CN108904532B - 一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用 - Google Patents
一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂在骨肉瘤中的应用，所述应用在于通过联合C60纳米晶体与CaMKII抑制剂，增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力，降低C60纳米晶体的使用剂量。实验结果表明：(1)抑制CaMKIIα的活性可以增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力。(2)通过联合C60纳米晶体与CaMKII抑制剂可以降低C60纳米晶体的使用剂量。(3)联合C60纳米晶体与CaMKII抑制剂是通过抑制AKT信号通路增强对骨肉瘤细胞的杀伤。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用。
背景技术
富勒烯C60由于其显著的几何结构而具有很多独特理化性质(光诱导产生氧自由基、活跃的化学反应能力等)，在生物医药领域具有非常广泛的应用。如C60能产生单线态氧，剪切DNA，诱导自噬，调节免疫等。且由于C60表面活泼的π键结构很容易在其表面引入其他的结构，而产生的大量的C60的衍生物。C60的衍生物在药物输运、基因治疗以及肿瘤靶向等方面也有着突出的应用。
CaMKII是一类钙离子/钙调蛋白(Ca2+/CaM)依赖的蛋白激酶，主要有α、β、r、δ等几种亚型。它作为一种关键的学习记忆分子在神经系统中含量非常丰富。同时，它可通过磷酸化下游一系列参与钙离子稳态、肌肉收缩、信号转导等的靶蛋白而在多种肿瘤的生长、分化、侵袭和转移中都起到重要的作用。
CaMKII由三个结构域组成，催化结构域、调节结构域以及结合结构域。在基础状态时， CaMKII的调节结构域与催化结构域结合，激酶处于无活性状态。钙离子可使CaMKII构象打开而活化，但一旦钙离子除去激酶又会回复到构象闭合的抑制状态。而当环境中存在钙离子使CaMKII构象打开时，若CaMKII的T286/287位点发生自我磷酸化，则能产生不依赖于钙离子/钙调蛋白的活性，即使将钙离子除去，激酶仍能较长时间的保持在一个活性状态，即自主活性。
骨肉瘤作为临床上最常见的原发性恶性肿瘤之一，具有非常高的侵袭和转移能力。而骨肉瘤中的CaMKII的激活可能与细胞的促生存相关。
中国专利申请：CN107913289A公开了一种水溶性富勒烯结构在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述水溶性富勒烯结构包括：水溶性空心富勒烯及其可药用的盐和可药用的酯中的至少一种。该药物对生物体有很好的亲和性，毒性低，对肿瘤的抑制效率高，治疗肿瘤效果好。目前已有报道，水溶性的富勒烯C60纳米晶体可通过与神经组织中的CaMKIIα位点特异性的相互作用，引发激酶自主活性，并具有促进大鼠的学习和记忆的能力。但是关于富勒烯C60纳米晶体在骨肉瘤细胞上的应用，以及其对骨肉瘤细胞CaMKIIα的影响还鲜有报道，且是否可以通过调控CaMKII的活性来达到促进C60纳米晶体抗骨肉瘤细胞的效应也未曾有报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂是通过抑制AKT信号通路增强对骨肉瘤细胞的杀伤。
作为本发明的一个优选实施方案，所述富勒烯C60纳米晶体为水溶性的富勒烯C60纳米晶体，富勒烯C60纳米晶体的粒径范围为100-140nm，形状为六棱形，可以光诱导产生氧自由基，C60表面活泼的π键结构很容易在其表面引入其他的结构，具有活跃的化学反应能力；所述CaMKII抑制剂可通过磷酸化下游一系列参与钙离子稳态、肌肉收缩、信号转导等的靶蛋白而在多种肿瘤的生长、分化、侵袭和转移中都起到重要的作用，所述CaMKII抑制剂由三个结构域组成，催化结构域、调节结构域以及结合结构域，在基础状态时，CaMKII 的调节结构域与催化结构域结合，激酶处于无活性状态，钙离子可使CaMKII构象打开而活化，但一旦钙离子除去激酶又会回复到构象闭合的抑制状态，而当环境中存在钙离子使 CaMKII构象打开时，若CaMKII的T286/287位点发生自我磷酸化，则能产生不依赖于钙离子/钙调蛋白的活性，即使将钙离子除去，激酶仍能较长时间的保持在一个活性状态，即自主活性。
作为本发明的一个优选实施方案，所述CaMKII抑制剂是KN-93抑制剂。
作为本发明的一个优选实施方案，所述富勒烯C60纳米晶体的粒径为100-140nm。
作为本发明的一个优选实施方案，所述CaMKII抑制剂为一种化合物或其药学上可接受的盐，为以下化学结构：
其中：R1是无环基团或者5元或6元杂芳基，其选自由以下组成的结构列表：
R2、R3、R4、R5、R6和R7中的每个独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、-CN、-CF3、-OR、-NR2、-NO2、-COOR、-CONR2和-R；每个A独立地选自由以下组成的组：共价键、任选取代的亚甲基、任选取代的顺式亚乙基、任选取代的反式亚乙基、乙炔、C(O)、S(O)和 S(O)2；其中，如果一个A是任选取代的亚甲基、任选取代的顺式亚乙基、任选取代的反式亚乙基、乙炔、C(O)、S(O)或S(O)2，则另一个必须是共价键或任选取代的亚甲基；R8选自由以下组成的组：氢、NH2、胍基、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元任选取代的饱和杂环和具有1-2个独立地选自硫、氮和氧的杂原子的5-6元杂芳族环；每个W独立地为N或CR9；每个X独立地为N或CR10；Y是O、S或NR11；Z是O、S或NR12； R9选自由以下组成的组：氢、L-R13、NH2、胍基、具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元任选取代的饱和杂环和具有1-2个独立地选自硫、氮和氧的杂原子的5-6元杂芳族环；其中，当存在一个R9基团时，R9不可以是氢，并且当存在两个R9基团时，一个必须是氢，而另一个必须不是氢；每个R10独立地选自由以下组成的组：氢、卤素、-CN、 -CF3、-OR、-NR2、-NO2、-COOR、-CONR2和-R；R11是氢、NH2、具有1-2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的4-7元任选取代的饱和杂环和具有1-2个独立地选自硫、氮和氧的杂原子的5-6元杂芳族环；R12是氢或任选取代的C1-6脂族；L是共价键或者直链或支链C1-6 脂族基团，其中一个或多个亚甲基独立地并且任选地被–NR14-或-O-取代；R13选自由以下组成的组：NH2、胍基、具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-7元任选取代的饱和杂环和具有1-2个独立地选自硫、氮和氧的杂原子的5-6元杂芳族环；每个R14独立地为氢或C1-3脂族；并且每个R独立地为氢或任选取代的C1-6脂族。
作为本发明的一个优选实施方案，所述富勒烯C60纳米晶体的制备方法是四氢呋喃 (THF)转水法，制备实验步骤如下：
(1)先将5份纳米C60粉末溶于500份未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h；
(2)再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以适当的转速加入等体积的去离子水使其转入水相；
(3)旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体。
作为本发明的一个优选实施方案，所述应用用于(1)增强C60纳米晶体杀伤肿瘤细胞的能力；(2)降低C60纳米晶体的使用剂量。
作为本发明的一个优选实施方案，所述应用为抑制骨肉瘤细胞增殖、促进骨肉瘤细胞死亡、促进骨肉瘤细胞凋亡、抑制骨肉瘤细胞成瘤。
本发明优点在于：
1、富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂可以有效地杀伤骨肉瘤细胞，增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力。
2、本发明通过联合C60纳米晶体与CaMKII抑制剂可以降低C60纳米晶体的使用剂量。
3、本发明组合物毒性低，对肿瘤的抑制效率高，治疗肿瘤效果好，有很好的应用前景。
附图说明
附图1是C60纳米晶体的透射电镜图像。
附图2是C60纳米晶体对骨肉瘤细胞活力的影响。
附图3是C60纳米晶体激活骨肉瘤细胞CaMKIIα。
附图4是KN-93对C60纳米晶体引发的骨肉瘤CaMKIIα活性的影响。
附图5是C60纳米晶体联合KN-93对骨肉瘤细胞的杀伤。
附图6是C60纳米晶体联合CaMKIIαsiRNA对骨肉瘤细胞的杀伤。
附图7是KN-93通过抑制AKT信号增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤。
附图8是实施例8的实验结果，其中图8A为各组剥离的肿瘤，图8B为给药期间每两天测量一次的肿瘤体积，图8C为各组剥离肿瘤的重量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物及其在骨肉瘤中的应用。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物(一)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司。
二、实验方法
通过四氢呋喃转水法合成了水溶性的C60纳米颗粒(nano-C60)，其制备方法如下：
(1)先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h；
(2)再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min 的转速加入等体积的去离子水使其转入水相；
(3)旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体。
三、实验结果
所制得的富勒烯C60纳米晶体用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征，结果如图1所示，直径为120nm，形状类似于六棱形。
实施例2 C60纳米晶体对骨肉瘤细胞活力的影响(二)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin，CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒(CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司； CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体(Cat.No.ab32678)购自于 Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜 (TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63，SaoS2，SJSA以及HOS均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2。
(3)细胞活力测定
本实验使用cck-8检测细胞活力。收集对数生长期的人骨肉瘤细胞系(143B，MG63，SaoS2，SJSA，HOS)，以3000个/孔的细胞数分入96孔板中，细胞贴壁后，加入不同浓度 (0、1.6、4.4μg/mL)的C60纳米晶体处理24h，然后进行检测。每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在 450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。
三、实验结果
CCK-8实验研究结果如图2所示，0.8μg/mL的C60纳米晶体对骨肉瘤细胞活力没有明显影响，1.6μg/mL的C60纳米晶体对骨肉瘤细胞活力有轻微抑制，而4.4μg/mL的C60纳米晶体几乎全部引起细胞的死亡。
