CN108866094A - 水稻不确定性小穗基因osids2在调控水稻产量中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，尤其是水稻不确定性小穗基因OSIDS2在调控水稻产量中的用途。本发明还提供水稻多花小穗基因OSIDS2在提高禾本科粮食作物产量中的用途以及提高禾本科粮食作物产量的制剂。本发明为提高禾本科粮食作物产量提供一种新选择。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其是水稻不确定性小穗基因OSIDS2在调控水稻产量中的用途。
背景技术
在双子叶植物中，顶端花序分生组织直接转变为花分生组织，进而分化形成各类花器官。然而，在水稻等单子叶植物禾本科植物中，顶端花序分生组织首先转变为小穗分生组织，然后再转变成花分生组织，再分化出各类花器官。而小穗的发育是一个复杂而有序的过程，根据前人的研究，将小穗发育过程大致分为八个阶段(Ikeda et al.,2004)：
第一阶段，副护颖原基形成。副护颖原基以1/2互生叶序方式形成；
第二阶段，护颖原基的形成。一对护颖原基同样以1/2互生叶序方式形成，此时副护颖停止发育；
第三阶段，外稃原基形成。外稃原基在外部护颖的上方形成，此时护颖继续生长；
第四阶段，内稃原基形成。位于内部护颖上方，与外稃位置对称，护颖和外稃继续生长；
第五阶段，浆片原基形成。在外稃一侧的位置形成两个浆片原基，此时护颖、外稃、内稃继续生长；
第六阶段，雄蕊原基形成。六枚雄蕊原基以轮生体的形式排列，且靠近外稃一侧的发育较迟缓；
第七阶段，心皮原基形成。心皮原基在外稃一侧的花分生组织形成，雄蕊开始分化出透明的花丝和花药；
第八阶段，胚珠和花粉形成期。花分生组织不确定性丢失，转化成胚珠原基。在这个过程中发生了许多重要而复杂的程序来完成雌雄生殖器官的发育。
小穗是所有禾本科作物特有的花序结构，包含一对苞片和数目不等的小花，小花数目一般是1-40朵，是介于花序和花之间的一类特殊花序。小穗可分为两种类型：一种是确定性小穗，包含有确定数目的小花，如水稻、玉米。另一种是不确定性小穗，包含不确定数目的小花，如小麦。在确定性小穗中，顶端分生组织在产生固定数量的侧生分生组织后，被转化为末端花分生组织。而不确定性小穗中，侧分生组织不断从顶端分生组织分化而来，顶端分生组织并没有转化为末端花分生组织。目前，没有发现维持小穗分生组织不确定性命运的基因，相反，有两类基因具有终止小穗分生组织不确定性命运的功能。第一类可以定义为顶花分生组织特征基因。SEP家族中有一个禾本科特异的LHS1分支，在确定性小穗中，LHS1类基因只在顶花中表达，暗示其很有可能被特异地要求去特化顶花分生组织的产生，从而实现小穗的确定性(Cacharroón et al.,1999；Malcomber and Kellogg,2004；Zahn etal.,2005)。第二类是属于AP2/ERF家族的INDIERMINATE SPIKELET 1(IDS1)类基因，与LHS1类基因不同，并不决定顶花特征，而是负责按时启动小穗分生组织向花分生组织转化。在玉米中，IDS1基因突变导致一个小穗内产生了额外的小花(Chuck et al.,1998)，IDS1的旁系同源基因SISTEROF IDS1(SID1)的单突变没有显著表型，但是在ids1/sid1双突变体中，小穗发育出多个苞片结构而不能形成小花(Chuck et al.,2008)。在水稻中，两个IDS1类基因SUPERNUMERARYBRACT(SNB)和OsIDS1的突变都导致副护颖增多，snb/osids1双突变体中，副护颖更是显著增多(Lee et al.,2006；Lee and An,2012)。这些结果表明IDS1类基因突变延长了小穗分生组织命运。
发明内容
本发明的目的在于提供水稻不确定性小穗发育基因OSIDS2的核苷酸序列及编码蛋白序列，为水稻穗发育研究提供有力工具，促进水稻产量的提高。
本发明提供了调控水稻产量的制剂，其主要活性成分为OSIDS2基因编码的蛋白质，或表达OSIDS2基因的元件或载体。
具体的，所述的OSIDS2基因编码的蛋白质具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2示的氨基酸序列。
