CN108866218B

CN108866218B - Imp基因在制备检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒的应用及方法

Info

Publication number: CN108866218B
Application number: CN201810845488.6A
Authority: CN
Inventors: 程安春; 邱浩; 汪铭书
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN108866218A

Abstract

本发明涉及一种Imp基因在制备检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒的应用及方法，具体步骤如下：根据鸭疫里默氏菌基因组DNA序列中Imp基因序列SEQ ID NO.1设计扩增引物对序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，同时在5’与3’端添加FAM荧光标记，提取样品DNA，PCR法扩增；DNA回收试剂盒进行液回收PCR扩增产物，‑20℃避光保存备用；采用如序列SEQ ID NO.4合成的PNA作为探针进行反向杂交，在荧光显微镜下观察，如果出现绿色的荧光斑则为鸭疫里默氏菌血清1型；如果未出现绿色的荧光斑，则为其它菌株。采用本发明的检测方法检测鸭疫里默氏菌血清1型，检测时间短，成本低，检测结果特异，结果判定简单。

Description

Imp基因在制备检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒的应用及方法

技术领域

本发明属于畜禽检测领域，涉及应用PNA探针反向杂交检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒，还涉及利用该试剂盒的检测方法。

背景技术

鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)是鸭传染性浆膜炎的病原菌，该病是危害养鸭业重要的疫病之一。本病呈急性或慢性败血症过程，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎以及部分干酪样输卵管炎、关节炎为特征。发病率为10％-90％，病死率高达80％，一年四季均可发生。世界各养鸭地区几乎都有该病流行，给养鸭业造成了巨大的经济损失。传统鉴定RA通常检测其培养特性、形态染色、生理生化特征、菌体的某些化学组成等表型指标，但用表型指标鉴定鸭疫里默氏菌存在不足，易于大肠杆菌、巴氏杆菌等混淆。另外，传统的鉴定方法操作复杂，费时费力，不利于及时诊断病因、检查病原和控制病情的蔓延。针对鸭疫里默氏菌这些特点，许多研究学者建立了一些检测技术，如荧光抗体技术、ELLSA、免疫组化等相继报道，但在实践中都有不同程度的局限性，如需要针对不同血清型的抗体作为检测试剂。为了能快速、准确、简便的检测鸭疫里默氏菌血清1型菌株，建立以PNA为探针的反向杂交方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供检测鸭疫里默氏菌Imp基因的试剂在制备检测鸭疫里默氏菌的试剂盒的应用；本发明的目的之二在于提供应用PNA探针反向杂交检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒；本发明的目的之三在于提供利用所述试剂盒检测鸭疫里默氏菌血清1型的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.制备检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒的应用，所述Imp基因的序列如SEQ IDNO.1所示；所述试剂盒为PNA探针反向杂交试剂盒，所述试剂盒含有如SEQ ID NO.4所示的PNA探针。

优选的，所述试剂盒中还含有特异性检测引物，所述特异性检测引物为3’端和5’端修饰有FAM，核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

2.应用PNA探针反向杂交检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒，包括特异性检测引物和PNA探针，所述特异性检测引物为3’端和5’端修饰有FAM，核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述PNA探针如SEQ ID NO.4所示。

优选的，还包括Premix Taq Mix酶和双蒸水。

优选的，还包括反向杂交试剂。

优选的，利用所述试剂盒检测鸭疫里默氏菌血清1型的方法，包括如下步骤：

(1)根据鸭疫里默氏菌Imp基因序列设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的特异性检测引物，以及如SEQ ID NO.4所示的PNA探针，并在检测引物的3’端和5’端修饰FAM，同时提取待检测样本DNA，然后以提取的样本DNA为模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的特异性检测引物进行PCR扩增，并回收PCR产物；

(2)将PNA探针固定于活化的PVDF滤膜上，预杂交后在含回收产物的杂交液中杂交，洗膜，荧光显微镜绿色荧光波长下观察，如果样品出现绿色荧光斑则为鸭疫里默氏菌血清1型，如果未出现则为其它菌株。

优选的，所述PCR扩增的条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s；共30个循环，72℃延伸10min，降温至16℃。