实施例3 C60纳米晶体激活骨肉瘤细胞CaMKIIα(三)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin， CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒(CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司； CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体(Cat.No.ab32678)购自于 Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜 (TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2，143B及MG63首先经不同浓度的C60纳米晶体(0、0.8、1.6、2.4μg/mL)处理 12小时，或经2.4μg/mL的C60纳米晶体处理一系列不同的时间(0、0.5、3、6、12小时) 后收集细胞。
(3)细胞内CaMKIIα活性检测
143B及MG63经不同浓度的C60纳米晶体(0、0.8、1.6、2.4μg/mL)处理12h、经2.4μg/mL 的C60纳米晶体处理一系列不同的时间(0、0.5、3、6、12小时)后收集细胞，分别用CaMKII及phospho-T286CaMKII抗体检测CaMKIIα活性情况。
三、实验结果
当CaMKIIα自主活性被激活时，调节结构域与催化结构域无法重新结合，则暴露了调节结构域中位于自我抑制区的T286位点，因此此位点被磷酸化的几率增加。
分别检测了C60纳米晶体对骨肉瘤细胞143B及MG63中CaMKIIα的时间结果如图3B所示、剂量效应结果如图3A所示，结果显示，C60纳米晶体可显著提高骨肉瘤细胞CaMKIIα的T286位点的磷酸化水平，且具有时间和剂量依赖性。
实施例4 KN-93对C60纳米晶体引发的骨肉瘤CaMKIIα活性的影响(四)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin，CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒(CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司； CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体(Cat.No.ab32678)购自于Abcam 公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology 公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2。
(3)细胞内CaMKIIα活性检测
实验组：143B及MG63经1.6μg/mL的C60纳米晶体和10μM KN-93共同处理24h后收集细胞，分别用CaMKII及phospho-T286CaMKII抗体检测CaMKIIα活性情况。
对照组：143B及MG63经1.6μg/mL的C60纳米晶体处理24h后收集细胞，分别用CaMKII、 phospho-T286CaMKII及GAPDH抗体检测CaMKIIα活性情况。
三、实验结果
图4结果显示，与C60纳米晶体单独作用相比，10μM的KN-93与C60纳米晶体共处理可显著的抑制CaMKIIα的T286位点的磷酸化水平。说明KN-93的确可以抑制C60纳米晶体对骨肉瘤细胞CaMKIIα的激活。
实施例5 KN-93增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤(五)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin，CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒 (CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司；CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体 (Cat.No.ab32678)购自于Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63，SaoS2，SJSA以及HOS均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素 B，培养条件为37℃，5％CO2。
(3)细胞活力测定
实验组：分别用5μM的KN-93+1.6μg/mLC60纳米晶体和10μM的KN-93+1.6μg/mLC60纳米晶体共同处理143B细胞及MG63细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞活力检测：每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。
对照组：分别用5μM、10μM的KN-93单独处理143B细胞及MG63细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞活力检测：每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。
(4)细胞死亡检测
实验组:用10μM的KN-93和1.6μg/mLC60纳米晶体共同处理143B细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞死亡检测：用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色20分钟。PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例；然后进行细胞凋亡检测：143B细胞株经24h处理后，PBS洗涤一次，收集细胞。
