CN108885212A

CN108885212A - 固定生物分子的方法

Info

Publication number: CN108885212A
Application number: CN201780012504.7A
Authority: CN
Inventors: H·施罗德; M·格里斯纳; R·克拉海默; F·林德斯
Original assignee: Blyngju G John Witt Medica Co Ltd
Current assignee: Blyngju G John Witt Medica Co Ltd
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2037-02-17
Also published as: JP2019505808A; CA3010905A1; EP3420355A1; WO2017144359A1; KR20180115276A; US10962534B2; CN108885212B; BR112018017141A2; US20170241998A1; JP7005504B2

Abstract

本发明涉及一种用于固定含有至少一个巯基的生物分子的方法，该方法包括使改性的金属表面与生物分子接触，在光引发剂存在下用紫外线照射所得表面，其中用交联剂化合物改性所述金属表面，该交联剂化合物包含与金属表面共价连接的末端硫醇基或二硫醇基、间隔基，所述间隔基的另一个末端携带着一个分离的双键或三键。

Description

固定生物分子的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求保护2015年2月22日提交的欧洲专利申请EP16156777.1的优先权权益；本申请的完整内容在此处通过引用并入全文。

发明背景

1.技术领域

本发明涉及一种固定含有至少一个巯基的生物分子的方法，该方法包括使改性的金属表面与生物分子接触，在存在光引发剂的情况下用紫外线照射所得表面，其中所述金属表面用交联剂化合物改性，此交联剂化合物包含与金属表面共价连接的末端硫醇基或二硫醇基基团、间隔基团，其在另一末端携带分离的双键或三键。

2.现有技术

检测和定量样品中存在的分析物(如影响生物过程的生物分子或其他分子)是分析性测试不可或缺的。例如，检测作为生物活性或疾病标志物的生物分子对于医疗状况和病理的诊断是重要的。然而，将分析物(例如生物分子)的检测转换成可用的信号具有挑战性，这部分是由于将检测事件(例如结合抗原的抗体)转变成可检测的信号的复杂性，此可检测的信号可以转化为可感知的数据。一些测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，通过监测产生光的结合事件或在样品中产生颜色变化的反应产物来检测生物分子。这些类型的测定的一个优势是它们非常敏感。然而，诸如ELISA测定的这些测定的缺点是它们通常需要很长时间来产生可检测的信号并需要多个步骤来完成。

最近，其他方法正在开发中，其保留了传统免疫测定的灵敏度，同时消除了开发信号所涉及的复杂性和时间。一种策略是将免疫测定的灵敏度(例如通过使用对分析物具有高亲和力的高选择性抗体)与电化学测量结合起来。通过将检测事件与电信号相结合，可以立即将样品中有关分析物的存在和浓度的信息转换成电信号。在过去的几十年中，已经开发了几种传感概念和相关设备。最常见的传统技术包括循环伏安法、计时安培法、计时电位法和阻抗谱法。

然而，电化学传感器的一般性能通常由将传感元件连接至纳米级生物样品的表面结构决定。电化学生物传感器缺乏对期望的生化事件响应有足够高的灵敏度和唯一识别的表面结构。

因此，存在对具有传统测定(例如ELISA测定)的高灵敏度，同时维持电化学传感器的可期望的方面(如容易可测量的信号和小型化的前景)的电化学生物传感器的需求。

美国专利申请US 2012/0228155涉及制造用于检测靶分析物的功能化电极的方法，其包括：

接触导电表面，例如，带有混合物的金电极，所述混合物包含具有末端氨基的第一硫醇化合物和具有末端OH、烷氧基、甲基、糖、两性离子或极性非离子基团的第二硫醇化合物，其中所述第一和第二硫醇化合物上的巯基与所述导电表面结合，从而在所述导电表面的表面上形成单层；

使所述导电表面的表面上的单层与包含胺反应性官能团和双吖丙啶或马来酰亚胺部分的异双功能连接基接触；和

使导电表面的表面上的单层与特异性结合靶分析物的配体接触，由此制备用于检测靶分析物的功能化电极。

如果异双功能连接基包含磺基-NHS双吖丙啶(磺基-SDA)，则该方法进一步包括将导电表面的表面上的单层暴露于紫外线辐射，由此制备用于检测靶分析物的功能化电极。

美国专利US 8,580,571涉及用于制造生物传感器的方法，此生物传感器包括与亲水性聚合物结合的基底，所述方法包括以下步骤：

在基底上形成自组装单层，其中自组装单层由烷烃硫醇形成；将含有光自由基发生剂(photo radical generator)的溶液涂布到该基底上，以允许光自由基发生剂结合到在该基底上的自组装单层；在该基底上涂布含有亲水性聚合物的溶液，其中所述亲水性聚合物是具有羧基和双键的多糖，将该基底曝于光下以从所述光自由基发生剂产生反应性基团，并通过所述亲水性聚合物的双键将所述亲水性聚合物共价结合到所述反应性基团上，由此制备包含与亲水性聚合物结合的基底的生物传感器，其中，在生物传感器中与基底结合的亲水性聚合物中所含的羧基用于将目的生理活性物质固定到生物传感器上。

中国专利申请CN 104 597 230提出了用于制造官能化聚合物膜的方法，该方法包括以下步骤：

在生物芯片的基底的表面上形成末端功能化的自组装单分子层，例如，与金表面连接的末端功能化硫醇或二硫醇化合物；通过化学键合将光交联剂接枝到自组装单分子层的末端，例如，苯基双吖丙啶；在形成的所得表面上旋涂聚合物溶液；对具有旋涂聚合物表面的生物芯片进行UV照射，以在UV光下形成化学键合，以使聚合物接枝到表面来形成聚合物膜。

发明简述

因此，本发明涉及用于固定含有至少一个巯基的生物分子的方法，该方法包括以下步骤：

(a)任选用还原剂处理生物分子以断开生物分子中存在的-S-S-桥，或者

(b)任选用携带有受保护的巯基的酰化剂处理生物分子和使所述巯基脱保护；

(c)使改性的金属表面与生物分子接触；

(d)在光引发剂存在下用紫外线照射所得表面，

其中所述金属表面用交联剂化合物来改性，所述交联剂化合物包括：

a.共价连接到金属表面的末端巯基或二巯基，所述末端硫醇基或二硫醇基连接到

b.间隔基，所述间隔基的另一个末端携带有分离的C-C-双键或C-C-三键。

此外，本发明涉及式(I)的化合物，

HS-(CH₂)_m-CH(ZH)-间隔基-(CH₂)_p-A (I)

其中

m是2至6的整数，

A选自-CH＝CH₂和-C≡CH，和

Z是S或单键

间隔基是下式的基团

-(CH₂)_n-(C＝O)_x-Y-(CH₂CH₂-O)_y-(CH₂)_r-(C＝O)_v-X-

其中

X和Y各自独立地为NH或O，

n为0或者1至10的整数，

x和v各自独立地为0或1，

y是1至20的整数，

r和p各自独立地选自1至6的整数。

本发明的另一方面是式(II)的中间体，

其中A、间隔基、m和s具有式(I)给予的含义。

此外，本发明涉及改性的金属表面，其中根据本发明的式(I)的化合物的至少一个硫醇基与该表面的金属原子的至少一个共价连接。

本发明的最后一个方面是进行根据本发明固定生物分子的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)具有根据本发明的改性的金属表面的基底；

(ii)任选的含有合适的还原剂的容器单元(containment unit)，或者

(iii)任选的容器单元，所述容器单元含有合适的携带受保护的巯基的酰化剂和用于巯基的脱保护剂。

(iv)含有合适的光引发剂的容器单元，和

(v)说明进行所述方法的条件的说明书。

附图简述

图1显示了与用硫辛酰胺-PEG(11)-马来酰亚胺改性的表面相比，在不同条件下，根据本发明的互补金属氧化物半导体(CMOS)芯片的荧光图。

图2显示了其上固定了单克隆小鼠抗体的根据本发明的CMOS芯片的荧光图片。

图3显示了其上固定了多克隆兔抗ACTH抗体的根据本发明的CMOS芯片的荧光图片。

图4显示了根据本发明的固定生物分子的示意图。

发明详述

I.术语列表

除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes VII,published by Oxford University Press,2000(ISBN019879276X)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by B1ackwel1Publishers,1994(ISBN 0632021829)；和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by Wiley,John&Sons,Inc.,1995(ISBN 0471186341)；以及其他类似参考。

除非上下文另有明确指出，否则本文所用的单数术语“一个”，“一种”和“所述”包括复数指代物。类似地，除非上下文另有明确指示，否则措词“或”旨在包括“和”。并且，本文所用的术语“包含”意味着“包括”。因此“包含A或B”意味着包括A、B、或A和B。还应该理解的是，核酸或多肽或其他化合物给出的所有核苷酸大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子量值是近似的，并且被提供用于描述。尽管与本文所述那些相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但下文描述了合适的方法和材料。如果发生冲突，将以本说明书(包括术语解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的而不意在是限制性的。

为了便于回顾本公开的各种实例，提供了对特定术语的以下解释：

生物分子：生物活性分子，其可以来自生物来源或者可以合成生产。

过敏原：能够刺激I型超敏反应的非寄生抗原。I型过敏反应产生针对其他无害抗原的免疫球蛋白E(IgE)抗体，此抗原称为过敏原，其可源自多种过敏原来源(例如螨虫、植物花粉、动物、昆虫、霉菌和食物)。IgE介导的过敏原向T细胞的呈递导致T细胞活化和慢性过敏性炎症(例如慢性哮喘、特应性皮炎)，特别是在重复接触过敏原之后。此事件还诱导过敏原特异性血清lgE水平和患者的增加。常见的过敏原包括：源自植物例如树木的那些，如疣皮桦(Betula verrucosa)过敏原Bet v I、Bet v 2和Bet v 4；酸刺柏(Juniperousoxycedrus)过敏原Jun o 2；欧洲栗(Castanea sativa)过敏原Cas s 2；和橡胶树(Heveabrasiliensis)过敏原Hev b I、Hev b3、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10和Hev b 11；禾本植物类，如梯牧草(Phleum pretense)过敏原Phl p I、Phl p 2、Phl p 4、Phl p Sa、Phlp 5、Phlp 6、Phlp 7、Phl p 11和Phl p 12；杂草类(weeds)，例如欧蓍草(Parietaria judaica)过敏原Par j 2.01011；和艾草(Artemisia vulgaris)过敏原Art v I和Art v 3；螨虫类，例如屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)过敏原Der p I、Der p 2、Derp 5、Der p7、Der p 8和Der p 10；腐食酪螨(Tyrophagu putrescentiae)过敏原Tyr p 2；害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destrtuctor)过敏原Lep d2.01和Lep d 13；以及埋内宇尘螨(Euroglyphus maynei)过敏原Eur m2.0101；动物类，例如猫，如家猫(Felis domesticus)过敏原Fel d I；棕虾(Penaeus aztecus)过敏原Pen a I；鲤鱼(Cyprinus carpo)过敏原Cyp c I；以及来自猫、狗、牛、小鼠、大鼠、猪、羊、鸡、兔子、仓鼠、马、鸽子和豚鼠；真菌，例如桔青霉(Penicillium citrinum)过敏原Pen c 3和Pen c 19；点青霉(Penicilliumnotatum)过敏原Penn13；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)过敏原Asp f I、Asp f3、Aspf4、Asp f6、Asp f7和Asp f8；链格孢(Alternaria alternata)过敏原Alt a I和Alt a 5；糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)过敏原Mal f I、Mal f5、Mal f 6、Mal f 7、Mal f 8和Malf 9；昆虫，例如德国姬蠊(Blatella germanica)过敏原Bla g 2、Bla g 4和Bla g 5；意大利蜜蜂(Apis mellifera)过敏原Api m 2和Api m I；普通黄胡蜂(Vespula vulgaris)过敏原Ves v 5；德国黄胡蜂(Vespula germanica)过敏原Ves g 5；和长脚蜂(Polstesannularis)过敏原Pol a 5；食物，例如苹果(Malus domestica)过敏原Mal d I和Mal d 2；芹菜(Apium graveolens)过敏原Api g I和Api g 1.0201；胡萝卜(Daucus carota)过敏原Dau c I；和落花生(Arachis hypogaea)过敏原Ara h 2和Ara h 5等。在一些实施方案中，过敏原或其部分是功能化表面或电极的一部分，因此公开的功能化表面可用于测定样品中特异性结合过敏原的抗体的存在和浓度。在一些实施方案中，特异性结合抗原或其部分的抗体是公开的功能化表面或电极的部分，因此公开的功能化电极可被用于测定过敏原的存在和浓度。

“抗体”统称为免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子(包括例如，且不限于，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM和其组合)，以及在脊索动物中(如脊椎动物，例如在哺乳动物如人、山羊、兔子和小鼠中)和其片段的免疫应答过程中产生的相似分子，所述片段特异性结合目的分子(或高度相似的目的分子的基团)来基本排除与其他分子结合。“抗体”通常包含具有至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，该可变区特异性识别并结合抗原的表位。示例性抗体包体多克隆和单克隆抗体。

术语抗体还包括能够结合其他分析物的互补位序列。

免疫球蛋白由重链和轻链组成，各重链和轻链具有可变区，称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由免疫球蛋白识别的抗原。示例性免疫球蛋白片段包括而不限于，蛋白水解免疫球蛋白片段(例如本领域已知的F(ab')2片段、Fab'片段、Fab'-SH片段和Fab片段)、重组免疫球蛋白片段(例如sFv片段、dsFv片段、双特异性sFv片段、双特异性dsFv片段、F(ab)'2片段)、单链Fv蛋白(“scFv”)以及二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。抗体的其他实例包括双链抗体和三链抗体(如本领域已知的)和骆驼化抗体。“抗体”还包括基因工程分子，例如嵌合抗体。“抗体”还包括基因工程分子，例如嵌合抗体(如人源化鼠抗体)和异源偶联抗体(如双特异性抗体)。也参见，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