优选的，所述将PNA探针固定于活化的PVDF滤膜上的具体步骤如下：将PVDF滤膜在甲醇中浸泡15s进行活化，然后移至转膜缓冲液中浸泡30min，再用6×SSC溶液充分浸泡30min，18-25℃晾干，将浓度为10μM的PNA探针加至膜上后，先18-25℃干燥1h，然后在258nm处紫外交联30min，60℃烘烤30min。

优选的，所述预杂交为将预杂交液预热至55℃，然后将固定PNA探针的膜放入其中，55℃水浴摇床10-12h；所述洗膜为将杂交后的薄膜用2×SSC、质量分数0.5％的SDS溶液，55℃漂洗2次，每次1h，然后将滤膜移入0.1×SSC、质量分数为0.1％的SDS溶液中，55℃轻轻摇动1h，重复2次，最后继续保温30min。

本发明的有益效果在于：采用本发明的检测方法检测鸭疫里默氏菌血清1型，检测时间短，检测成本低，准确性高。避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、检出率低、假阳性/假阴性较多等缺点。同时不用采用传统方法中必须使用的血清1型鸭疫里默氏菌的抗血清，降低了检测成本。本发明的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为特异性评价及部分临床分离株的实验结果(1：RA CH-1(RCH)；2：RA CH-2；3：RA ATCC11845；4：RA RCAD0200；5：RCAD0025；6：RCAD0026；7：RCAD0192；8：RCAD0210；9：RCAD0155；10：RCAD0190；11：RCAD0195；12：RCAD0220；13：ATCC 25922株；14：Salmonellaanatis CMCC 50083株；15：Salmonella.typhimurium CMCC 50115株；16：Pasteurella.multiocida PM966株)。

图2为灵敏度评价实验结果(1-11：PNA探针浓度分别为50μM，25μM，12.5μM，6.2μM，3.1μM，1.6μM，0.8μM，0.4μM，0.2μM，0.1μM，0.05μM；12：ddH₂O)。

图3为鸭疫里默氏菌临床分离株的检测结果；RCAD135株为血清1型鸭疫里默氏菌，RCAD188株不是血清1型鸭疫里默氏菌。

具体实施方式

下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、应用PNA探针反向杂交检测鸭疫里默氏菌血清1型方法的建立

设计特异性扩增鸭疫里默氏菌的引物对及血清1型鸭疫里默氏菌特异性杂交的PNA探针：通过生物信息学分析，从鸭疫里默氏菌基因组DNA序列中找到Imp基因，Imp在其它革兰氏阴性菌中高度保守，具有多种重要的生物学功能，除了参与脂多糖输出装配到外膜的过程，还与菌体被膜的生成和细菌有机溶剂耐受性有关。将之作为血清1型鸭疫里默氏菌检测靶基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示。

(1)引物及PNA探针设计

根据Imp基因序列设计产物大小范围为100-500bp的引物和在PCR扩增产物内血清1型鸭疫里默氏菌特异的PNA探针，具体序列如下(引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成)：

上游引物：5’FAM-aaaagaaaatgacttacct-FAM3’(SEQ ID NO.2)；

下游引物：5’FAM-tacatttgtataggtcctg-FAM3’(SEQ ID NO.3)；

PNA序列：N端-cccctcttgcga-C端(SEQ ID NO.4)，由panagene公司合成。

(2)DNA模板的制备

将鸭疫里默氏菌各种血清型的菌株分别接种至10ml的胰酶大豆肉汤液体培养基中，在37℃增菌12h后，取1ml菌液放入1.5ml的离心管中，3000r/min离心10min，弃上清后无菌双蒸水重悬，然后12000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。用无菌双蒸水重新悬浮菌体，在沸水浴中煮15分钟，立即取出，在-20℃放置30min；37℃解冻后，12000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。

(3)PCR扩增

PCR扩增体系为25μL反应体系，具体为：Premix Taq Mix酶12.5μl，10μM引物对1.0μl，模板溶液1～2.5μl，最后用双蒸水补至25μl。PCR检测反应程序：先95℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环结束后，72℃延伸10min，降温至16℃结束。