对照组:用10μM的KN-93单独处理143B细胞，24h后收集细胞，进行细胞死亡检测：用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色20分钟。 PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例；然后进行细胞凋亡检测：143B细胞株经 24h处理后，PBS洗涤一次，收集细胞。
(5)细胞凋亡检测
实验组:用10μM的KN-93和1.6μg/mLC60纳米晶体共同处理143B以及MG63细胞，24h后收集细胞，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)检测细胞凋亡。用试剂盒中100μL的1×Binding缓冲液重悬，再加入5μL的AnnexinV-FITC和2.5μL的PI，室温孵育15min进行流式细胞仪进行检测。实验重复3次；然后进行凋亡蛋白检测：143B细胞株经24h后，PBS洗涤一次，收集细胞，进行westernblot实验，分别用Cleaved-PARP， cleaved-caspase3，Blc-2抗体检测细胞凋亡蛋白表达情况。
对照组:用10μM的KN-93和1.6μg/mLC60纳米晶体共同处理143B以及MG63细胞，24h后收集细胞，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)检测细胞凋亡。用试剂盒中100μL的1×Binding缓冲液重悬，再加入5μL的AnnexinV-FITC和2.5μL的PI，室温孵育15min进行流式细胞仪进行检测。实验重复3次；然后进行凋亡蛋白检测：143B细胞株经24h后，PBS洗涤一次，收集细胞，进行westernblot实验，分别用Cleaved-PARP， cleaved-caspase3，Blc-2抗体检测细胞凋亡蛋白表达情况。
三、实验结果
CCK-8实验的实验结果如图5A所示，5或10μM的KN-93或1.6μg/mLC60纳米晶体单独处理骨肉瘤细胞都可轻微的抑制细胞活力，而二者共同处理则显著的增强了细胞活力的抑制。PI/Hoechst染色实验表明，10μM的KN-93可以显著的增加C60纳米晶体对143B骨肉瘤细胞的杀伤(图5B)。AnnexinV-FITC/PI染色的流式结果显示，与单药组相比，KN-93与 C60纳米晶体共处理组显著的增强了细胞凋亡水平(图5C)。Westernblotting结果显示共处理组的凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3剪切增加，抗凋亡蛋白bcl-2的表达减少，说明凋亡水平的升高(图5D)
实施例6 CaMKIIαsiRNA增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤(六)
一、实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin，CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒 (CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司；CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体 (Cat.No.ab32678)购自于Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
二、实验方法
(1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜 (TEM)对其进行表征。
(2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63以及HOS均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2。
(3)细胞转染
143B细胞细胞培养在6孔板中，待细胞密度为60％时，以每孔20nMCaMKIIα siRNA(sc-29900,SantaCruzBiotechnology)，通过Lipofectamine2000(InvitrogenLifeTechnologies) 转入。将终浓度为20nM的CaMKIIαsiRNA及2μLLipofectamine2000分别加入150μ Lopti-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟后两管混合，再放置20分钟。六孔板细胞先用 PBS洗一遍，加入700μL无血清无抗生素DMEM，再加入混合物，轻轻晃匀。6小时后更换新鲜培养基，36-48小时后进行续实验。
(4)细胞活力测定
实验组：1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B CaMKIIαsiRNA细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞活力检测：每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。
对照组：1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B control siRNA细胞，24h后收集细胞，然后进行细胞活力检测：每孔加入用DMEM培养基稀释10倍的cck-8试剂100μL于37℃孵育40分钟，然后用酶标仪(ThermoScientific)在450nm处检测吸光度值。每个样重复三个复空。4)细胞死亡检测
实验组：1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B CaMKIIαsiRNA细胞，24h后，用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色20分钟。PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后每组随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例；然后进行细胞凋亡检测：143B细胞株经24h 处理后，PBS洗涤一次，收集细胞。