各重链和轻链包含恒定区和可变区(这些区域也被称为“结构域”)。组合时，重链和轻链可变区特异性结合抗原。重链和轻链可变区包含被三个高变区中断的“框架”区，所述高变区也被称为“互补决定区”或“CDR”。已经定义了框架区和CDR的范围(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition,U.S.Department of Health and Human Services,Public Health Service,NationalInstitutesof Health,Bethesda,Md.(NIH Publication No.91-3242)，其在此通过引用并入此文)。Kabat数据库现在在线维护。不同轻链或重链框架区的序列在一个物种内是相对保守的。抗体的构架区(即构成的轻链和重链的组合框架区)用于在三维空间中定位和排列CDR，例如使CDR保持在适当的方向以进行抗原结合。

CDR主要负责结合到抗原的表位。每条链的CDR通常被称为CDR1，CDR2和CDR3，从N端开始顺序编号，并且通常也由特定的CDR所在的链来识别。因此，VH CDR3位于发现它的抗体的重链的可变域中，而VL CDR1是来自其中发现它的抗体的轻链可变域的CDR1。

“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆产生的抗体，或者是由单一抗体的轻链和重链基因已转染或转导到其中的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞融合产生的杂合抗体形成细胞。这些融合细胞及其后代被称为“杂交瘤”。单克隆抗体包含人源化单克隆抗体。“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方案中，所有的CDR均来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不需要存在，但如果其存在，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，例如至少约85-90％，例如约95％或更多的相同。因此，可能除CDR以外，人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体结合与提供CDR的供体抗体相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以具有有限数量的取自供体框架的氨基酸取代。人源化或其他单克隆抗体可具有额外的保守氨基酸取代，所述取代对抗原结合或其他的免疫球蛋白功能没有实质上的影响。人源化免疫球蛋白可以利用基因工程构建(如参见美国专利No.5,585,089)。

在一些实施方案中，抗体特异性结合目的抗原，如作为公开的功能化电极的一部分的抗原，例如共价结合到本身已结合到电极表面的硫醇或二硫醇化合物或功能化硫醇或二硫醇化合物。在一些实施方案中，对目的抗原特异的抗体是公开的功能化电极的一部分，例如该抗体共价结合到本身已结合到电极表面的硫醇或二硫醇化合物或功能化硫醇或二硫醇化合物。在一些实施方案中，抗体是包含酶的检测试剂的一部分。

抗原：可被特异性体液或细胞免疫产物(如抗体分子或T细胞受体)特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括如半抗原、单纯的中间代谢物、糖(如寡糖)、脂质和激素以及大分子例如复合碳水化合物(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白质。常见的抗原类别包括但不限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、参与自身免疫性疾病的抗原、过敏反应和移植排斥、毒素以及本领域已知的其他抗原。

在一些实施方案中，抗原是目的抗体的配体，如作为公开的功能化电极的一部分的抗体，例如共价键合到本身结合到电极表面的硫醇或二硫醇化合物或功能化硫醇或二硫醇化合物。在一些实施方案中，目的抗原是公开的功能化电极的一部分，例如共价键合到本身结合到电极表面的硫醇或二硫醇化合物或功能化硫醇或二硫醇化合物。

适配体：结合特异性靶分子的小核酸和肽分子，所述特异性靶分子如靶生物分子，例如分析物，如靶分析物。在一些实例中，适配体是公开的改性表面例如功能化电极的一部分。

细菌性病原体：导致疾病的细菌(病原菌)。可从中获得在公开的功能化电极中使用的抗原的病原菌的实例包括但不限于以下的任何一种或多种(或其任何组合)：鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、猪放线杆菌(Actinobacillus sp.)、放线菌(Actinomycetes)、放线菌(Actinomyces sp.)(例如衣氏放线菌(Actinomyces israelii)和内氏放线菌(Actinomyces naeslundii))、气单胞菌(Aeromonas sp.)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维罗纳气单胞菌温和生物变种(Aeromonas veronii biovarsobria(温和气单胞菌(Aeromonas sobria))和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae))、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenesxylosoxidans)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)(例如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)和嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus))、拟杆菌属(Bacteroides sp.)(例如脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis))、巴尔通体属(Bartonella sp.)(例如杆菌状巴尔通(氏)体(Bartonellabacilliformis)和汉赛巴尔通体(Bartonella henselae))、双歧杆菌属(Bifidobacteriumsp.)、博德特氏杆菌属(Bordetella sp.)(例如百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博代氏杆菌(Bordetella parapertussis)和支气管败血性博代氏杆菌(Bordetellabronchiseptica))、包柔氏螺旋体(Borrelia sp.)(例如回归热螺旋体(Borreliarecurrentis)和伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属(Brucella sp.)(例如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melintensis)和猪布鲁氏杆菌(Brucella suis))、伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)(例如类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)和洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia))、弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus))、二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga sp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydophila psittaci)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)、伯纳特氏立克次体(Coxiella burnetii)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)(例如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeum)和棒状杆菌属(Corynebacterium))、梭菌属(Clostridium sp.)(例如产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)、梭状芽孢杆菌(Clostridium docile)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani))、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)(例如产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、聚团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)和大肠杆菌(Escherichia coli)，包括伺机性大肠杆菌(opportunisticEscherichia coli)，例如产毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli)、肠集聚性大肠杆菌(enteroaggregative E.coli)和尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic E.coli))，肠球菌属(Enterococcus sp.)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium))、埃里希氏体属(Ehrlichia sp.)(例如恰菲埃里希氏体(Ehrlichia chafeensia)和犬埃里希体(Ehrlichia canis))、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、真杆菌属(Eubacterium sp.)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)、嗜血杆菌属(Haemophilus sp.)(例如Haemophilus injluenzae、杜克雷(氏)嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、Haemophilus parainjluenzae、溶血性嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)和副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus))、缠绕杆菌属(Helicobacter sp.)(例如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、同性恋螺旋杆菌(Helicobacter cinaedi)和芬纳尔螺杆菌(Helicobacter fennelliae))、Eingella kingii、Elebsiella sp.、(例如Elebsiellapneumoniae、Elebsiella granulomatis和Elebsiella oxytoca)、乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、消化链球菌属(Peptostreptococcus sp.)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、摩根菌属(Morganella sp.)、动弯杆菌属(Mobiluncussp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)(例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和海分枝杆菌(Mycobacterium marinum))、支原(质)体属(Mycoplasm sp.)(例如肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人(型)支原体(Mycoplasmahominis)和生殖器支原体(Mycoplasma genitalium))、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)(例如星形诺卡(氏)菌(Nocardia asteroides)、盖尔森基兴奴卡氏菌(Nocardiacyriacigeorgica)和巴西诺卡(氏)菌(Nocardia brasiliensis))、奈瑟(氏)菌属(Neisseria sp.)(例如淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎萘瑟(氏)菌(Neisseria meningitidis))、出血败血性巴斯德(氏)菌(Pasteurella multocida)、类志贺(氏)毗邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、普鲁氏菌属(Prevotella sp.)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas sp.)、产黑普雷沃氏菌(Prevotella melami nogenica)、变形杆菌属(Proteus sp.)(例如普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和奇异变形杆菌(Proteusmirabilis))、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)(例如产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)和斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii))、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、马红球菌(Rhodococcus equi)、立克次氏体属(Rickettsiasp.)(例如立克(氏)立克次(氏)体(Rickettsia rickettsii)、螨立克次体(Rickettsiaakari)和普氏立克次(氏)体(Rickettsia prowazekii)、恙虫病立克次体(Orientiatsutsugamushi)(原名：斑疹伤寒立克次体(Rickettsia tsutsugamushi))和地方性斑疹伤寒立克次(氏)体(Rickettsia typhi))、红球菌属(Rhodococcus sp.)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、嗜麦寡养食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、沙门(氏)菌(Salmonella sp.)(例如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门(氏)菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门(氏)菌(Salmonella enteritidis)、猪霍乱沙门菌(Salmonella cholerasuis)和鼠伤寒沙门(氏)菌(Salmonella typhimurium))、沙雷(氏)菌属(Serratia sp.)(例如粘质沙雷氏菌属(Serratia marescens)和液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens))、志贺(氏)菌属(Shigella sp.)(例如志贺(氏)痢疾菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺(氏)菌(Shigella flexneri)、波伊德氏志贺(氏)菌(Shigella boydii)和宋内志贺菌(Shigellasonnei))、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)(例如金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushemolyticus)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus))、链球菌属(Streptococcus sp.)(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(例如氯霉素抗性血清型4肺炎链球菌(chloramphenicol resistant serotype 4Streptococcuspneumoniae)、壮观菌素抗性血清型6B肺炎链球菌(spectinomycin-resistant serotype6B Streptococcus pneumoniae)、链霉素抗性血清型9V肺炎链球菌(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、红霉素抗性血清型14肺炎链球菌(erythromycin-resistant serotype14Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌(optochin-resistant serotype 14Streptococcus pneumoniae)、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcuspneumoniae)、四环素抗性血清型19F肺炎链球菌(tetracycline-resistant serotype 19FStreptococcus pneumoniae)、青霉素抗性血清型19F肺炎链球菌(penicillin-resistantserotype 19F Streptococcus pneumoniae)和甲氧苄氨嘧啶抗性血清型23F肺炎链球菌(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、氯霉素抗性血清型4肺炎链球菌(chloramphenicol-resistant serotype 4Streptococcus pneumoniae)、壮观菌素抗性血清型6B肺炎链球菌(spectinomycin-resistant serotype 6BStreptococcus pneumoniae)、链菌素抗性血清型9V肺炎链球菌(streptomycin-resistantserotype 9V Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌(optochin-resistant serotype14Streptococcus pneumoniae)、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、青霉素抗性血清型19F4肺炎链球菌(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcuspneumoniae)、或甲氧苄氨嘧啶抗性血清型23F肺炎链球菌(trimethoprim resistantserotype 23F Streptococcus pneumoniae))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A族链球菌属(Group A streptococci)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、B族链球菌属(GroupB streptococci)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、C族链球菌属(Group Cstreptococci)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、类马链球菌(Streptococcusequismilis)、D族链球菌属(Group D streptococci)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、F族链球菌属(Group F streptococci)和咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、G族链球菌属(Group G streptococci))、鼠咬热螺旋体(Spirillum minus)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformi)、梅毒螺旋体(Treponema sp.)(例如斑点病密螺旋体(Treponema carateum)、细弱密螺旋体(Treponema petenue)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)和地方性螺旋体(Treponema endemicum)、Tropheryma whippelii、尿素分解尿素原体(Ureaplasma urealyticum)、韦荣球菌属(Veillonella sp.)、海洋弧菌属(Vibriosp.)(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、霍氏弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fiuvialis)、麦奇尼科夫(氏)弧菌(Vibriometchnilrovii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)和弗尼斯(氏)弧菌(Vibrio furnisii))、耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)(例如小肠结肠炎耶尔森(氏)菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森(氏)菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森(氏)菌(Yersiniapseudotuberculosis))和嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)等。

适用于本公开的方法和组合物的细菌抗原包括可从细菌中分离、纯化或衍生的蛋白质、多糖、脂多糖和外膜囊泡。另外，细菌抗原包括细菌裂解物和灭活的细菌制剂。细菌抗原可以通过重组表达生产。细菌抗原优选地包括在其生命周期的至少一个阶段期间暴露于该细菌表面的表位。细菌抗原包括但不限于衍生自上述的一种或多种细菌的抗原以及下文鉴定的特定抗原实例。

淋病奈瑟氏球菌(Neiserria gonorrhoeae)抗原包括Por(或porn)蛋白例如PorB(参见如Zhu et al.(2004)Vaccine 22:660-669)、转移结合蛋白例如TbpA和TbpB(参见如Price et al.(2004)Infect.Immun.71(1):277-283)、不透明蛋白质(例如Opa)、还原可改性蛋白质(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制剂(参见如Plante et al.(2000)J.Infect.Dis.182:848-855)；WO 99/24578；WO 99/36544；WO99/57280；和WO 02/079243，所有这些都通过引用并入。

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原包括源自血清型A、B、Ba和C(沙眼剂，失明的原因)、血清型Li、L3(与淋巴肉芽肿性淋巴瘤相关)和血清型D-K的抗原。沙眼衣原体(Chlamydia trachomas)抗原还包括在WO 00/37494；WO 03/049762；WO 03/068811；和WO05/002619(所有的这些通过引用并入)中鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、Art(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH样(CT242)、L7/L12(CT316)，OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)，MurG(CT761)、CT396和CT761，以及这些抗原的特定组合。

梅毒螺旋体(Treponema pallidum)(梅毒，Syphilis)抗原包括TmpA抗原。

本公开的组合物可包含一种或多种源自性传播疾病(STD)的抗原。这些抗原可以针对STD(如衣原体、生殖器疱疹、肝炎(如HCV)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或软下疳(chancroid))提供预防或治疗(参见WO 00/15255，其通过引用并入本文)。抗原可以源自一种或多种病毒或细菌性STD。用于本发明的病毒性STD抗原可源自，例如HIV、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV)和肝炎(HCV)。用于本发明的细菌STD抗原可以源自，例如，淋病奈瑟氏球菌(Neiserria gonorrhoeae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、杜克雷(氏)嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、大肠杆菌(E.coli)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。