(4)PCR产物回收及探针固定

DNA回收试剂盒进行PCR产物液回收，-20℃避光保存备用。探针固定：采用PVDF滤膜(孔径0.22μm)先在甲醇中浸泡15s进行活化，然后移至转膜缓冲液中浸泡30min，再用6×SSC溶液充分浸泡30min，室温晾干，将10μM PNA探针加至膜上后，先室温干燥1h，然后在258nm处紫外交联30min，60℃烘烤30min；

(5)预杂交

预热至55℃的预杂交液(6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA。其中6×SSC组分如下：52.5g/L氯化钠，26.5g/L柠檬酸三钠)，将膜放入其中，55℃水浴摇床10-12h，在滤膜表面常会形成水气泡，轻轻晃动杂交液即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要；

(6)杂交

预热至60℃的杂交液(预杂交液中接入2μl PCR产物回收的DNA)，将膜转移其中，60℃水浴12h；

(7)洗膜

2×SSC、0.5％SDS溶液，55℃漂洗1h×2，然后将滤膜移入0.1％×SSC、0.1％×SDS溶液中，55℃轻轻摇动1h×2，最后继续保温30min；

(8)照相

荧光显微镜绿色荧光波长下观察，如果样品出现绿色荧光斑则为鸭疫里默氏菌血清1型，如果未出现则为其它菌株。

结果：在荧光显微镜下，仅鸭疫里默氏菌血清1型出现绿色荧光斑。

实施例2、PNA反向杂交检测方法特异性评价实验

分别按照实施1中DNA模板提取方法和PNA探针反向杂交检测方法，对大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、多种血清型鸭疫里默氏菌菌株(保藏菌株、未知血清型或血清学试验鉴定血清型的鸭疫里默氏菌临床分离菌株，如表1所示)进行检测。

PNA探针反向杂交特异性实验的检测结果见图1和表1，仅鸭疫里默氏菌血清1型出现绿色荧光斑。

表1.PNA探针反向杂交特异性评价所用菌株及检测结果

菌株编号	保藏号或鉴定的临床分离菌株	菌株名称及血清型	检测结果
				RA CH-1(RCH)	CCTCC NO.M2017702	鸭疫里默氏菌血清1型	+
RA CH-2	鉴定血清型的临床分离株	鸭疫里默氏菌血清2型	-
				RCAD0190	鉴定血清型的临床分离株	鸭疫里默氏菌血清2型	-
RA ATCC11845	ATCC11845	鸭疫里默氏菌血清6型	-
				RCAD0192	鉴定血清型的临床分离株	鸭疫里默氏菌血清11型	-
RCAD0025	鉴定的临床分离株	未知血清型鸭疫里默氏菌	-
				RCAD0026	鉴定的临床分离株	未知血清型鸭疫里默氏菌	-
RCAD0155	鉴定的临床分离株	未知血清型鸭疫里默氏菌	-
				RCAD0195	鉴定血清型的临床分离株	鸭疫里默氏菌血清16型	-
RCAD0200	鉴定的临床分离株	未知血清型鸭疫里默氏菌	-
				RCAD0210	NTCC698316	大肠杆菌X7213	-
RCAD0220	NTCC503720	大肠杆菌XL1-blue	-
				E.coli O6	ATCC25922	大肠杆菌O6血清型	-
Salmonella anatis	Salmonella CMCC 50083株	鸭沙门菌50083	-
				Salmonella.typhimurium	CMCC(B)50115	鼠伤寒沙门氏菌50115	-
Pasteurella.multiocida	PM966	多杀性巴氏杆菌PM966	-

表1中，-：PNA探针反向杂交检测结果为阴性：+：PNA探针反向杂交检测结果为阳性。

实施例3、PNA反向杂交检测鸭疫里默氏菌血清1型灵敏度评价实验

PNA探针的初浓度为50μM，用无菌水做2倍梯度稀释，共稀释10个梯度，每个梯度分别取2μl进行探针固定，按照实施例1步骤进行反向杂交检测，如图2所示。由图2可知，图中5(所对应PNA探针浓度为3.1μM)可看到荧光斑，图中4(所对应PNA探针浓为6.2μM)可以看到清晰的荧光斑，具有极高的灵敏性。

