同浓度的本发明化合物进行ROCK I的抑制活性实验，发现本发明化合物具有很好的抑制活性，其半抑制浓度IC50如下表所示：
实施例 IC50(μM)
实施例1 2.32
实施例2 0.57
实施例3 0.50
实施例4 1.64
实施例5 1.82
实施例6 1.55
实施例7 1.18
实施例8 0.71
实施例9 0.98
试验例2：癌细胞体外抑制实验
一、实验原理
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对肿瘤细胞的杀伤效果。二、实验步骤
(1)取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，RPMI 1640细胞培养液调细胞悬液浓度为6×104个/mL。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μL，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h，细胞贴壁。
(2)移走RPMI 1640细胞培养液，加入浓度梯度的待测药物的RPMI 1640细胞培养液100μL，每个浓度设6个平行孔。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。
(3)96孔板离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含0.5％MTT的RPMI1640细胞培养液100μL，继续培养4h。
(4)移走上清，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使formazan结晶充分溶解。
(5)在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的光密度(OD值)。
(6)平行孔OD值以mean±SD表示，计算抑制率公式：[(OD对照组-OD空白组)-(OD药物实验组-OD空白组)]/(OD对照组-OD空白组)*100％。
对照组(加入浓度梯度的待测药物改为加入不含药物的RPMI 1640细胞培养液)；空白组(与对照组相比，不加细胞)。
(7)采用GraphPad Prism 5数据处理软件，通过绘制量效曲线计算半数抑制浓度(IC50)。
三、实验结果
在肝癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞株、乳腺癌细胞株、膀胱细胞株等上的研究中均发现ROCK的过高表达，本实验采用多种癌细胞来证实本发明化合物抗癌细胞活性，使用的4种癌细胞为人肺癌细胞A549，人肝癌细胞SMMC-7721，人大细胞肺癌细胞NCI-H460，人乳腺癌细胞MCF-7。下表中所列实施例化合物对四种癌细胞的IC50均＜10μM。
综上所述，本发明所述的如式Ⅰ所示的化合物具有ROCK I的抑制活性，具有多种癌细胞的抑制活性，有机会成为治疗癌症的化学药物注册分类中的一类新药。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

Claims (4)

1.如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中，R1、R2选自-(CH2)nCH3，其中，n＝0～4。
2.如权利要求1所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐作为ROCK抑制剂的应用。
3.如权利要求1所述的如式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐在治疗癌症药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征是，所述的癌症选自肝癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌。
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