在一些实施方案中，公开的功能化表面或电极包含一种或多种源自上列一种或多种生物体的抗原。在一些实施方案中，特异性结合源自上列一种或多种生物体的抗原的抗体是公开的功能化电极的一部分，并且因此在一些实例中该抗体可用于检测样品中的这种抗原，如用于诊断特定的细菌感染。

结合亲和力：针对其靶点的特异性结合剂的亲和力，例如针对抗原的抗体，例如靶分析物的抗体，如靶分析物。在一个实施方案中，亲和力通过Frankel等人在Mo/.Immunol.,16:101-106,1979中所描述的斯卡查德(Scatchard)方法的修正来计算的。在另一个实施方案中，结合亲和力通过特异性结合剂-受体解离速率来测定。在另一个实施方案中，高结合亲和力通过竞争放射免疫测定法测定。在几个实例中，高结合亲和力(K_D)为至少约1×10^- ⁸M。在其他实施方案中，高结合亲和力为至少约1.5×10^-8、至少约2.0×10^-8、至少约2.5×10^-8、至少约3.0×10^-8、至少约3.5×10^-8、至少约4.0×10^-8、至少约4.5×10^-8或至少约5.0×10^-8M。

生物分子：任何源自生物系统的分子，包括但不限于合成的或天然存在的蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、氨基酸、核苷、核苷酸、核酸、寡核苷酸、DNA、PNA、RNA、碳水化合物、糖、脂质、脂肪酸、半抗原、抗生素、维生素、肠毒素等。在一些实例中，生物分子是可以确定其存在和/或浓度或量的靶分析物。在一些实施方案中，生物分子共价键合到硫醇或二硫醇化合物，和/或交联剂，例如作为公开的功能化金属表面(特别是电极)的一部分的硫醇或二硫醇化合物。

趋化因子：根据共同的结构特征分类的蛋白质，共同特征例如小尺寸(分子量大约8-10千道尔顿(kDa))和在保守位置存在的四个半胱氨酸残基，该保守位置是形成它们的三维形状的关键。这些蛋白质通过与G蛋白连接的跨膜受体(称为趋化因子受体)相互作用而发挥其生物学效应，所述趋化因子受体选择性地存在于它们靶细胞的表面。趋化因子与趋化因子受体结合，因此是趋化因子受体配体。

趋化因子的实例包括CCL趋化因子，例如CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28；CXCL趋化因子，例如CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17；XCL趋化因子，例如XCL1和XCL2；以及CX3CL趋化因子例如CX3CL1。在一些实施方案中，趋化因子或其部分是公开的功能化电极的一部分。在一些实施方案中，特异性结合趋化因子或其部分的抗体是功能化电极的一部分，因此在一些实例中，所述抗体可用于检测样品中的此类趋化因子。

缀合、连接(joining)、键合或连接(linking)：将第一单元化学连接到第二单元。这包括但不限于将一个分子共价键合到另一个分子，将一个分子非共价键合到另一个分子上(例如，静电结合)，通过氢键将一个分子非共价键合到另一个分子，通过范德华力将一个分子非共价键合到另一个分子，以及这些连接方式的任一种和所有组合。在一些实施方案中，靶分析物的配体与硫醇或二硫醇化合物、和/或交联剂共价键合。

接触：直接物理结合的布置，包括固体或液体形式。

对照：参考标准。在一些实例中，对照可以是表示分析物的已知浓度或量的已知值，例如靶分析物如目的生物分子。在一些例子中，可以使用对照或已知浓度或量的一组对照来校准功能化电极。

测试样品与对照之间的差异可以是增加或相反地减少。此差异可以是定性差异或定量差异，例如有统计学意义的差异。在一些实例中，差异相对于对照增加或减少至少约10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％，或者大于500％。

复合物(复合的)：据说当两种蛋白质，或其片段或衍生物，一种蛋白质(或片段或衍生物)和一种非蛋白质化合物，分子或任何两种或更多种化合物在它们以特定的方式可测量地相互结合时形成复合物。在一些实例中，复合物是功能化电极与靶分析物之间形成的复合物。

共价键：两个原子之间的原子间键，其特征在于由所述原子共享一对或多对电子。术语“共价结合”或“共价连接”是指将两个单独的分子形成一个连续分子，例如特异性针对靶分析物的配体和硫醇或二硫醇化合物可以共价连接(例如直接地或通过连接基间接地共价连接)。

交联剂：具有至少两个不同基团的同源-或异源-多功能试剂，所述基团在光反应中对存在于生物分子中的至少一个官能团(例如巯基)，以及与金属表面形成共价结合的另一个官能团具有反应性。两个官能团通常都是由间隔基彼此隔开的。在一些实例中，蛋白质交联剂是巯基反应性的，意味着其能够与巯基形成共价键，所述巯基例如存在于生物分子中的巯基，例如半胱氨酸残基上存在的巯基，或者例如通过使胺基与带有受保护的巯基的试剂反应然后脱保护而引入的巯基。

细胞因子：多种可溶性蛋白和多肽的通用名称，所述多种可溶性蛋白和多肽在纳摩尔浓度至皮摩尔浓度下起到体液调节剂作用并且在正常或病理条件下调节个体细胞和组织的功能活性。这些蛋白还直接介导细胞间的相互作用，并调节细胞外环境中发生的过程。细胞因子既包含天然存在的多肽也包括保留完整或部分生物活性的变体。细胞因子与细胞因子受体结合，因此细胞因子是细胞因子受体配体。

细胞因子的实例包括白介素，例如IL-1a、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10和IL-12；干扰素，例如IFN-a、IFN-β和IFN-y；肿瘤坏死因子，例如TNF-a和TNF-β巨噬细胞；炎症性蛋白，例如MIP-1a和MIP-1 3；和转化生长因子，例如TGF-β。在一些实施方案中，细胞因子或其部分是公开的功能化电极的一部分。在一些实施方案中，特异性结合细胞因子或其部分的抗体是公开的功能化电极的一部分，因此可以使用公开的功能化电极确定样品中细胞因子的存在。

循环伏安法：电化学技术，其可用于获得关于分析物溶液或酶底物对的氧化还原电位的信息，例如以筛选酶底物对用于包含在公开的生物传感器中。以固定速率在两个值之间扫描电压，然而，当电压达到V2时，扫描反转并且电压扫回到V1。在参考电极和工作电极间测定电压，而在工作电极和对电极间测定电流。将获得的测定值绘制成电流对电压，也称为伏安图。随着电压向分析物的电化学还原电位增加，电流也将增加。随着电压向V2增加超过该还原电位，则形成峰值，电流减小，这是因为已经超过氧化电位。当电压反转以完成向V1的扫描时，反应将开始再氧化来自初始反应中的产物。与正向扫描相比，这产生相反极性的电流的增加，但是随着电压扫描继续向V1而形成第二峰值时，其再次减小。反向扫描还提供在给定扫描速率下关于反应可逆性的信息。给定化合物的伏安图的形状不仅取决于扫描速率和电极表面(其在每个吸附步骤后是不同的)，也可取决于催化剂浓度。

检测：确定是否存在或不存在试剂(例如信号或靶分析物)。在一些实例中，这可进一步包括定量。在一些实例中，电磁信号用于检测试剂(例如分析物)的存在、量或浓度。在一些实例中，检测是间接的，例如使用在存在分析物时催化可检测信号产生的酶。在其他的实例中，当存在分析物时，信号减少，使得分析物的浓度增加导致信号减少。

二硫醇基：交联剂的末端基团，其呈现出两个硫醇基或巯基，通常由C_1-5亚烷基二基(alkylenediyl)分隔开。最优选的是那些可以通过脂酮酸衍生物还原获得的二硫醇。

表位：抗原决定簇。这些是具有抗原性的分子上特定的化学基团或连续或非连续的多肽序列，即引发特异性免疫应答。根据抗体和相配的(或同源的)表位的三维结构，抗体结合到特定的抗原性表位。

电磁辐射：通过电场和磁场强度的同时周期性变化传播的一系列电磁波，并且其包括无线电波、红外线、可见光、紫外线(UV)、X射线和伽马射线。在特定的实例中，电磁是电子的形式，该电磁可以根据在电极(如本文公开的功能化金属表面)中电流的变化而检测到。

真菌病原体：导致疾病的真菌。根据本公开的方法和组合物中使用的真菌病原体的实例包括但不限于以下的任何一种或多种(或其任何组合)：红色发癣菌(Trichophytonrubrum)、须疮癣菌(T.mentagrophytes)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、圆形糠秕孢子菌(Pityrosporum orbiculare)(糠秕马拉色(氏)霉菌，Malassezia furfur)、念珠菌属(Candida sp.)(例如白色念珠菌(Candidaalbicans))、曲霉属(Aspergillus sp.)(例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)和棒曲霉(Aspergillus clavatus))、隐球菌属(Cryptococcussp.)(例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、特隐球酵母(Ciyptococcus gattii)、罗伦特隐球菌(Ciyptococcus laurentii)和白色隐球菌(Ciyptococcus albidus))、组织胞浆菌属(Histoplasma sp.)(例如夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum))、肺孢子虫属(Pneumocystis sp.)(例如耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii))和葡萄穗霉属(Stachybotrys)(例如纸葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum))。在一些实施方案中，公开的功能化基底或电极包含一种或多种源自上列的一种或多种生物体的抗原。在一些实施方案中，特异性结合源自上列的一种或多种生物体的抗原的抗体是公开的功能化电极的一部分，因此在一些实例中可用于检测样品中的此类抗原，如用于诊断特定的真菌感染或在环境样品中真菌的存在。

生长因子：能够刺激细胞增生和细胞分化的蛋白。生长因子的实例包括转化生长因子β(TGF-β)、粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白、血小板衍生生长因子(PDGF)、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)，肌肉生长抑制素(GDF-8)、生长分化因子-9(GDF-9)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)等。在一些实施方案中，生长因子或其部分是公开的功能化电极的一部分。在一些实施方案中，特异性结合生长因子或其部分的抗体是公开的功能化电极的一部分，并且因此在一些实例中所述抗体可用于检测样品中此类生长因子。

异源的：关于一种分子，例如连接基，“异源的”是指通常彼此不相关的分子，例如作为单个分子。因此，“异源的”连接基是连接于另一个分子的连接基，通常未发现此连接基与该另一个分子实质上有关(例如在野生型分子中)。

高通量技术：通过此过程，其可以快速鉴定存在于一个样品或多个样品中的分析物。在某些实例中，结合现代机器人、数据处理和控制软件、液体处理装置和敏感检测器，高通量技术允许在短时间内快速检测和/或量化分析物，如使用本文所公开的试验和组合物。

激素：将信号从一个细胞(或一组细胞)传播到另一个细胞(或另一组细胞)的小分子的分类。激素的实例包括胺-色氨酸，例如褪黑激素(n-乙酰基-5-甲氧基色胺)和血清素；胺-酪氨酸，如甲状腺素(甲状腺激素)、三碘甲腺原氨酸(甲状腺激素)、肾上腺素(epinephrine)(肾上腺素(adrenaline))、去甲肾上腺素(norepinephrine)(去甲肾上腺素(noradrenaline))和多巴胺；肽类激素，如抗苗勒管激素(苗勒管抑制因子)、脂联素、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone)(促肾上腺皮质激素(orticotropin))、血管紧张素原和血管紧张素、抗利尿激素(血管加压素，精氨酸加压素)、心房钠尿肽、心房肽激素)、降钙素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素释放激素、促红细胞生成素、卵泡刺激素、胃泌素、生长素释放肽、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子(生长调节素)、瘦素、促黄体激素、黑素细胞刺激素、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、松弛素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、促甲状腺激素和促甲状腺激素释放激素；类固醇，例如皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黄体酮和骨化三醇(维生素d3)；和类二十烷酸，例如前列腺素、白三烯、前列环素和血栓烷等。在一些实施方案中，激素或其部分是公开的功能化电极的一部分。在一些实施方案中，特异性结合激素或其部分的抗体是公开的功能化电极的一部分。因此，在一些实例中，公开的功能化电极可用于检测此类激素及其前体和类似物。

分离的：“分离的”生物组分(例如生物分子)已基本上从混合物中的其他组分中分离或纯化出来。

配体：可以特异性结合目的分析物(如靶分析物)的任何分子，例如抗体、蛋白、肽或小分子(如分子量小于10千道尔顿(kDa)的分子，其可以特异性结合分析物，例如靶分析物)。

连接基或交联剂：作为可操作地连接两个不同分子的分子桥的化合物或部分，其中所述连接基的一部分与第一分子可操作地连接，并且其中所述连接基的另一部分与第二分子可操作地连接。所述两种不同的分子可以以逐步的方式与连接基连接。只要连接基可以实现其作为分子桥的目的，其在特定大小或含量上没有限制。本领域技术人员已知的连接基包括但不限于化学链、化合物、糖链、肽、半抗原等。连接基可包括但不限于同源双功能连接基和异源双功能连接基。本领域技术人员熟知的异源双功能连接基包含具有特异性地连接第一分子的第一反应性官能团的一端，以及具有特异性地连接第二分子的第二反应性官能团的相对端。根据诸如待连接的分子和执行的检测方法的条件之类的因素，连接基可以在长度和组成上变化，以优化诸如柔韧性、稳定性和对某些化学和/或温度参数具有抵抗性之类的性质。