实施例4、鸭疫里默氏菌临床分离株的检测

利用实施例1建立的鸭疫里默氏菌PNA探针反向杂交检测方法对四川周边20多个规模化养殖厂的鸭群中分离的100株鸭疫里默氏菌临床分离株进行检测，包含血清1型、血清2型、血清6型、血清11型及其它未知血清型菌株，同时进行血清凝集试验，将二者试验结果进行比较。

结果：仅RCAD135菌株显示出明显的荧光斑(如图3)，而其它菌株均无明显反应。同时，对该100株RA临床分离株进行血清凝集试验，结果表明仅RCAD135菌株为血清1型，与建立的PNA杂交检测方法试验结果一致。同时，PCR产物测序结果也表明，RCAD135菌株中含有PNA作用的血清1型鸭疫里默氏菌靶序列，说明该方法能够用于检测鸭疫里默氏菌血清1型。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> Imp基因在制备检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒的应用及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 2610

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgaagccaa attttcaata taaagcattg gcaaaaaaca gctccaaaaa tactttactt 60

attttaatta tcctaatttt taacaatttt ttagcacaaa acacccctcg tacaaatgct 120

aaaaatattg aggataaatc tgtaaaaaag gacagcctat cccctcgtaa agaatccctc 180

gagggtaccg tgaaaatgca atccgaaaac caaaggaatg atgttcaaaa gaaaatgact 240

taccttaaca aaaaggccaa agtacagtat ttggatatga ctatagaggc agattacata 300

tccataaact gggaaaatgg agatattttc gcaagagggg agcaagacga aaatgggaaa 360

attataactc ccgcttcctc tactcaagca ggtaaaaaat acgaatataa cgaggttaag 420

tttaacttta aaaataaaaa ggctattgcc tacaatgcta gaaccgaaga acaggaaggc 480

gttattgtag ctcaaaaaac aaaaaaggta aacgactctg ttttctttat gcgaaacgga 540

gtttacacta ctgatgaata ttttttaaag aaaaaagaca gtcttgcaga ctatcattta 600

gcagcaccta atatcaaatt gattaaaggg aaaaatgcct caagggtaat tacaggacct 660

atacaaatgt acatagagca agtccctacc cctctagtaa tgccatttgc aatactcccc 720

ttttctgata aaagaaccgc aggcatctta attccgagtt ttggagaaag acaagatgta 780

ggttttttcc tgaataactt tggttattac caacctatag gtgaacactt tgatttaaaa 840

gtcttcttag atttttatac caaaggaagt tggaacattc gtcccgagct aggttataag 900

aaaaactaca agtataatgg tgtcttctct gcagatgtag gtactacagt gcacggtata 960

aaaggactca gtacctactc taaatctagt acttatcgta ttacttggcg gcatactcaa 1020

gatgctaaag ctaatccatt ttttaacttt tctgcctctg tagatatggt tagtaatcgt 1080

ttttacaaca atacaatcaa taacagttat atcttcaatc aagatgttct tagaacacaa 1140

cagaactccg ccattagcat taccaaaaaa tttctcaatc tacctataag catcacagga 1200

agtgccactt actctcaaaa tttcgccaca ggagatgtta atatcagact tcctcagctc 1260

aatgtaatga taaaccaatt ctacctattc aagcctaaaa caggcgtaag aactggtctt 1320

ctagaaaata tttatgtaaa cacagggcta tcgctagata actatgtaaa taccactcaa 1380

aagcaagcct tcacaaaaga tatgtggagt aatatgcaaa ctggtataaa aatccccgta 1440

tcattaacta ccaatacatc tgtaatgaag tattttacac tctctttggg cgcaaacttc 1500

aataatgtat taactacaaa aactctaaac aaaagctaca accctataag taacaccaca 1560

gtaaatacct accaaaataa tattgctggg tactctactt tttctacttc cgctggttta 1620

cagaccgtaa tttatgggca agctaatttt aggaaaggag caaggataca agccataaga 1680

catatggttt ctcctagtgt gagcttttct tatacacctg actttggtaa atctaattgg 1740

ggatattacc gaaactttta cggtgcagat ggttctataa attcttattc tatatttgaa 1800

ggaagtattt ttggaacacc ctcccgtggg ctatctcaaa ctatcagctt taacatcaat 1860

