CN108904503A - 6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶在治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了6‑氯‑5‑硝基‑2,4‑二氨基嘧啶在治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用，所述6‑氯‑5‑硝基‑2,4‑二氨基嘧啶的合成方法是以盐酸胍、氨基甲酰乙酸乙酯和NaClO在酸性条件下于有机溶剂中反应制得目标化合物。本发明通过实验研究首次发现6‑氯‑5‑硝基‑2,4‑二氨基嘧啶具有优良的抗CML药效，可以用于制备治疗CML的药物。
Description
技术领域
本发明具体涉及6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的合成方法及其在制备慢性粒细胞白血病药物中的应用，属于医药化学领域。
背景技术
白血病（Leukemia）是一群癌症种类的统称，通常发病于骨髓，造成不正常白血球的大量增生，这些异常增加的白血球都尚未发育完成，称之为芽细胞或白血病细胞。慢性粒细胞性白血病（Chronic Myelocytic Leukemia，CML），源自费城染色体（Philadelphiachromosome）的染色体易位现象即9号染色体长臂移至22号染色体短臂上，该类白血病占整体白血病每年新症患者约15%，具体表现为人体骨髓中的主要粒细胞不受管制地增长，并在血液中积累而形成，通常伴生一种骨髓增生性疾病。目前针对该类白血病主要采用标靶治疗方式如药物伊马替尼（imatinib）、达沙替尼（dasatinib）和尼罗替尼（nilotinib）等。随着该类酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKI)的问世，越来越多的慢性粒细胞白血病患者从中获益,且生活质量明显改善。但目前面临的药物毒副作用、不耐受、耐药、疾病进展、停药复发等问题仍使该类白血病的治疗面临巨大挑战，因此寻找安全有效、毒副作用小的抗CML药物在该类疾病的治疗中尤其重要。
式Ⅱ
6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶其结构中存在嘧啶母核类似结构，作为一种常用中间体化合物，目前尚未有明确的药理研究，相关专利（US 5863924）公开了一系列可作为5-HT2B受体拮抗剂的芳基嘧啶衍生物（结构见式Ⅱ），说明该母核结构化合物作为5-HT2B受体拮抗剂具有良好的成药性，但其未涉及白血病的治疗。
发明内容
本发明的一个目的是提供6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶（CAS：6036-64-2）在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的用途。
本发明的另一个目的是提供6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备方法。
本发明实现过程如下：
6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶在治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
上述6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的合成方法如下：
以盐酸胍、氨基甲酰乙酸乙酯和NaClO在酸性条件下于有机溶剂中反应制得目标化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶。
具体合成方法包括以下步骤：
（1）将盐酸胍和氨基甲酰乙酸乙酯用有机溶剂溶解，加入酸性试剂调节pH为5~5.5，加热到60℃~80℃，回流反应；
（2）向反应体系中继续加入NaClO，保持步骤（1）温度不变，继续回流反应；
（3）停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中加入金属硝酸盐和醋酐，继续反应；
（4）薄层层析方法跟踪反应至完全，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，洗涤滤饼得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品；
（5）将6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品加入有机溶剂重结晶，过滤、干燥即可。
步骤（1）中的有机溶剂选自乙醇、异丙醇或乙腈，进一步优选为乙醇，回流反应10~12小时，回流温度优选为65℃。
步骤（1）中的盐酸胍和氨基甲酰乙酸乙酯的摩尔比为1:1~1:1.5，进一步优选为1:1.2。
步骤（1）中的酸性试剂选自ZnCl2、AlCl3、盐酸、冰醋酸，进一步优选为冰醋酸。
步骤（2）中回流反应2~3小时。
步骤（3）中的金属硝酸盐选自硝酸钾或三水硝酸铜，进一步优选为三水硝酸铜，金属硝酸盐和醋酐的摩尔比为4:1~6:1，优选为5:1，磁力搅拌下反应30~40分钟。
上述步骤（5）中的重结晶溶剂为乙醇。
本发明通过实验研究首次发现6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶具有优良的抗CML药效，可以用于制备治疗CML的药物。本发明制备方法采用“一锅法”，制备简单，产率高。本发明公开的6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶在制备治疗CML的应用属于首次公开，将其用于CML的治疗具有显著的新颖性和创造性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。
实施例1
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于100mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍100mg（1.04mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯164mg（1.25mmol）溶于45mL乙醇，磁力搅拌下缓慢滴加冰醋酸调节体系pH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入37mg（0.50mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（硝酸钾：醋酐（5：1））硝酸钾162mg（1.51 mmol）和醋酐31mg（0.31mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于40mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品125.1mg（0.66mmol），总摩尔收率为63.5%。
1H-NMR (300MHz, DMSO-d 6 ) δ (ppm): 8.65 (2H, s), 6.42 (2H, s); 13C-NMR(75MHz, DMSO-d 6 ) δ (ppm):170.1, 155.8, 114.3, 130.2; MS (ESI) for (M+H)+:190.0。
实施例2