核酸：由通过磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物或其组合)组成的聚合物，其相关的天然存在的结构变体和合成的非天然存在的类似物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中的核苷酸和它们之间的连接物包括非天然存在的合成类似物，例如但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。这样的多核苷酸可以合成，如使用全自动DNA合成仪合成。术语“寡核苷酸”通常指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。将会理解，当核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。

在本文中使用常规符号描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左手端是5'-端；双链核苷酸序列的左手方向称为5'-方向。5'至3'添加核苷酸至初期RNA转录物的方向称为转录方向。具有与mRNA相同序列的DNA链称之为“编码链”；DNA链上的具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列并且其位于RNA转录本的5'至5'末端的序列称为“上游序列”；DNA链上的具有与RNA相同序列并且为编码RNA转录物的3'至3'末端的序列称为“下游序列”。

“重组核酸”是指具有非天然地结合在一起的核苷酸序列的核酸。这包括含有扩增的或组装的核酸的核酸载体，所述载体可用于转化合适的宿主细胞。包含重组核酸的宿主细胞被称之为“重组宿主细胞”。然后在重组宿主细胞中表达该基因以产生，例如“重组多肽”。重组核酸可以同样地具有非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体-结合位点等)。

对于核酸序列间的序列比较，通常地，一个序列充当对照序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和对照序列输入电脑中，如果需要，指定子序列坐标，并设定序列算法程序参数。使用默认程序参数。用于比较的序列比对方法在本领域熟知。用于比较的序列最优的比对可以通过以下进行：例如，Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源算法，Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源比对算法，Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的相似性方法的检索，这些算法的计算机化运作(在Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者手动比对和目测(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds1995supplement))。

核苷酸：核酸分子的基本单元。核苷酸包括与戊糖单糖结合的含氮碱基，所述碱基带有一个、两个或三个通过酯键结合到糖部分的磷酸基团。

DNA的主要核苷酸是脱氧腺苷5'-三磷酸(dATP或A)、脱氧鸟苷5'-三磷酸(dGTP或G)、脱氧胞苷5'-三磷酸(dCTP或C)和脱氧胸苷5'-三磷酸(dTTP或T)。RNA的主要核苷酸是腺苷-5'-三磷酸(ATP或A)、鸟苷5'-三磷酸(GTP或G)、胞苷5'-三磷酸(CTP或C)和尿苷5'-三磷酸(UTP或U)。

核苷酸包括那些包含改性的碱基、改性的糖部分和改性的磷酸骨架的核苷酸，如美国专利US5,866,336所描述。

可用于在其结构的任何位置改性核苷酸的改性碱基部分的实例包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖苷、肌苷、N-6-烯丙基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶、甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖苷，5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基-硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸、假尿嘧啶，奎硫因(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤2'-脱氧鸟苷等。

可用于在其结构的任何位置改性核苷酸的改性糖部分的实例包括但不限于：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木糖和己糖或磷酸骨架的改性组分，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺、氨基磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸酯或烷基磷酸三酯或其类似物。

神经肽：通过在哺乳动物大脑中的神经元释放的肽，其特异性结合神经肽受体。神经肽的实例包括α-黑素细胞刺激素(a-MSH)、甘丙肽样肽、可卡因和苯丙胺调节的转录物(CART)、神经肽Y、刺豚鼠相关肽(AGRP)、(3-内啡肽、强啡肽、脑啡肽、甘丙肽、生长素释放肽)、生长激素释放激素、神经降压素、神经介素U、生长抑素、甘丙肽、脑啡肽胆囊收缩素、血管活性肠多肽(VIP)和P物质等。在一些实施方案中，神经肽或其部分是公开的功能化电极的一部分。在一些实施方案中，特异性结合神经肽或其部分的抗体是功能化电极的一部分，并且因此在一些实例中，该抗体可用于检测样品中这样的肽。

寡核苷酸：长度达到约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。

寄生虫：生存在作为宿主(针对所述寄生虫)的人类或其他生物体体内的生物体。寄生虫至少在其生命周期的一部分中依赖于其宿主。因为其消耗所需食物，侵蚀身体组织和细胞，以及排除有毒废物，其使人生病，所以寄生虫有害于人类。根据本公开的方法和组合物使用的寄生虫实例包括但不限于下列中的任何一种或多种(或任何组合)：疟原虫(Malaria)(镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P vivax)、三日疟原虫(Pmalariae))、血吸虫(Schistosomes)、锥虫(Trypanosomes)、利什曼原虫(Leishmania)、丝虫(Filarial nematodes)、毛滴虫(Trichomoniasis)、肉孢子虫(Sarcosporidiasis)、绦虫(Taenia)(猪带绦虫(T.saginata)、人猪肉绦虫(T.solium))、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)、旋毛虫(Trichinelosis)(旋毛形线虫(Trichinella spiralis))或球虫(Coccidiosis)(Eimedia species)。因此，在一些实施方案中，公开的功能化电极包括一种或多种源自上列的一种或多种生物体的抗原。在一些实施方案中，特异性结合源自上列的一种或多种生物体的抗原的抗体是公开的功能化电极的一部分。因此在一些实例中，公开的功能化电极可用于检测样品中这样的寄生虫，例如用于诊断特定的寄生虫感染或环境样品中寄生虫的存在。

光引发剂：有机分子或基团，其在用UV光线照射下，裂解成单独的自由基。优选的是那些源自α-羟基-、α-烷氧基-或α-氨基-芳基酮的分子或基团，优选地，它们呈现出1-苯甲酰-1-甲基-乙醇部分；最优选的光引发剂是2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和2,2-二甲氧基-2-苯基苯基酮。在“光引发剂存在下”的意思是在光反应前以溶液的形式加入光引发剂或者光引发剂已经预先连接至金属表面，如美国专利US 8,580,571所公开的。

多肽：其中单体是氨基酸残基的聚合物，其通过酰胺键结合在一起。当该氨基酸是a-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或者D-光学异构体中的一种。本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”意指包含任何氨基酸序列并包括改性的序列例如糖蛋白。“多肽”涵盖天然存在的蛋白，以及通过重组或合成产生的那些。“残基”或“氨基酸残基”包括合并入蛋白、多肽或肽的氨基酸。

纯化：术语“纯化”不要求绝对的纯度；相反地，其意指相对术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白、缀合物或者其他化合物为全部或部分地从混合物中的蛋白质或其他成分中分离出的那种。一般地，本公开中使用的基本纯化的肽、蛋白质、缀合物或其他活性化合物占所有大分子物质的大于80％，所述大分子物质存在于由肽、蛋白质、缀合物或其他活性化合物与药物载体、赋形剂、缓冲剂、吸收增强剂、稳定剂、防腐剂、佐剂或其他辅助成分混合或配制之前的制剂中。更典型地，纯化肽、蛋白质、缀合物或其他活性化合物至所有大分子物质的大于90％、通常大于95％，所有大分子物质存在于在与其他制剂成分混合之前的纯化制剂中。在其他情况下，纯化的制剂可以是基本均匀的，其中通过常规技术检测不到其它大分子物质。

定量：确定或测定分子的量(例如相对量)或分子的活性，例如分析物的量，例如样品中存在的靶分析物。

样品：用于分析的材料。在一个实施方案中，样品是生物样品。在另一个实施方案中，样品是环境样品，例如土壤、沉积水或空气。环境样品可以从工业来源中获得，例如农场、蚀屑流或水源。生物样品为包括生物材料(例如核酸和蛋白质)的那种。在一些实例中，生物样品从生物体或其一部分，例如动物中获得。在具体的实施方案中，生物样品从动物受试者，例如人受试者中获得。生物样品可以是获自任何活的生物体排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于多细胞生物(例如动物，包括健康或表面健康人受试者或受到诊断或调查的病症或疾病例如癌症影响的人类患者)。例如，生物样品可以是生物体液，其获自例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、腹水、唾液、脑脊髓液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出物、渗出液(例如从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的流体)，或者获自关节的流体(例如，正常关节或受疾病影响的关节，所述疾病例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或化脓性关节炎)。生物样品也可以是获自任何器官或组织(包括活组织检查或尸检标本，例如肿瘤活组织检查)的样品，或可包括细胞(无论是原代细胞或培养细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。在一些实例中，生物样品是细胞裂解物，如获自受试者的肿瘤细胞裂解物。

间隔基：交联剂内的基团，其分离两个末端反应性基团，在照射时其中一个末端反应性基团与金属表面结合以及另一个末端反应性基团与生物分子的巯基结合。间隔基优选为C_5-30亚烷基-二-1,ω-基，其中一个或多个不相邻的CH₂基团可各自独立地被选自O、S、NH、NR、NR-CO、CO-NR、O-CO和CO-O的基团取代。其中R代表氢或C_1-6烷基。聚乙二醇(PEG)基团是此间隔基的优选组分。

特异性结合剂：基本仅与定义的靶结合的试剂。因此，抗原结合剂，例如特异性针对抗原的抗体是基本结合到特定抗原或其片段的试剂。在一些实例中，特异性结合剂是特异性结合特定抗原或其抗原性片段例如靶分析物的单克隆或多克隆抗体。在其他的实例中，特异性结合试剂是特异性结合到特异性针对抗原的抗体的抗原。在一些实例中，特异性结合剂与酶缀合，例如催化酶底物反应成电活性产物的酶。

受试者：包括人类和兽医受试者两者，例如人类、非人类灵长类动物、狗、猫、马、猪和奶牛，以及食品生产领域的其他受试者，例如鸡肉或鱼类如鲑鱼、金枪鱼或鳟鱼。食品生产领域中的其他重要受试者是植物材料。

底物：通过酶作用的分子。底物与酶的活性位点结合，形成酶-底物复合物。在一些实例中，酶底物通过酶转换成电活性产物。

硫醇：含有硫-氢键或巯基(S-H)的有机硫化合物。硫醇是醇的硫类似物。S-H官能团可以称为硫醇基或巯基。硫醇具有化学通式R-S-H。在一些实例中，所述S-H基团可以与表面反应并因此与表面结合，所述表面例如导电表面。

肿瘤抗原：肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的抗原，所述抗原可以刺激肿瘤特异性T细胞免疫应答。示例性肿瘤抗原包括但不限于RAGE-1、酪氨酸激酶、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、Melan-A/MART-1、糖蛋白(gp)75、gp100、β-连环蛋白、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、MUM-1、肾母细胞瘤(WT)-1、癌胚抗原(CEA)和PR-1。其他的肿瘤抗原在本领域是已知的(如参见Novellino et al.,Cancer Immunol.Immunother.54(3):187-207,2005)并且在以下描述。肿瘤抗原也称为“癌症抗原”。所述肿瘤抗原可以是任何肿瘤相关性抗原，其在本领域中所熟知，并且包括，例如，癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠道羧基酯酶、mut hsp70-2、巨噬细胞集落刺激因子、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。

在一些实施方案中，肿瘤抗原或其部分是公开的功能化电极的部分。在一些实施方案中，特异性结合肿瘤抗原或其部分的抗体是功能化电极的一部分。因此，在一些实例中，公开的功能化电极可以用于检测样品中的这些抗原，例如用于诊断癌症。

病毒：在活细胞中复制的微观传染性的生物体。病毒基本由被蛋白质衣壳包被的核苷酸核心组成，并且具有仅在活细胞中复制的能力。“病毒复制”通过至少一个病毒生命周期的事件来产生额外的病毒。病毒可以破坏宿主细胞的正常功能，导致细胞以病毒决定的方式行动。例如，当未感染细胞通常不这样做时，病毒感染可能导致细胞产生细胞因子或对细胞因子应答。在一些实例中，病毒是病原体。另一种形式的病毒是朊病毒。