aataatattg aaatgaaagt tcggtctaag acagactcta ctggagttaa aaagattaaa 1920

atatttgaaa atatcaatat ttctggaggc tataactttg cggctgaaaa attcaaatgg 1980

tcagctttca atatcagttc tcaaaactca ttctttgata ataagctgaa tataaactct 2040

agcctttcat tagaccctta taaaatagtg tttagttcag actccaacat aggagaacga 2100

gtggataagt ttggatattt taaccttcaa aattttaatg ttcaactatc ttatcctcta 2160

agtagtgctt tattcgcaag taaagacaag gacaaccaag caaagtataa aaccaaaggc 2220

agtataatgc aagagaaata ttcttttgat gatgataact atgcctattt tgaacagcct 2280

tggacactaa acatcaatgc taattacaac tactcaaagg ctcaaacaag atttggtact 2340

aaagtagctt ccataggact agatggtaac ataaaattaa ctccattttg gactatcagt 2400

ggtagtaccc attacgattt aattagcaaa gagttagctt acggaagatt aggcttctct 2460

agagaccaaa ggagttttac tatcaacttt aactgggtac ctttcggaag gtttaaggtc 2520

tatgattttt tcatcggcat caaagccaac atattaagag acgcagtaaa atacagagaa 2580

cgtagtttcc cacaacaaag cgatttttaa 2610

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaagaaaat gacttacct 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacatttgta taggtcctg 19

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccctcttgc ga 12

Claims

1.检测鸭疫里默氏菌Imp基因的试剂在制备检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂包括SEQ ID NO.4所示的PNA探针和特异性检测引物，所述特异性检测引物3’端和5’端修饰有FAM，核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述试剂盒为PNA探针反向杂交试剂盒，所述Imp基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.应用PNA探针反向杂交检测鸭疫里默氏菌血清1型的试剂盒，包括特异性检测引物和PNA探针，所述特异性检测引物3’端和5’端修饰有FAM，核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；所述PNA探针如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括Premix Taq Mix酶和双蒸水。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括反向杂交试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述反向杂交试剂包括PVDF滤膜、甲醇、转膜缓冲液、6×SSC溶液、预杂交液、0.5%SDS溶液；所述预杂交液各物质组分如下：6×SSC，质量分数为0.5%的SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA。

6.利用权利要求2-5任一项所述试剂盒非疾病诊断目的检测鸭疫里默氏菌血清1型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）根据鸭疫里默氏菌Imp基因序列设计如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的特异性检测引物，以及如SEQ ID NO.4所示的PNA探针，并在检测引物的3’端和5’端修饰FAM，同时提取待检测样本DNA，然后以提取的样本DNA为模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的特异性检测引物进行PCR扩增，并回收PCR产物；

（2）将PNA探针固定于活化的PVDF滤膜上，预杂交后在含有回收产物的杂交液中杂交，洗膜，荧光显微镜绿色荧光波长下观察，如果样品出现绿色荧光斑则为鸭疫里默氏菌血清1型，如果未出现则为其它菌株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，48℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃延伸10 min，降温至16℃。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述将PNA探针固定于活化的PVDF滤膜上的具体步骤如下：将PVDF滤膜在甲醇中浸泡15s进行活化，然后移至转膜缓冲液中浸泡30min，再用6×SSC溶液充分浸泡30min，18-25℃ 晾干，将浓度为 10μM的 PNA探针加至膜上后，先18-25℃干燥1h，然后在258nm处紫外交联30min，60℃烘烤30min。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述预杂交为将预杂交液预热至55℃，然后将固定PNA探针的膜放入其中，55℃水浴摇床10-12h；所述杂交为在含PCR产物回收DNA的杂交液中60℃水浴12h；所述洗膜为将杂交后的滤膜用2×SSC、质量分数0.5%的SDS溶液，55℃漂洗2次，每次1h，然后将滤膜移入0.1×SSC、质量分数为0.1%的SDS溶液中，55℃轻轻摇动1h，重复2次，最后继续保温30min。