对照组：1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B control siRNA细胞，24h后，用10mM PI(碧云天，ST511)及10mM Hoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色20分钟。PBS 洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后每组随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例；然后进行细胞凋亡检测：143B细胞株经24h 处理后，PBS洗涤一次，收集细胞。
(5)细胞凋亡检测
1.6μg/mLC60纳米晶体处理143BCaMKIIαsiRNA细胞24h后，使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)检测细胞凋亡。用试剂盒中100μL的1×Binding缓冲液重悬，再加入5μL的AnnexinV-FITC和2.5μL的PI，室温孵育15min进行流式细胞仪进行检测。实验重复3次。
1.6μg/mLC60纳米晶体处理143B controlsi RNA细胞24h后，使用AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(BD公司)检测细胞凋亡。用试剂盒中100μL的1×Binding缓冲液重悬，再加入5μL的AnnexinV-FITC和2.5μL的PI，室温孵育15min进行流式细胞仪进行检测。实验重复3次。
三、实验结果
图6A结果显示，CaMKIIαsiRNA的确可以显著的减弱143B细胞CaMKIIα的表达。图6BCCK-8实验显示，与转染了control siRNA的细胞相比，转染CaMKIIαsiRNA的143B 细胞经1.6μg/mLC60纳米晶体处理后细胞活力显著下降。图6CPI/Hoechst染色实验表明， CaMKIIαsiRNA可以显著增加C60纳米晶体的细胞毒性作用。图6D AnnexinV-FITC/PI 染色的统计结果同样表明，降低了细胞中的CaMKIIα的表达，C60引发的细胞凋亡水平增加。凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3剪切也增加，抗凋亡蛋白bcl-2的表达减少(图6E)。
以上结果表明C60纳米晶体激活的CaMKIIα对于骨肉瘤细胞起到了一种促生存的保护作用从而抵抗C60纳米晶体本身对细胞的杀伤。所以抑制CaMKIIα的活性可以增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力。
实施例7抑制CaMKIIα活性可通过AKT信号增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤(七)
1实验材料
FullereneC60粉末、KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司；钙调蛋白(Calmodulin， CaM，208690)购自于美国Calbiochem公司；CaMKII活性检测试剂盒(CY-1173)购自于日本CycLex公司；pcDNA3-AKT-T7及pcDNA3-CA-AKT-T7质粒购自于长沙优宝生物公司； CaMKII抗体(Cat.No.ab52476)以及phospho-T286CaMKII抗体(Cat.No.ab32678)购自于 Abcam公司；Cleaved-PARP，cleaved-caspase3，Blc-2的抗体购自于CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗体(Cat.No.MAB374)购自于Millipore公司；细胞相关培养试剂购自于invitrogen公司。
2实验方法
1)富勒烯C60纳米晶体的制备与表征
四氢呋喃(THF)转水法，即先将5mg纳米C60粉末溶于500mL未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h，再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以1L/min的转速加入等体积的去离子水使其转入水相，然后旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50mL，合成富勒烯C60纳米晶体，并用透射电子显微镜(TEM)对其进行表征。
2)细胞培养
人骨肉瘤细胞株143B，MG63均购自美国菌种保藏中心(ATCC)。培养细胞所用DMEM培养基含10％胎牛血清，100units/mL青链霉素以及2.5μg/mL两性霉素B，培养条件为37℃，5％CO2。
3)细胞转染
143B细胞细胞培养在6孔板中，待细胞密度为60％时，将2μg的pcDNA3-AKT-T7 或pcDNA3-CA-AKT-T7质粒及3μLLipofectamine2000(InvitrogenLifeTechnologies)分别加入 150μLopti-MEM中，轻轻混匀，室温静置5分钟后两管混合，再放置20分钟。六孔板细胞先用PBS洗一遍，加入700μL无血清无抗生素DMEM，再加入混合物，轻轻晃匀。6 小时后更换新鲜培养基，36-48小时后进行续实验。
43)AKT活性检测、细胞活力检测
实验组：143B细胞及MG63细胞经C60纳米晶体和CaMKII抑制剂KN-93共同处理24h后，分别用分别用AKT、phospho-AKT及GAPDH抗体检测AKT活性情况；
接下来我们研究了AKT信号是否在KN-93促进C60纳米晶体杀伤肿瘤的效应中起关键作用：在143B细胞中，我们外转表达了pcDNA3-AKT-T7质粒，进一步，我们又外转表达了具有组成性活性的pcDNA3-CA-AKT-T7质粒，然后用C60纳米晶体和CaMKII抑制剂 KN-93共同处理24h后，用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天， C1022)于37℃染色20分钟。PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后每组随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例