根据所公开的方法和组合物使用的病毒性病原体的具体实例包括但不限于下列的任何一种或多种(或任何组合)：沙粒病毒(Arenaviruses)(例如瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、胡宁病毒(Junin virus)、马秋波病毒(Machupo)和萨比亚病毒(Sabia))，动脉炎病毒(Arteriviruses)、Roniviruses、星状病毒(Astroviruses)、崩芽病毒(Bunyaviruses)(例如克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)和汉坦病毒属(Hantavirus))、杆状RNA病毒属(Barnaviruses)、Birnaviruses，博尔纳病毒属(Bornaviruses)(例如波尔纳病病毒(Bornadisease virus))、雀麦花叶病毒(Bromoviruses)、卡利色病毒(Caliciviruses)、产黄青霉病毒属(Chrysoviruses)、冠状病毒(Coronaviruses)(例如冠状病毒(Coronavirus)和SARS)、囊状噬菌体属(Cystoviruses)、长线形病毒属(Closteroviruses)、豇豆花叶病毒(Comoviruses)、双顺反子病毒(Dicistroviruses)、黄病毒(Flaviruses)(例如黄热病病毒(Yellow fever virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus)和登革热病毒(Dengue fever virus))、线状病毒(Filoviruses)(例如埃博拉病毒(Ebola virus)和马尔堡病毒(Marburg virus))、Flexiviruses、戊型肝炎病毒属(Hepeviruses)(例如戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus))、人腺病毒(humanadenoviruses)(例如人腺病毒AF(human adenovirus A-F))、人星状病毒(humanastroviruses)、人BK多瘤病毒(human BK polyomaviruses)、人博卡病毒(humanbocaviruses)、人类冠状病毒(human coronavirus)(例如人冠状病毒HKU1、NL63和0C43)、人肠道病毒(human enteroviruses)(如人肠道病毒AD(human enterovirus AD))、人红细胞病毒V9(human erythrovirus V9)、人泡沫病毒(human foamy viruses)、人疱疹病毒(human herpesviruses)(如人疱疹病毒1(单纯疱疹病毒1型)、人疱疹病毒2(单纯疱疹病毒2型)、人疱疹病毒3(水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus))、1型人疱疹病毒4(human herpesvirus 4type 1)(爱泼斯坦-巴尔病毒1型(Epstein-Barr virus type 1))、2型人疱疹病毒4(human herpesvirus 4type 2)(爱泼斯坦-巴尔病毒2型(Epstein-Barrvirus type 2))、AD169株人疱疹病毒5(human herpesvirus 5strain AD169)、Merlin株人疱疹病毒5(human herpesvirus 5strain Merlin Strain)、人疱疹病毒6A、人疱疹病毒6B、人疱疹病毒7、M型人疱疹病毒8、P型人疱疹病毒8和人巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus))、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency viruses，HIV)(如HIV 1和HIV 2)、人偏肺病毒(human metapneumoviruses)、人乳头瘤病毒(humanpapillomaviruses)、人副流感病毒(human parainfluenza viruses)(如人副流感病毒1-3)、人副肠孤病毒(human parechoviruses)、人细小病毒(human parvoviruses)(如人细小病毒4和人细小病毒B19)、人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial viruses)、人鼻病毒(human rhinoviruses)(如人鼻病毒A和人鼻病毒B)、人泡沫病毒(humanspumaretroviruses)、人T淋巴细胞病毒(human T-lymphotropic viruses)(如人类T淋巴细胞病毒1和人类T淋巴细胞病毒2)、人多瘤病毒(Human polyoma viruses)、Hypoviruses、轻小病毒(Leviviruses)、黄矮病毒组(Luteoviruses)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis viruses)(LCM)，Marnaviruses、裸露核糖核酸病毒属(Narnaviruses)、尼多病毒目(Nidovirales)、诺达病毒(Nodaviruses)、正黏病毒(Orthomyxoviruses)(如流感病毒(Influenza viruses))、分体基因病毒(Partitiviruses)、副黏病毒(Paramyxoviruses)(如麻疹病毒(Measles virus)和腮腺炎病毒(Mumps Viruses))、细小核糖核酸病毒(Picornaviruses)(如脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、普通感冒病毒(the common cold virus)和甲型肝炎病毒(Hepatitis Avirus))、马铃薯Y病毒组(Potyviruses)、痘病毒(Poxviruses)(如天花(Variola)和牛痘(Cowpox))、伴生病毒属(Sequiviruses)、呼肠孤病毒(Reoviruses)(如轮状病毒(Rotavirus))、弹状病毒(Rhabdoviruses)(如狂犬病病毒(Rabies virus))，弹状病毒(Rhabdoviruses)(如水泡性口膜炎病毒(Vesicular stomatitis virus)、四病毒(Tetraviruses)、披膜病毒(Togaviruses)(如风疹病毒(Rubella virus)和罗斯河病毒(Ross River virus))、番茄丛矮病毒组(Tombusviruses)、全病毒(Totiviruses)、芜菁黄花叶病毒组(Tymoviruses)和诺如病毒(Noroviruses)等。

病毒抗原可以来自丙型肝炎病毒(HCV)。HCV抗原可以选自以下的一种或多种：El、E2、El/E2、NS345多蛋白、NS 345-核心多蛋白、核心、和/或来自非结构区域的肽(Houghtonet al.(1991)Hepatology 14:381-388,其通过引用并入)。

病毒性抗原可以源自于人疱疹病毒(human herpes viruses)，例如单纯疱疹病毒(HSV)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或巨细胞病毒(CMV)。人疱疹病毒抗原可选自即刻早期蛋白、早期蛋白和晚期蛋白。HSV蛋白可以源自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原可以选自糖蛋白gB、gC、gD和gH，或免疫逃逸蛋白(gC、gE、或gl)。VZV抗原可选自核心、核衣壳、内膜或包膜蛋白。减毒活VZV疫苗可商购获得。EBV抗原可以选自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳蛋白(VCA)、和膜抗原(MA)的糖蛋白。CMV抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(例如gB和gH)和外皮蛋白。示例性疱疹抗原包括(括号中的GENBANK^TM登录号)源自以下病毒的那些抗原：人疱疹病毒1(单纯疱疹病毒1型)(NC 001806)、人疱疹病毒2(单纯疱疹病毒2型)(NC 001798)、人疱疹病毒3(水痘-带状疱疹病毒)(NC 001348)、1型人疱疹病毒4(爱泼斯坦-巴尔病毒1型)(NC 007605)、2型人疱疹病毒4(EB病毒2型(Epstein-Ban virustype2))(NC 009334)、AD169株人疱疹病毒5(NC 001347)、人疱疹病毒5株Merlin株(NC006273)、人疱疹病毒6A(NC 001664)、人疱疹病毒6B(NC 000898)、人疱疹病毒7(NC001716)、M型人疱疹病毒8(NC 003409)和P型人疱疹病毒8(NC 009333)。

人乳头瘤病毒(Human Papilloma virus，HPV)抗原是本领域已知的，并且可以在例如国际专利公开号WO96/19496(通过引用整体并入)中得到，该专利公开了HPV E6和E7蛋白的变体，特别是E6和E7蛋白均缺失的E6/E7的融合蛋白。基于HPV L1的抗原公开于国际专利公开号WO94/00152，WO94/20137，WO93/02184和WO94/05792中，所有这些都通过引用并入。这种抗原可包括作为单体、壳聚糖或病毒样颗粒的L1抗原。这些颗粒可额外地包含L2蛋白。其他HPV抗原是早期蛋白质，例如E7或融合蛋白质例如L2-E7。示例性HPV抗原包括(括号中的GENBANK^TM登录号)源自以下病毒的那些抗原：人乳头瘤病毒-1(NC 001356)、人乳头瘤病毒-18(NC 001357)、人乳头瘤病毒-2(NC 001352)、人乳头瘤病毒-54(NC 001676)、人乳头瘤病毒-61(NC 001694)、人乳头瘤病毒-cand90型(NC 004104)、人乳头瘤病毒RTRX7(NC004761)、10型人乳头瘤病毒(NC 001576)、101型人乳头瘤病毒(NC 008189)、103型人乳头瘤病毒(NC 008188)、107型人乳头瘤病毒(NC 009239)、16型人乳头瘤病毒(NC 001526)、24型人乳头瘤病毒(NC 001683)、26型人乳头瘤病毒(NC 001583)、32型人乳头瘤病毒(NC001586)、34型人乳头瘤病毒(NC 001587)、4型人乳头瘤病毒(NC 001457)、41型人乳头瘤病毒(NC 001354)、48型人乳头瘤病毒(NC 001690)、49型人乳头瘤病毒(NC 001591)、5型人乳头瘤病毒(NC)001531)、50型人乳头瘤病毒(NC 001691)、53型人乳头瘤病毒(NC 001593)、60型人乳头瘤病毒(NC 001693)、63型人乳头瘤病毒(NC 001458)、6b型人乳头瘤病毒(NC001355)、7型人乳头瘤病毒(NC 001595)、71型人乳头瘤病毒(NC 002644)、9型人乳头瘤病毒(NC 001596)、92型人乳头瘤病毒(NC 004500)和96型人乳头瘤病毒(NC 005134)。

病毒抗原可以源自逆转录病毒(，例如肿瘤病毒)、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可以源自HTLV-1、HTLV-2或HTLV-5。慢病毒抗原可以源自HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原可选自gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpr。针对HIV的抗原是本领域已知的，例如HIV抗原可选自gag(p24gag和p55gag)、env(gp160和gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、小蛋白质(p55gag和gp140v)。HIV抗原可以源自于下列病毒株的一种或多种：HIVmb、HIV、HIVLAV、HIVLAI、HIVM N、HIV-1CM235、HIV-1US4。HIV抗原的实例可以在国际专利公开号WO09/089,568、WO 09/080,719、WO 08/099,284、和WO 00/15255和美国专利号7,531,181和6,225,443中得到，所有这些通过引用并入。示例性HIV抗原包括(括号中的GENBANK^TM登录号)衍生于人免疫缺陷病毒1(NC 001802)、人免疫缺陷病毒2(NC 001722)的那些抗原。

在一些实施方案中，公开的功能化电极包括一种或多种源自上列的一种或多种病毒的抗原。在一些实施方案中，特异性结合源自上列的一种或多种病毒的抗原的抗体是功能化电极的一部分。因此，在一些实例中，公开的功能化电极可以用于检测样品中的这些病毒，例如用于诊断病毒感染或环境样品中病毒的存在。

通常电化学传感器的一般性能由将感应元件与纳米级的生物样品连接的表面结构决定。电化学生物传感器缺乏对所期望的生化事件响应有足够高的灵敏度和唯一识别的表面结构。

由于自组装单层的理想特性(例如对非特异性生物分子吸附的抗性和稳定性)，已经进行了各种先前尝试以从长链自组装单层(SAM)中制备生物传感器。然而，由于其对电子转移的低渗透性，基于长链烷基的电化学传感器具有有限的适用性(参见如Fragoso etal.,Anal.Chem.,80:2556-2563,2008)。为试图克服长链SAM中存在的感知限制，Fragoso等人转向了二硫醇，认为其绝缘性较差。然而，使用长链SAM的一个优点通过转向较低绝缘性的单层而丢失，即缺失了针对非特异性电子转移的选择性，其降低了传感器的信噪比，因此降低了灵敏度。

使用SAM的另一个缺点是它们是离子绝缘体，即离子不能容易地穿透SAM以便将电子传递到电化学传感器的下面的导电材料和从电子传感器的下面的导电材料传递电子(参见如Boubour and Lennox,Langmuir 16:42224228,2000)。虽然从限制非特异性电子转移的观点来看SAM的绝缘性质是可期望的，但在缺少用于目的分析物的选择性离子转移的情况下，SAM作为电化学传感器的组件的用途有限。

如本文所公开的，通过仔细筛选保留其对非特异性电子转移的绝缘性质的硫醇或二硫醇化合物以及具有电活性的并且能够促进电子通过单层转移到电子传导表面的酶反应产物的选择，已经克服了先前从含有SAM的长链硫醇制备传感器的尝试中存在的限制。因此，如本文所公开的，已经令人惊讶地发现可以形成功能化电极，其在SAM上保持有利的绝缘特性，例如产生高信噪比，连同高选择性和灵敏度。

本文还提供了试剂盒。用于检测目的分析物的试剂盒包括一个或多个公开的生物传感器。在一些实施方案中，试剂盒包括公开的检测目的分析物手段的指导材料。所述指导材料可以以电子形式(例如计算机磁盘或光盘)为书面的，或者可以是可视化的(例如视频文件)。试剂盒还可包括检测试剂和具有电活性反应产物的底物。试剂盒还可包括其他部件来促进为试剂盒设计的具体应用。因此，例如，试剂盒可额外地包含缓冲剂和常规用于具体方法实践的其他试剂。这些试剂盒和适当的内容物是本领域技术人员所熟知的。在一些实例中，所述试剂盒包括对照物，例如含有已知量或浓度的靶分析物的对照溶液，例如作为校准包括在试剂盒中的生物传感器的手段。试剂盒可以包含用于自动分析测试和用于快速、即时设置的自动数据收集的部件。

根据本发明的方法的优选实施方案是以下那些，其中：

(A)交联剂化合物为式(I)的化合物，

HS-(CH₂)_m-CH(ZH)-间隔基-(CH₂)_p-A (I)

其中

m是2至6的整数，特别是2至4，

A选自-CH＝CH₂和-C≡CH，特别是-CH＝CH₂，和

Z是S或单键，特别是S，

间隔基是下式的基团

-(CH₂)_n-(C＝O)_x-Y-(CH₂CH₂-O)_y-(CH₂)_r-(C＝O)_v-X-

其中

X和Y各自独立地为NH或O，

n为0或者1至10的整数，特别是2至6，最优选4，

x和v各自独立地为0或1，特别是1，

y是1至20的整数，特别是4至18，

r和p各自独立地选自1至6的整数，特别是1；

聚乙二醇基团(PEG)-(CH₂CH₂-O)_y-包含确定的数目y个环氧乙烷单元，特别是4-18个单元，最优选8-16个单元，或包含不确定数目的具有平均分子量为0.5至10kDa的环氧乙烷单元，平均分子量特别是2至8kDa，最优选约5kDa；

(B)生物分子是抗体、酶或核酸，特别是单克隆抗体；

(C)光引发剂是1-苯甲酰-1-甲基-乙醇衍生物，特别是1-苯甲酰-1-甲基-乙醇衍生物，其在水中可溶，最优选2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮；

(D)在波长λ_max300至340nm进行照射，特别是在约320nm进行照射。

此外，本发明涉及新的式(I)化合物，优选的式(I)化合物是下列式(IA)化合物：

HS-(CH₂)_m-CH(SH)-间隔基-CH₂-A (IA)

其中A和间隔基具有式(I)给予的含义，以及

m是2至4的整数，特别是2，

式(IA)的间隔基是优选的下式的基团：

-(CH₂)_n-(C＝O)-NH-(CH₂CH₂-O)_y-CH₂-(C＝O)-NH-

其中

n为0或者1至10的整数，特别是2至6，最优选4，

y是1至20的整数。

最优选的是式(IB)的化合物，其可从脂酮酸、特别是R-α-脂酮酸中通过-S-S-键的还原获得：

HS-(CH₂)₂-CH(SH)-(CH₂)₄-(C＝O)-NH-(CH₂CH₂-O)_y-CH₂-(C＝O)-NH-CH₂-A(IB)，

其中A和y具有式(I)给予的含义。

优选的式(IA)和(B)的化合物可以根据下列的反应方案I来合成：

反应方案I

在步骤1)和步骤2)中，在酯反应或者酰胺形成反应条件下用醇(Y或X＝O)或胺(Y或X＝NH)处理相应的酸。本领域技术人员熟知这些反应条件。例如通过用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或亚硫酰氯处理来活化所述酸和/或反应过程中形成的水通过脱水剂不可逆地捕获。