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于100mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍100mg（1.04mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯164mg（1.25mmol）溶于45mL乙醇，磁力搅拌下加入适量ZnCl2固体调节体系PH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入37mg（0.50mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（硝酸钾：醋酐（5：1））硝酸钾162mg（1.51 mmol）和醋酐31mg（0.31mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于40mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品92.8 mg（0.49mmol），总摩尔收率为47.5%。
实施例3
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于100mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍80mg（0.84mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯132.4mg（1.01mmol）溶于40mL乙腈，磁力搅拌下缓慢滴加HCl调节体系PH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入29mg（0.40mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（硝酸钾：醋酐（5：1））硝酸钾93mg（0.92 mmol）和醋酐18mg（0.18mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于35mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品87.2mg（0.46mmol），总摩尔收率为54.8%。
实施例4
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于100mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍80mg（0.84mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯132.4mg（1.01mmol）溶于40mL乙腈，磁力搅拌下缓加入适量的AlCl3调节体系PH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入29mg（0.40mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（硝酸钾：醋酐（5：1））硝酸钾93mg（0.92 mmol）和醋酐18mg（0.18mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于35mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品79.6mg（0.42mmol），总摩尔收率为50.4%。
实施例5
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于100mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍100mg（1.04mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯164mg（1.25mmol）溶于45mL异丙醇，磁力搅拌下缓慢滴加冰醋酸调节体系PH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入37mg（0.50mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（硝酸钾：醋酐（5：1））硝酸钾162mg（1.51 mmol）和醋酐31mg（0.31mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于40mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品102.4mg（0.54mmol），总摩尔收率为51.7%。
实施例6
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于100mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍100mg（1.04mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯164mg（1.25mmol）溶于45mL异丙醇，磁力搅拌下缓慢滴加HCl调节体系PH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入37mg（0.50mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（硝酸钾：醋酐（5：1））硝酸钾162mg（1.51 mmol）和醋酐31mg（0.31mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于40mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品94.8mg（0.50mmol），总摩尔收率为48.3%。
实施例7
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于250mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍100mg（1.04mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯164mg（1.25mmol）溶于100mL乙醇，磁力搅拌下缓慢滴加冰醋酸调节体系PH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入37mg（0.50mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（三水硝酸铜：醋酐（5：1））三水硝酸铜318mg（1.32 mmol）和醋酐27mg（0.31mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于50mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品85.3mg（0.45mmol），总摩尔收率为43.2%。
实施例8
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于250mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍80mg（0.84mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯132.4mg（1.01mmol）溶于100mL乙腈，磁力搅拌下缓慢滴加冰醋酸调节体系PH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入29mg（0.40mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（硝酸钾：醋酐（5：1））三水硝酸铜251mg（1.04 mmol）和醋酐21mg（0.31mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于40mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品64.5mg（0.34mmol），总摩尔收率为40.1%。