对照组：143B细胞外转表达pcDNA3对照质粒后，经C60纳米晶体和KN-93处理24h后，用10mMPI(碧云天，ST511)及10mMHoechst33342(碧云天，C1022)于37℃染色 20分钟。PBS洗三次后在荧光显微镜(Leica,Wetzlar)下进行拍照。然后每组随机统计至少400个细胞，计算PI阳性的细胞与Hoechst阳性细胞的比例。
3实验结果
C60纳米晶体处理骨肉瘤143B及MG63细胞可激活细胞内的CaMKIIα活性，且通过westernblotting实验我们发现AKT磷酸化水平也随之升高。KN-93与C60共处理后，AKT 的磷酸化水平得到抑制(图7A)。通过表达AKT可显著的减弱KN-93与C60纳米晶体共处理所引发的143B细胞死亡(图7B)。进一步，我们又通过表达了具有组成性活性的 pcDNA3-CA-AKT-T7质粒，CA-AKT(T308D/S473D)的过表达进一步的缓解了联药导致的细胞死亡(图7C)，这些结果说明，AKT信号在KN-93与C60纳米晶体联药所诱导的骨肉瘤细胞死亡中起到了非常重要的作用，即抑制CaMKIIα是通过抑制AKT活性来增强C60纳米晶体对骨肉瘤细胞的杀伤。
4实验结论
以上结果表明C60纳米晶体激活的CaMKIIα对于骨肉瘤细胞起到了一种促生存的保护作用从而抵抗C60纳米晶体本身对细胞的杀伤。所以抑制CaMKIIα的活性可以增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力。
实施例8 KN-93增强C60纳米晶体对骨肉瘤的杀伤的体内研究(八)
一、实验材料
雄性BALB/c裸鼠(6-8周)购自上海斯莱克动物中心，PBS，FullereneC60粉末、 KN-93(Cat.No.K1385)购自于Sigma公司
二、实验方法
1、143B皮下肿瘤模型建立：
雄性BALB/c裸鼠(6-8周)，剔除腋下毛后，含有1×106的143B细胞的无菌冰PBS100μL 皮下注射进裸鼠腋下，即可制得143B皮下肿瘤模型。
2、分组
将上述制备得到的143B皮下肿瘤模型裸鼠随机分成四组，分别为PBS组、C60纳米晶体(nano-C60)组、KN-93组、nano-C60+KN-93组，每组五只。
3、给药
一周后分别对每组小鼠进行肿瘤皮下给药，Nano-C60组给药剂量为0.2mg/kg，KN-93 组给药剂量为0.5mg/kg，nano-C60+KN-93组给药剂量为0.1mg/kg的C60纳米晶体+0.4mg/kg 的KN-93，每两天给一次药。
4、检测
分别对上述每组裸鼠体重和肿瘤体积每两天检测一次。瘤体积计算公式为：(length×width2)/2，自给药开始14天后，牺牲裸鼠，剥取皮下肿瘤称重。
三、实验结果
在143B皮下肿瘤模型中，图7A为各组剥离的肿瘤，图7B为给药期间每两天测量一次的肿瘤体积，图7C为各组剥离肿瘤的重量。结果显示，与单药组相比，KN-93与C60纳米晶体联药组显著的抑制了肿瘤细胞的体积与重量。
四、实验结论
以上实验结果表明，KN-93与C60纳米晶体联合使用可以增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力，降低C60纳米晶体的使用剂量。
本发明的组合物C60纳米晶体与CaMKII抑制剂联合使用可以有效地杀伤骨肉瘤细胞，增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力；降低C60纳米晶体的使用剂量；本发明组合物毒性低，对肿瘤的抑制效率高，治疗肿瘤效果好，有很好的应用前景。
这些结果以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂的组合物在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用，所述CaMKII抑制剂是KN-93，所述富勒烯C60纳米晶体的粒径为100-140nm，所述富勒烯C60纳米晶体的浓度是1.6μg/ml，所述KN-93的浓度是5μM或10μM。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述富勒烯C60纳米晶体联合CaMKII抑制剂是通过抑制AKT信号通路增强对骨肉瘤细胞的杀伤。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述富勒烯C60纳米晶体为水溶性的富勒烯C60纳米晶体，形状为六棱形，可以光诱导产生氧自由基，C60表面活泼的π键结构很容易在其表面引入其他的结构，具有活跃的化学反应能力。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述富勒烯C60纳米晶体的制备方法是四氢呋喃(THF)转水法，具体实验步骤如下：
(1)先将5份C60纳米粉末溶于500份未开封的四氢呋喃，室温避光搅拌24h；(2)再用0.45μm的滤膜滤掉未溶解的C60颗粒，滤液在磁力搅拌器上搅拌，并以适当的转速加入等体积的去离子水使其转入水相；
(3)旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，进一步蒸发将溶液浓缩至50份，合成富勒烯C60纳米晶体。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用为：(1)增强C60纳米晶体杀伤骨肉瘤细胞的能力；(2)降低C60纳米晶体的使用剂量。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用是抑制骨肉瘤细胞增殖、促进骨肉瘤细胞死亡、促进骨肉瘤细胞凋亡、抑制骨肉瘤细胞成瘤。
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