最优选酸用醇或胺在如下物质存在下进行处理：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠、1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT)或五氟苯酚和二环己基碳二亚胺(DCC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC))。

在步骤3)中，通过用还原剂处理来还原性断开其二硫键，还原剂特别是DTT(二硫苏糖醇)、巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和/或DTE(二硫赤藓糖醇)。

优选的式I化合物(其中X是S以及v是0)，可以根据下列反应方案II来制备：

反应方案II

保护基团PG是适用于保护氨基或羟基的基团。这类保护基团和脱保护的方法(步骤2)是本领域技术人员所熟知的，参见：T.W.Green,P.G.M.Wuts,Protective Groups inOrganic Synthesis,Wiley-Interscience,New York,1999。最优选的氨基的保护基团例如是：9-芴基-甲基氨基甲酸酯、(FMOC氨基)、氨基甲酸叔丁酯(BOC氨基)、氨基甲酸苄酯、乙酰胺、三氟乙酰胺、苄胺和三苯甲胺。最优选的羟基的保护基团例如是：甲氧基甲基醚、四氢吡喃基醚、叔丁基醚、苄基醚、三烃基甲硅烷基醚如叔丁基二甲基甲硅烷基醚或叔丁基二苯基甲硅烷基醚。

在步骤3)中的取代反应通常在如下物质存在下进行：碱如碱金属氢氧化物、优选氢氧化钠或氢氧化钾，或叔胺、优选三乙胺或2,2,6,6-四甲基哌啶。

步骤4可以类似于反应方案1的步骤3)所述进行。

因此，新的式(II)脂酮酸衍生物作为制备式(I)、(IA)和(IB)化合物的中间体，是本发明另一个主题。

最优选的是式(IIA)的化合物，

特别是式(IIA 1)的化合物，

其中间隔基、A和p具有式(I)给定的含义。

通过以下非限制性实施例阐明本申请。

实施例

缩写

AcOH 乙酸

approx. 大约

℃ 摄氏度

DCC 二环己基碳二亚胺

DCM 二氯甲烷

DTT 二硫苏糖醇

kDa 千道尔顿

MeCN 乙腈

MeOH 甲醇

mL 毫升

mM 毫摩尔

NHS N-羟基丁二酰亚胺

PEG-烯烃甲氧基聚(乙二醇)烯烃

PEG-炔烃甲氧基聚(乙二醇)炔烃

rpm 每分钟的转数

λ 波长

TCEP 三(2-羧乙基)膦

TEA 三乙胺

TFA 三氟乙酸

实施例1

SH-PEG-烯烃/SH-PEG-炔烃交联剂的合成

为了通过PEG-烯烃/PEG-炔烃将诊断性生物分子与微芯片偶联，合成了平均分子量为800Da和5000Da的交联剂PEG-烯烃和PEG-炔烃分子。此外，已经合成了未用烯烃或炔烃官能化的600Da的SH-mPEG。在金属表面涂覆期间，该分子可用于稀释PEG-烯烃/PEG-炔烃交联剂，从而获得芯片表面上官能团的均匀统计分布。

实验

RP-HPLC–在装备有ELSD检测器和光电二极管阵列检测器的水联盟系统上进行RP-HPLC分析。使用XBridge^TM BEH300 4.6x 250mm 5μm RP18柱子。在梯度HPLC中使用HPLC-H₂O(+0.1％TFA)和HPLC-MeCN(+0.1％TFA)作为洗脱液。

NMR–对于NMR光谱，将30-60mg分析物溶解在600μL CDCl₃中并转移至NMR小瓶中。使用Varian Mercury-400BB在(1H，400MHz；13C，100.6MHz)或Varian Mercury-300BB(1H，300MHz；13C，75.5MHz)下进行光谱分析。化学位移以ppm表示，并根据溶剂信号进行校准。

MALDI-TOF-MS–使用Axima置信系统(Shimadzu)上的α-氰基-4-羟基-肉桂酸(CHCA)基质以线性模式进行MALDI-TOF-MS分析。

搅拌–向所有反应混合物和结晶悬浮液中加入磁性搅拌棒用MR3001K(Heidolph)磁力搅拌器搅拌。

蒸发和干燥–使用具有真空泵单元PC510(Vacuubrand)和温度为40℃的水浴的Laborota 4000高效(Heidolph)旋转蒸发器在减压下除去溶剂至干燥。使用相同的程序以干燥材料。

色谱分析法–使用填充进玻璃柱的40-63μm硅胶以及不同典型有机溶剂混合物进行色谱分析。利用TLC手动收集级分和分析。合并含有纯产物的级分并在减压下去除溶剂。

TLC–在TCL硅胶60F254铝板上以不同典型有机溶剂混合物进行TLC分析。高锰酸钾水溶液用作为染色剂。

实施例1.1.

R-α-硫辛酸-PEG12-烯丙基(B)的合成

步骤1：向40mL DCM中的R-α-硫辛酸(668mg，3.24mmol)溶液中加入DCC(1.00g,4.86mmol)和NHS(599mg,4.86mmol)，并在室温搅拌所得的反应混合物1h。通过过滤去除析出的二环己脲并用10mL DCM洗涤两次。向所得的澄清黄色反应混合物中加入NH₂-PEG12-COOH(2.00g,3.24mmol)和TEA(900μL,6.48mmol)。在室温，搅拌该反应混合物2.5h。随后在减压下去除所述溶剂。利用色谱层析(35g硅胶(40–63μm DCM/MeOH–98:2->90:10,+0.1％AcOH)纯化所得的残余物后，获得1.99g收率为76％的产物(A)。根据RP-HPLC分析，该产物包含大约3.3％硫辛酸和总计达2.8％的未鉴定杂质。整体纯度为约94％。

步骤2：向20mL DCM中的步骤1中获得的产物(A)(1.20g，1.49mmol)的溶液中加入DCC(461mg,2.23mmol)和NHS(257mg,2.23mmol)并在室温搅拌所得的反应混合物1小时。通过过滤去除析出的二环己脲并用5mL DCM洗涤两次。向所得的澄清的黄色反应混合物加入烯丙胺(224μL，2.98mmol)和TEA(415μL，2.99mmol)。在室温搅拌该反应混合物17h并且随后用20mL水洗涤。在减压下浓缩有机相并且通过色谱层析(15g硅胶(40–63μm DCM/MeOH–98:2->95:5)纯化所得的固体。获得796mg收率为63％的产物CES0594。根据RP-HPLC分析(图2)，该产物具有>99％的纯度。通过MALDI-MS和NMR确定(B)的分子量和身份。

实施例1.2.

R-α-硫辛酸-PEG12-炔丙基(C)的合成

向40mL DCM中的实施例1.1的步骤1中所得的产物(A)(1.52g，1.89mmol)溶液中加入DCC(592mg，2.87mmol)和NHS(325mg，2.82mmol)，所得的反应混合物在室温搅拌1h。通过过滤去除析出的二环己脲并用5mL DCM洗涤两次。

向所得的澄清的黄色反应混合物加入炔丙胺(245μL，3.82mmol)和TEA(525μL，3.79mmol)。在室温搅拌该反应混合物1h并且随后用20mL水洗涤。在减压下浓缩有机相并且通过色谱层析(21g硅胶(40–63μm DCM/MeOH–98:2->95:5)纯化所得的固体。获得1.01g收率为64％的产物CES0596。根据RP-HPLC分析，该产物不包含可检测的杂质。通过MALDI-MS和NMR确定(C)的分子量和身份。

实施例1.3.

R-α-硫辛酸-mPEG8(D)的合成

向40mLDCM中的R-α-硫辛酸(538mg,2.61mmol)溶液加入DCC(8.11mg,3.93mmol)和NHS(450mg,3.91mmol)，并且在室温搅拌所得的反应混合物1h。通过过滤去除析出的二环己脲并用5mL DCM洗涤两次。向所得的澄清的黄色反应混合物加入NH2-mPEG8(0.98g,2.56mmol)和TEA(725μL,5.23mmol)。在室温搅拌该反应混合物1h，并且随后用30mL水洗涤。在减压下浓缩有机相并且通过色谱层析(34g硅胶(40–63μm)DCM/MeOH–98:2->97:3)纯化所得的固体。获得1.12g收率为75％的产物(D)。根据RP-HPLC分析，该产物具有大约99.8％的纯度。通过MALDI-MS和NMR确定CES0598的分子量和身份。

实施例1.4.

R-α-硫辛酸-5kDa PEG-烯丙基(F)的合成

步骤1：向5mLDCM中的R-α-硫辛酸(125mg,606μmol)溶液加入DCC(184mg,892μmol)和NHS(108mg,938μmol)，并在室温搅拌所得的反应混合物1h。通过过滤去除析出的二环己脲并用2mL DCM洗涤两次。向所得的澄清的黄色反应混合物加入在DCM(91mL)中的NH2-5kDaPEG-COOH(3.03g，606μmol)和TEA(166μL，1198μL)。在室温搅拌该反应混合物17h，并且随后用50mL 100mM柠檬酸洗涤。在减压下浓缩有机相并且通过色谱层析(36g硅胶(40–63μmDCM/MeOH–98:2->90:10+0.1％AcOH)纯化所得的固体物质。获得2.75g收率为88％的产物(E)。根据RP-HPLC分析，该产物具有大约80％的纯度和20％未知的杂质。在下一步骤的纯化期间去除这些杂质。

步骤2：向40mL DCM中的(E)(1.30g,251μmol)的溶液加入DCC(76mg,368μmol)和NHS(42mg,365μmol)，并在室温搅拌所得的反应混合物6h。向该黄色轻微浑浊溶液加入烯丙胺(50μL,666μmol)和TEA(100μL,721μmol)并在室温搅拌该混合物18h。通过过滤去除析出的二环己脲和游离的N-羟基琥珀酰亚胺，并用10mL DCM洗涤两次。用30mL水洗涤该反应混合物。在减压下浓缩有机相并通过色谱层析(31g硅胶(40–63μm DCM/MeOH–95:5->80:20)纯化所得的固体。获得1.18g收率为90％的产物(F)。根据RP-HPLC分析，该产物具有大约97.5％的纯度。通过MALDI-MS和NMR确定(F)的分子量和身份。

实施例1.5.

R-α-硫辛酸-5kDa PEG-炔丙基(G)的合成

向40mL DCM中的根据实施例1.4的步骤1获得的产物(E)(1.30g,251μmo)的溶液加入DCC(116mg,562μmol)和NHS(59mg,513mmol)并在室温搅拌所得的反应混合物3.5h。向该黄色轻微浑浊溶液加入炔丙胺(48μL,749μmol)和TEA(104μL,750μmol)并在室温搅拌该混合物20h。通过过滤去除析出的二环己脲和游离的N-羟基琥珀酰亚胺，并用10mL DCM洗涤两次。用30mL水洗涤该反应混合物。在减压下浓缩有机相并通过色谱层析(32g硅胶(40–63μmDCM/MeOH–95:5->80:20)纯化所得的固体物质。获得1.18g收率为90％的产物(G)。根据RP-HPLC分析，该产物具有大约95％的纯度。通过MALDI-MS和NMR确定(G)的分子量和身份。

实施例2

实施例2.1.光化学偶联条件的研究

模型系统用于建立R-α-硫辛酸-PEG12-烯丙基(B)和3-巯基丙酸的光化学反应(方案7)：

优化的条件用于研究部分还原的抗体的光化学改性。

由于光引发剂II(2，2-二甲氧基-2-苯丙酮)在水溶液中表现出不充分的溶解性(＜1mg/mL 10％DMSO(aq))，所以仅使用光引发剂I(2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮)进行所有的实验。相比之下，光引发剂I在不添加DMSO下溶于水中至浓度为1mg/mL。

在起始实验中，用10mol％光引发剂I处理1mg/ml的产物(B)在水中的储备溶液。将反应混合物分于5个管(200μl每管，A-E)。向这些管加入不同摩尔过量的3-巯基丙酸(SH)(参见表1，条目A至E)

管	SH的当量
		A	5
B	25
		C	50
D	100
		E	250

使用下列条件诱导反应：

●反应温度＝1℃

●曝光时间＝30min

●λ_max：310nm

辐照之后立即通过HPLC分析样品。总之，这些实验证明了硫醇试剂与合成的交联剂的炔基的光引发偶联的可行性。

进行了其他的实验确定所述反应的速率和对反应体积的依赖性。在300秒时间期间，获得了约60％的转化率并且线性回归很好地描述了反应过程。转化率不依赖应用的反应体积。20μL或200μL的反应体积导致在相同反应时间的相同转化率。相比之下，这种反应类型的典型动力学(Macromol.Rapid Commun.2010,31,1247-1266)显示出对数相关性。这项可行性研究的重点是这种光诱导点击反应的可重复性，而非完全转化。就此点而言，5秒后已经获得2％的可重复性转化率。

此外，基于这些结果设计了具有还原的抗体的第一实验。为了反应进展，仅使用5kDa PEG缀合物(烯烃(F)和炔烃(G)),由于质量差异可以通过SDS-PAGE检测各自反应产物。