实施例9
化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的制备
于250mL圆底烧瓶中，按投料比（盐酸胍: 氨基甲酰乙酸乙酯(1:1.2)）将盐酸胍100mg（1.04mmol）、氨基甲酰乙酸乙酯164mg（1.25mmol）溶于45mL异丙醇，磁力搅拌下缓慢滴加冰醋酸调节体系PH≈5，加热到65℃，反应12小时后加入37mg（0.50mmol）NaClO，继续反应2小时，停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中按摩尔比（硝酸钾：醋酐（5：1））三水硝酸铜318mg（1.32 mmol）和醋酐27mg（0.31mmol），磁力搅拌下反应30分钟，用薄层色谱监控反应，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品。进一步将粗品置于40mL乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到目标化合物精品79.6mg（0.42mmol），总摩尔收率为40.8%。
实施例10
CCK8法检测6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶对6种白血病细胞的生长抑制效应
细胞株：HL-60（急性髓细胞白血病），Jurkat（急性T细胞白血病），K562（慢性粒细胞白血病），EOL-1（人嗜酸性粒细胞白血病），Dami（人巨核细胞白血病）、6T-CEM（人T细胞白血病）均由广东医学院附属医院提供。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，青霉素100U/mL,链霉素100mg/L，37℃，5% CO2，饱和湿度培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。
药物：用生理盐水配制伊马替尼溶液和6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶溶液，使药物最终浓度均为1、5、10、50、100 μmol/L五种浓度。
试验方法：取对数生长期白血病细胞株，计数，以1×105/mL 的密度接种于96孔培养板中，每孔100μL。培养24 h后，每孔加入100 μL双倍浓度含有不同浓度化合物的培养基。以含最高浓度的DMSO的培养液作为溶剂对照。药物作用48h后，每孔加入20μL CCK8显色液，37 ℃显色，用酶标仪测定OD450，直至吸光度为1.5左右。计算抑制率，公式：抑制率(%) =(1-给药组吸光度值/对照组吸光度值)×100%，见下表1、2。
实验结果显示，6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶对所测试的6种白血病细胞系的抑制结果差异巨大，其中对如HL-60、Jurkat等白血病细胞系几乎没有抑制效果甚至出现促进作用。而特别的对K-562细胞系表现出良好的抑制作用，在10 μmol/L的浓度下抑制率超过药物伊马替尼。因此，本发明所提供的6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶可作为选择性慢性粒细胞白血病药物的制备。
实施例11
对接种K-562细胞株的裸鼠的抑制试验
受试药物：分别称取6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶、伊马替尼一定量，加生理盐水溶解即可。
给药途径：腹腔注射(ip) 。
试验动物：裸鼠，SPF级。
细胞株：慢性粒细胞白血病细胞株K-562，来自广东医学院附属医院。
试验方法：裸鼠50只、体重18~22g，雌雄兼用。取接种7~8 天的K-562细胞株按1:10稀释计数、使终浓度为白血病细胞1000 万个/mL；每只鼠右腋皮下接种0.2mL (含200百万个白血病细胞)。次日随机均分5组：6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶组(剂量：3mg/kg )、6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶组(剂量：8mg/kg )、6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶组(剂量：20mg/kg )，阳性对照组(伊马替尼，8mg/kg )及空白对照组。6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶组及阳性对照组每天给药一次，连续给药7 天；空白对照组则给予相应体积NS液。末次给药后停药一天。脱颈处死动物，称体重及剖瘤称重。计算各组瘤重，按下列公式求出白血病抑制率，并进行检验，公式：肿瘤抑制率=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%，见下表3。
接种K-562细胞株的裸鼠的抑制试验结果显示，8 mg/kg 的注射6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶连续给药7 天，K-562移植瘤抑制率为75.18%, 且由给药前后体重可以看出，无明显毒性。
Claims (9)
1.6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶在治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶的合成方法如下：
以盐酸胍、氨基甲酰乙酸乙酯和NaClO在酸性条件下于有机溶剂中反应制得目标化合物6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于合成方法包括以下步骤：
（1）将盐酸胍和氨基甲酰乙酸乙酯用有机溶剂溶解，加入酸性试剂调节pH为5~5.5，加热到60℃~80℃，回流反应；
（2）向反应体系中继续加入NaClO，保持步骤（1）温度不变，继续回流反应；
（3）停止加热，待反应体系温度降至常温，在冰水浴下继续向反应体系中加入金属硝酸盐和醋酐，继续反应；
（4）薄层层析方法跟踪反应至完全，待体系冷却完全，将反应体系的固液混合物减压蒸去溶剂，过滤，洗涤滤饼得6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品；
（5）将6-氯-5-硝基-2,4-二氨基嘧啶粗品加入有机溶剂重结晶，过滤、干燥即可。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于：步骤（1）中的有机溶剂选自乙醇、异丙醇或乙腈。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于：步骤（1）中的盐酸胍和氨基甲酰乙酸乙酯的摩尔比为1:1~1:1.5。
6.根据权利要求3所述应用，其特征在于：步骤（1）中的酸性试剂选自ZnCl2、AlCl3、盐酸、冰醋酸。
7.根据权利要求3所述应用，其特征在于：步骤（3）中的金属硝酸盐选自硝酸钾或三水硝酸铜。
8.根据权利要求3所述应用，其特征在于：步骤（3）中的金属硝酸盐和醋酐的摩尔比为4:1~6:1。
9.根据权利要求3所述应用，其特征在于：上述步骤（5）中的重结晶溶剂为乙醇。
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