实施例3

实施例3.1.抗体的部分还原

通过抗体的内部二硫键的部分还原可以将游离的硫醇基引入抗体。因此应当研究导致了抗体的部分还原而不影响其活性的还原条件。反应应在25–50μL体积中进行。DTT、TCEP和半胱胺应作为还原剂测试。之后应当用5kDa mPEG-马来酰亚胺改性部分还原的抗体，其中5kDamPEG-马来酰亚胺和游离的巯基反应以研究还原反应的成功。

3.2.实验

还原剂筛选–在0.5mg/mL(抗ACTH抗体)或0.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL(IgG1)的蛋白质浓度下使用如结果部分所指示的不同的还原剂过量进行还原剂筛选实验。在25μL的最终体积中，使用作为反应缓冲液的20mM磷酸钠(pH 7.2)在室温进行所述反应1h或2h。

抗体的PEG化–PEG化反应在室温在20mM磷酸钠(pH 7.2)中以400：1的PEG：蛋白质摩尔比进行3h。反应混合物中的蛋白质浓度范围为0.3mg/mL(抗ACTH抗体)到0.3mg/mL、3mg/mL、6mg/mL和9mg/mL(IgG1)。

SDS-PAGE–使用来自Invitrogen的NuPAGE系统的4-12％Bis-Tris凝胶在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE。使用SimplyBlue^TM SafeStain试剂盒(Invitrogen)染色凝胶。

尺寸排阻色谱–使用Superdex 20010/300在Agilent 1200上进行SEC。使用作为洗脱剂的PBS(10mM Na₂HPO₄,2mM KH₂PO₄,137mMNaCl,2.7mMKCl,pH 7.4)以0.65mL/min流速进行SEC。

3.3.结果

在起始实验中，使用不同浓度的还原剂研究抗ACTH抗体的部分还原。以这种方式，应确定还原剂的浓度，在该浓度下可以获得完整的未解离的IgG。

利用一般的鼠IgG1抗体(Biogenes)来更详细研究部分还原的适用条件。

特别是，对于DTT研究了IgG1抗体浓度对还原效率的影响。将5kDa mPEG-马来酰亚胺以高过量(400倍)添加至反应混合物中，以便作为SDS-PAGE中的条带移位形式定量地检测所有产生的游离硫醇基。

通常，随着还原剂的过量增加，检测到更高比例的还原的IgG1。此外，在较高的蛋白浓度，需要较低DTT过量来诱导IgG1的还原。使用6或10当量的DTT，根据SDS-PAGE分析获得了重链的0–5倍的用5kDa mPEG-马来酰亚胺的改性。用1.5或3当量的DTT还原主要导致了重链的单一PEG化，然而，在较小程度上也观察到较高程度的改性。仅在1％(1.5当量DTT)至约20％(10当量DTT)的比率下观察到轻链的单一改性。

此外，越多的还原形式的IgG1，PEG化程度越高。通过SEC进一步分析在添加还原剂和PEG后二硫化物还原对IgG1的组装状态的的影响。

在20.1min以单个常规峰的形式洗脱非还原的IgG1。用10倍过量的DTT处理对保留时间或抗体谱没有可检测的影响，表明在生理条件下的完整性。该发现与SDS-PAGE的发现形成对比，其中观察到在相同条件下IgG1解离成重链和轻链。

用5kDa mPEG-Mal对部分还原的IgG1(10倍过量的DTT)的改性导致峰变宽至14.5min到22min间的较低的保留时间。这对于用5kDa mPEG改性的完整抗体是预期的。未观察到会指示抗体解离的较高保留时间的信号。相较于10倍DTT过量，在较低DTT过量(1.5倍)，SEC期间获得的峰不太宽，表明PEG化程度较低。

使用抗ACTH抗体研究了全部三个还原剂在不同摩尔过量的还原时间的影响。孵化1h和2h后，通过添加高摩尔过量的5kDa mPEG-马来酰亚胺来终止还原。

在所有研究的条件下，通过SDS-PAGE观察到完整的抗ACTH抗体，表明链间二硫键还原不完全。然而，随着增加过量的DTT或TCEP，检测到较高比例的重链和轻链以及较高程度的PEG化。在2h的还原时间时效果略强。使用半胱胺，可获得在300–900倍过量的还原剂下无显著的抗ACT抗体的解离。基于这些结果，决定使用1h还原时间。此外，为了PEG化的抗ACTH抗体的制备，选择TCEP作为还原剂，因为其未用马来酰亚胺活化的分子改性。

实施例4

实施例4.1.通过光反应将PEG-烯烃/PEG-炔烃与部分还原的抗体偶联

已经开发了用于将抗体与PEG-连接基(F)和(G)的烯烃/炔烃官能团偶联的光反应条件。因此，应该研究不同的反应条件，如曝光时间、PEG过量、光引发剂I(“Photo I”)浓度、蛋白浓度和反应pH值。已经通过所得的偶联物的SDS-PAGE分析偶联效率。

4.2实验

抗体的(部分)还原–向具有15mg蛋白质浓度的抗体溶液中加入TCEP，最终浓度为0.01mM-1mM，相当于相对于抗体的摩尔过量为0.1倍-10倍。在20mM磷酸钠(pH 7.2)中在室温进行还原反应1h。随后，通过光点击化学用PEG-烯烃或PEG-炔烃来改性抗体。

通过光点击化学用PEG-烯烃/PEG-炔烃改性抗体

如以下部分所述，使用caproBox^TM(Caprotech)在不同条件下通过光诱导进行对抗体用PEG-烯烃批次CES0601或PEG-炔烃批次CES0602改性。

4.3结果

对于PEG-烯烃的起始光化学偶联实验，使用商购可得的抗体IgG1(小鼠)。用1mMTCEP(10当量)在15mg/mL的蛋白质浓度下将抗体还原1h。使用下列条件用还原的IgG1检测PEG过量对抗体改性的影响：

IgG1浓度：1mg/mL

反应缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.2

相对于IgG1的PEG-烯烃(F)摩尔过量：0.2倍至10倍

光引发剂I过量：0.1mol/mol PEG

曝光时间：30min

通过SDS-PAGE分析监测IgG1的PEG化

通过SDS-PAGE，针对还原的但非PEG化的IgG1检测到55kDa和25kDa处的两条带，其分别指定为重链和轻链。对于通过光诱导与PEG-烯烃缀合的所有样品，观察到几个高分子量条带。这些条带可能对应聚集的蛋白或错误装配的蛋白，因为它们不匹配对于PEG化抗体片段为大约10kDa的预期分子量差异。仅在PEG过量10当量时，观察到在约65kDa的条带，其被指定为单一PEG化的重链。对于含有PEG和光引发剂但不暴露于光的IgG1样品，未检测到除重链和轻链外的其他条带。这表明，通过曝光导致了聚集。

当获得了聚乙二醇化的重链时，假设通过光点击化学的抗体改性是可行的，但是必须优化反应从而减少聚集的抗体。

为了减少蛋白质聚集和增加PEG化，研究了不同的曝光时间和光引发剂I浓度。因此，利用下列条件用PEG-烯烃改性了经TCEP还原的IgG1：

·IgG1浓度：1mg/mL

·反应缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.2

·相对于IgG1的PEG-烯烃摩尔过量：10倍

·光引发剂I过量：1-10mol/mol PEG

·曝光时间：5s-10min

在所有曝光时间光引发剂I过量的增加导致较高比例的聚集物，然而并不影响单一PEG化重链的比例。通过减少曝光时间至5–30秒，可以显著减少聚集物的比例，然而，在此时间范围内，单一PEG化重链的比例也随着暴光时间而降低。

为了最小化通过链间二硫键形成的可能的错误组装，决定在起始抗体还原期间减少相对于IgG1的TECP过量至1或5当量。随后，利用1当量光引发剂1在不同曝光时间用1当量PEG-烯烃改性抗体。

通过TECP过量的减少，利用1当量TCEP在10min的曝光时间下减少聚集物的比例至约9％。然而，由于最终的芯片涂布工艺需要短的曝光时间，决定选用0.5min的标准时间，其导致在1倍TCEP过量13％单一PEG化重链和在5倍TCEP过量15％单一PEG化重链。此外，在1和5当量TECP时分别检测到大约1％和3％单一PEG化轻链。由于在1当量TECP时，检测到显著的较低比例的聚集物，决定选用1当量TECP作为标准的TECP过量。

使用下列条件进一步优化对于标准曝光时间的PEG过量：

·IgG1浓度：1mg/mL

·反应缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.2

·相对于IgG1的PEG-烯烃摩尔过量：0.5倍-10倍

·光引发剂I过量：1mol/mol PEG

·曝光时间：30s

随着PEG过量的增加，观察到较高比例的单一PEG化重链。

在10当量PEG时获得了最高比例(7％)的单一PEG化重链，因此选择10当量PEG作为标准PEG过量。

使用下列反应参数优化在反应混合物中的蛋白质浓度：

·IgG1浓度：0.2mg/mL-10mg/mL

·反应缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.2

·相对于IgG1的PEG-烯烃摩尔过量：10倍

·光引发剂I过量：1mol/mol PEG

·曝光时间：30s

在较高蛋白质浓度时单一PEG化重链比例增加。然而，高分子量杂质(聚集物和复合PEG化抗体(multiply PEGylated antibody))的比例同样增加。

在2mg/mL的蛋白质浓度检测到最高比例的单一PEG化重链(16％)。然而，为了获得高蛋白质浓度，必须在先前的步骤中浓缩抗体。为了所需要的芯片涂层，必须进一步优化抗体、抗体浓度和PEG：蛋白质的比例。因此对于溶液中的反应，选用1mg/mL的标准蛋白浓度，以便最小化抗体的预浓缩。

利用下列反应参数优化反应pH值：

·IgG1浓度：1mg/mL

·反应缓冲液和pH值：100mM乙酸钠，pH 5.0；20mM磷酸钠，pH 7.2；100mM硼酸钠，pH 9.0

·相对于IgG1的PEG-烯烃摩尔过量：10倍

·光引发剂I过量：1mol/mol PEG

·曝光时间：30s

在反应的pH为5时，检测到最高比例的单一PEG化轻链(2％)，然而，获得了较低比例(6％)的单一PEG化重链。在pH为7时仅观察到略为较高比例(7％)的单一PEG化轻链。在pH为9时，检测到最高比例(9％)的单一PEG化，但是也获得了最高比例的HMWI(22％)。因此决定使用标准反应pH值为7，在此值时检测到较少(18％)的HMWI。

选用下列标准反应参数：

·蛋白质浓度：1mg/mL

·反应缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.2

·相对于IgG1的PEG-烯烃/PEG-炔烃摩尔过量：10倍

·光引发剂I过量：1mol/mol PEG

·曝光时间：30s

将标准反应参数转移至PEG-炔烃以及抗ACTH抗体的改性。由于在先前的实验中在不同的还原剂下获得了IgG1和抗ACTH抗体的还原，因此研究了不同的TCEP浓度。

对于两种缀合物(使用PEG-烯烃或PEG-炔烃)，在最低TCEP过量(0.1当量)下获得最高比例的单一PEG化蛋白质(约7％)，因此选择其作为标准条件。

根据非还原性SDS-PAGE，抗ACTH抗体在半胱氨酸残基处的PEG化不会影响此抗体的四级结构。在缀合物的还原性SDS-PAGE中，检测到在66kDa和75kDa处的条带，其被分别指定为单一PEG化重链和双PEG化重链。通过SDS-PAGE未观察到PEG化轻链。

实施例5

利用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)引入硫醇基和随后用PEG-烯烃改性

根据SEC分析，部分还原和PEG与相应半胱氨酸残基的偶联不会影响到抗体的四级结构。然而，二硫键的还原可能减弱抗体的稳定性以及干扰其活性。因此，应当研究通过使用双官能试剂SATA来引入游离的硫醇基。通过此方法，最初将SATA经其NHS官能团连接至抗体中的赖氨酸残基的游离氨基上。随后，经过羟胺处理脱保护此缀合的SATA的巯基：

在之前研发的条件下通过光反应将所得的游离硫醇基与PEG-烯烃/PEG-炔烃缀合。

5.1.实验

SATA连接至抗体的游离氨基–为了将SATA连接至IgG1和抗ACTH抗体，使用了SATA和巯基加入试剂盒(Thermo Scientific)。根据制造商的说明书进行反应。用SATA在摩尔过量1当量、3当量、5当量和10当量改性在20mM磷酸钠(pH 7.2)中的1mg/mL浓度的抗体。在室温进行反应2h。通过用羟胺以5mg/mL的浓度在室温处理2h脱保护缀合的SATA的巯基。使用CentriSpin 10柱去除残留的游离SATA和羟胺。

将PEG-烯烃/PEG-炔烃缀合至游离的SATA硫醇基–使用caproBox^TM(Caprotech)通过光诱导将PEG-烯烃/PEG-炔烃连接至与抗体缀合的SATA的游离硫醇基。在1mg/mL的蛋白质浓度和20mM磷酸钠(pH 7.2)中的10倍过量PEG-烯烃/PEG-炔烃下进行反应。每摩尔PEG加入1摩尔光引发剂I，并选择30秒的曝光时间。

5.2.结果

在起始实验中，使用不同SATA过量研究PEG-烯烃与连接至抗体IgG1的氨基的SATA分子的游离硫醇基的连接。通过SDS-PAGE分析所得的PEG化反应混合物。

在非还原性SDS-PAGE中，检测到对应整个IgG1的在155kDa处的主条带。在较低分子量(约135kDa和110kDa)的其他条带指定为部分解离的IgG1。这些条带的比例随着SATA过量的增加而增加，其可能表明SATA的连接影响了抗体的四级结构。因此，应当最小化SATA相对于抗体的过量。在还原性SDS-PAGE中达到总蛋白质的1-2％的66kDa处的条带对应于单一PEG化重链。较高分子量处的其他条带指定为高分子量杂质(HMWI)，其可能对应于聚集物或复合PEG化蛋白质。为了进一步的研究，进行对照反应，对此用3当量或10当量SATA改性IgG1。随后在不添加PEG-烯烃的标准条件下进行光点击反应。

在还原性SDS-PAGE中，检测到关于PEG化反应中观察到的HMWI的条带。由于在光点击反应中未添加PEG于混合物中，这些条带指定为聚集的蛋白质。

在随后的实验中，研究了通过光点击化学以1倍和3倍过量将PEG-烯烃与缀合有抗ACTH抗体的SATA的连接。

使用抗ACTH抗体，相较于IgG1，在光点击反应后观察到较低比例的聚集物。通过还原性SDS-PAGE分析，检测到对应于抗ACTH抗体的单一PEG化重链的条带。因此，认为抗体的PEG化是可行的，然而，单一PEG-HC的比例低(<1％)。

实施例6

用烯烃/炔烃表面改性金表面并通过光反应共价偶联蛋白质(抗体)

6.1.设备

下表中列出的设备是示例性的。可以使用来自其他制造商相当质量的设备。

6.2.材料

下表中列出的材料是示例性的。可以使用来自其他制造商相当质量的设备。

6.3.溶液和缓冲液制备

o 10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2

●在250mL烧杯中称重710mg的磷酸氢二钠并用250mL ddH₂O填满；称取780mg磷酸二氢钠至另一个250毫升烧杯中并填满ddH2O。

●在500mL烧杯中加入250mL磷酸氢二钠并用磷酸二氢盐滴定直至达到pH为7.2。

●使用0.2μm聚醚砜膜过滤器，过滤此溶液至500mL玻璃瓶中。

●室温保存此溶液长达6个月。

o 25mg/mL TCEP在ddH₂O中的储备溶液

●称取25mg TCEP至1.5mL螺帽管中。

●加入1mL的ddH₂O。

●涡旋此试管直至TCEP完全溶解。

●在4℃保存。

o 1mg/mL在20mM磷酸钠缓冲液中的光引发剂，pH为7.2

●称重10mg光引发剂至15mL螺帽管。

●加入10mL的10mM磷酸钠缓冲液,pH为7.2。

●在40℃震荡此溶液10min以溶解该光引发剂。

●将此溶液通过0.2μm聚醚砜注射器式过滤器。

●在使用当天制备此溶液。

o 10mM的PEG-烯烃/PEG-炔烃在DMAC中的溶液和金表面改性

●在-20℃保存PEG-烯烃/PEG-炔烃；在室温解冻约30min。

●称重合适量的PEG-烯烃/PEG-炔烃至15mL螺帽管(5000DaPEG-烯烃→在1mLDMAC中溶解500mg以获得100mM储备溶液)。

●涡旋此PEG溶液直至PEG完全溶解。

●可以等分100mM储备溶液并保存在-20℃。

●因此在使用当天制备工作溶液：

●用DMAC稀释储备溶液至10mM工作溶液浓度。

●颠倒和涡旋此溶液以均匀化。

●移取10μL 10mM PEG-烯烃/PEG-炔烃溶液至洁净的金CMOS表面并允许在通风橱内的玻璃培养皿中在20℃反应60分钟。

●在250mL烧杯内用ddH₂O洗涤金CMOS表面10s。

●用压缩空气干燥金CMOS表面。

●保存干燥，直至在20℃使用。

o二硫键的TCEP还原

●移取20μL抗体(0.2mg/mL,MW＝150kDa)至0.5mL杯中。

●用磷酸钠缓冲液以1:100(两次)和1:2稀释TCEP储备液，以得到相对于抗体浓度为3倍摩尔过量的最终TCEP浓度。

●加入20μL TCEP至抗体。

●在室温孵化还原混合物60min并以30rpm搅拌。

o抗体的点样和偶联

●移取15μL点样缓冲液至Genetix板。

●加入2.24μL的光引发剂储备溶液。

●加入12.76μL的比点样浓度高一倍的还原的抗体溶液。

●点样(标准点样步骤)。

●在距离金表面上10mm的距离处将紫外灯置于点样装置并暴露于紫外光(λ＝302nm)至少4min至多达10min。

●用ddH₂O洗涤并用压缩空气干燥。

●使用期望的封闭剂封闭表面(封闭方案)。

●用ddH₂O洗涤并用压缩空气干燥。

●使用CMOS进行预期分析。

图4的上部示意性地显示了金属表面(1)，其通过交联剂分子(4)改性，所述交联剂分子经二硫醇基共价连接至金属表面，具有作为间隔基的PEG基团和末端烯丙基。

加入生物分子(2)(其具有至少一个巯基)、光引发剂和用UV光辐射后，由交联剂将生物分子固定(3)在表面上，如图4的下部所示。

实施例7至9

在图1至3的荧光图片中显示了不同固定化实验的结果，进行该实验从而评价CMOS芯片的表面改性。

所述CMOS芯片包含128个电极，每个电极可以经点样编址(参见实施例6)。也显示了相应的点样布局。

实施例7

与脂肪酰胺-PEG(11)-马来酰亚胺改性的表面相比，紫外光和光引发剂的影响。

在随后的实验中，从CMOS芯片摄取荧光图片，该芯片由128个作为传感器表面的金电极组成。已经使用不同的稀释溶液和点样缓冲溶液进行点样多克隆兔抗ACTH抗体。随后，实施针对ACTH的完整测定，将ACTH加至所述表面。加入之后，单克隆小鼠抗ACTH抗体与结合的ACTH结合，并且可以用荧光标记的兔抗小鼠抗体使其可视化。

荧光强度直接与结合的多克隆兔抗ACTH抗体的量成正比。在图1中显示了相较于脂肪酰胺-PEG(11)-马来酰亚胺改性的表面的光反应的不同条件。

A：在304nm波长处，用UV照射脂肪酰胺-PEG(11)-马来酰亚胺改性的表面10min。仅可观察到微弱的荧光出现。这意味着所述抗体的固定化反应仅低程度地发生。

B：根据本发明的R-α-硫辛酸-PEG(11)-炔丙基改性的表面，其中7.5min照射时间。明显的是一定已经发生了所述抗体的固定化，这是因为较高的荧光强度。

值得注意的是在样品KIA5-KIA7中未使用光引发剂，然而，使用光引发剂产生样品KIA1-KIA4。所有的抗体预先用TCEP处理，其中采用不同过量的TECP(30倍、3倍摩尔过量，相对于抗体浓度)。

C：未使用UV照射的R-α-硫辛酸-PEG12-炔丙基改性的表面。明显地，在无UV照射下，仅很少的抗体固定在该表面发生。

D：点样-布局KIA表示多克隆兔抗-ACTH抗体的不同反应条件。

SPO：表示点样对照，其中仅施用点样缓冲液。

实施例8

具有和不具有光引发剂的单克隆小鼠抗ACTH抗体的固定化。

在这个实验中，已经证明了用于单克隆小鼠抗体的固定化的光反应的适用性。直接用荧光标记的抗小鼠抗体染色所述抗体。相应的结果在图2中显示。

图2显示了在R-α-硫辛酸-PEG12-炔丙基改性的表面上和经4min照射时间，借助于根据本发明的光反应进行单克隆小鼠抗体的固定化。

A：显示了在使用和未使用光引发剂情况下的固定效率比较。明显地，光引发剂的使用实现了强烈的和均一的单克隆抗体的固定化。然而，在无光引发剂下，固定的效率不太明显，并且可以识别区域的形成。然而，可以假定的是在无光引发剂下以足够的照射时间也可以进行所述反应。

B：点样布局KIA对应于多克隆兔抗ACTH抗体，该抗体不能染色。

SPO：表示点样对照，其仅施用点样缓冲液。

MIA：表示单克隆小鼠抗体，其中已经在用光引发剂和未用光引发剂下生成MIA1、MIA2。已经预先地用TECP处理所有抗体。

实施例9

比较烯丙基和炔丙基官能团以及明确的和非明确的PEG链长度。

在这个实验中，比较了烯丙基和炔丙基基团的反应性。此外，研究了明确的和非明确的PEG链长度的反应性差异。非明确的PEG链长度为具有5kDa平均分子量的那些。如实施例7中所述使用ACTH作为分析物进行测试。用一层苯并环丁烯(BCB)预处理所用的CMOS芯片，因此，电极间的空隙显示出增强的荧光。抗体以1：2稀释系列应用，起始浓度为100μg/mL。相应的结果在图3中显示。照射时间是4min。

图3显示了多克隆兔抗ACTH抗体通过根据本发明的光反应在不同改性的表面上的固定化。

A：R-α-硫辛酸-5kDa PEG-炔丙基(实施例1.5)改性的表面。

B：R-α-硫辛酸-PEG12-炔丙基(实施例1.2)改性的表面。

C：R-α-硫辛酸-5kDa PEG-烯丙基(实施例1.4)改性的表面。

D：R-α-硫辛酸-PEG12-烯丙基(实施例1.1)改性的表面。

E：点样布局KIA对应于多克隆兔抗ACTH抗体，其中KIA显示出最高浓度(100μg/mL作为点样溶液)，然而KIA4包含最低浓度(12.5μg/mL作为点样溶液)。明显的是D显示出最高强度的荧光。所有其他的改性表面显示出稍稍较低的强度，但是此处也注意到特定的固定化。

Claims

1.一种用于固定含有至少一个巯基的生物分子的方法，该方法包括以下步骤：

(e)任选地用还原剂处理生物分子以断开生物分子中存在的-S-S-桥，或者

(f)任选地用携带受保护的巯基的酰化剂处理生物分子和使所述巯基脱保护；

(g)使改性的金属表面与生物分子接触；

(h)在光引发剂存在下用紫外线照射所得表面，

其中所述金属表面用交联剂化合物改性，所述交联剂化合物包括：

a.共价连接到所述金属表面的末端硫醇基或二硫醇基，所述末端硫醇基或二硫醇基连接到

b.间隔基，所述间隔基的另一末端携带

c.分离的双键或三键。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的交联剂化合物是式(I)的化合物，HS-(CH₂)_m-CH(ZH)-间隔基-(CH₂)_p-A (I)

其中

m是2至6的整数，

A选自-CH＝CH₂和-C≡CH，和

Z是S或单键，

间隔基是下式的基团

-(CH₂)_n-(C＝O)_x-Y-(CH₂CH₂-O)_y-(CH₂)_r-(C＝O)_v-X-

其中

X和Y各自独立地为NH或O，

n为0或者1至10的整数，

x和v各自独立地为0或1，

y是1至20的整数，

r和p各自独立地选自1至6的整数。

3.根据权利要求2的方法，其中

Z是S，

A是–CH＝CH₂，和

m是2至4的整数，

X和Y是NH，

n是0或1至10的整数，

x和v是1，

y是1至20的整数，

r和p是1。

4.根据权利要求1至3中任何一项的方法，其中所述生物分子是抗体、酶或核酸。

5.根据权利要求1至4中任何一项的方法，其中所述光引发剂是1-苯甲酰基-1-甲基乙醇衍生物。

6.根据权利要求1至5中任何一项的方法，其中所述照射在波长λ_max为300至340nm进行，优选在约320nm进行。

7.式(I)的交联剂化合物，

HS-(CH₂)_m-CH(ZH)-间隔基-(CH₂)_p-A(I)

其中

m是2至6的整数，

A选自–CH＝CH₂和-C≡CH，和

Z是S或单键，

间隔基是下式的基团

-(CH₂)_n-(C＝O)_x-Y-(CH₂CH₂-O)_y-(CH₂)_r-(C＝O)_v-X-

其中

X和Y各自独立地为NH或O，

n为0或者1至10的整数，

x和v各自独立地为0或1，

y是1至20的整数，

r和p各自独立地选自1至6的整数。

8.式(IA)的交联剂化合物，

HS-(CH₂)_m-CH(SH)-间隔基-(CH₂)_p-A (IA)

其中A、间隔基、m和p具有权利要求7的式(I)给予的含义。

9.根据权利要求8的式(IA)的交联剂化合物，

其中

m是2至4的整数，

p是1，

间隔基是下式的基团

-(CH₂)_n-(C＝O)-NH-(CH₂CH₂-O)_y-CH₂-(C＝O)-NH-

其中

n是0或1至10的整数，

y是1至20的整数。

10.式(II)的中间体，

其中A、间隔基、m和p具有权利要求7的式(I)给予的含义。

11.改性的金属表面，其中根据权利要求7至9中之一的式(I)或(IA)化合物的至少一个硫醇基与该表面的金属原子中的至少一个共价连接。

12.根据权利要求11的改性的金属表面，其中所述金属是贵金属，优选金。

13.进行根据权利要求1至6中之一的固定生物分子的方法的试剂盒，所述试剂盒包括：

(vi)具有根据权利要求11或12的改性的金属表面的基底，

(vii)任选的含有合适的还原剂的容器单元，或者

(viii)任选的容器单元，所述容器单元含有合适的携带受保护的巯基的酰化剂和用于巯基的脱保护剂，

(ix)含有合适的光引发剂的容器单元，和

(x)说明进行所述方法的条件的说明书。

14.根据权利要求13的进行固定生物分子的方法的试剂盒，其进一步包括用于UV照射的合适设备。