具体的，所述的OSIDS2基因具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4核苷酸序列。
本发明提供了调控水稻穗粒数的制剂，其主要活性成分为OSIDS2基因编码的蛋白质，或表达OSIDS2基因的元件或载体。
具体的，所述的OSIDS2基因编码的蛋白质具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2示的氨基酸序列。
具体的，所述的OSIDS2基因具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4核苷酸序列。
本发明还提供了OSIDS2基因在调控水稻产量中的用途。
具体的，所述的用途为调控水稻穗粒数。
具体的，所述的OSIDS2基因编码的蛋白质具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2示的氨基酸序列。
具体的，所述的OSIDS2基因具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4核苷酸序列。
小穗本质上是一种禾本科特异的花序。育种上将一个完整的稻穗称为“穗”，而本申请中的小穗是指发育学上的小穗，相当于育种学上的一个颖花。正常的水稻小穗从基部到顶部依次由一对副护颖、一对护颖和一朵顶生小花构成。顶生小花包括4轮花器官，第1轮是锁在一起的外稃和内稃，外稃略大于内稃；第2轮是着生在外稃一侧的两枚浆片；第3轮是6枚雄蕊，第4轮是1枚雌蕊，雌蕊位于小花的中心，雄蕊着生在其周围。穗粒数是水稻等禾本科粮食作物十分重要的产量性状，构成因素包括花序上枝梗的数目、长度以及其上小穗的着生密度等，而小穗内小花的数目通常不在考察的范围内，因为正常的物种一个小穗内小花数目是稳定的。
本发明的有益效果：本发明在基因定位的基础上，以水稻穗发育突变体oryzasativa indeterminate spikelet2(osids2)为材料，克隆了突变基因OSIDS2。通过同源搜索及基因序列差异比较，确定OSIDS2基因属于MYB基因家族MYB-1R类转录因子。由6个外显子组成，基因cDNA全长921bp，编码框DNA全长3887bp。突变体osids2中，cDNA在第5个外显子上第198位氨基酸有一个C碱基的缺失，引起移码突变，导致第213位氨基酸转化为终止密码子，使蛋白质翻译提前终止。导致部分小穗内稃外稃化或退化，部分的小穗长出额外的外稃。剥去内外稃进一步观察发现，部分小穗内部着生有额外的颖壳状器官，雄蕊数目或增多或减少，心皮数目增加，这些结果表明osids2突变体小穗趋向于生长出两朵小花，小穗分生组织确定性丢失。OSIDS2基因维持小穗确定性发育，其功能缺失导致小穗内小花数目的增加，提供了一种可能增加穗粒数的育种途径。
附图说明
图1 osids2突变体及其野生型抽穗期的小穗表型观察
A1-A7，野生型(WT)小穗；A1-A3，体视镜分析；A4-A5，电镜分析；A6-A7，横切片组织学分析；B1-B7，内稃外稃化的osids2突变体小穗；B1-B3，体视镜分析；B4-B5，电镜分析；B6-B7，横切片组织学分析；C1-C8，内稃退化的osids2突变体小穗；C1-C4，体视镜分析；C5-C6，电镜分析；C7-C8，横切片组织学分析；标尺＝250μm。
图2 osids2突变体及其野生型幼穗分化期的小穗形态观察
A-D，野生型小穗；E-H，内稃退化的osids2；I-L，内稃外稃化的osids2小穗；星号表示雄蕊。标尺＝100μm。
图3 OSIDS2基因的图位克隆
A，OSIDS2基因的精细定位；B，OSIDS2基因互补载体示意图；C，OSIDS2基因在野生型和突变体幼穗中的实时定量表达分析，纵坐标表示基因相对表达量；D，OSIDS2基因互补转基因植株表型观察标尺＝250μm。
图4 OSIDS2基因表达模式分析
A，OSIDS2基因在幼苗期根，叶，分蘖期根，叶，芽，抽穗期根，茎，节，鞘，叶，叶耳，芽及不同发育时期(小于5cm，0.5-2cm，2-5cm)野生型小穗和各轮花器官中的实时定量表达分析；B-D，OsMADS1，DL，OsMADS6基因在<5cm，0.5-2cm，2-5cm发育时期野生型小穗和突变体小穗中的实时定量表达分析，纵坐标表示基因相对表达量。
图5 OSIDS2蛋白的氨基酸序列比对分析
图6 OSIDS2蛋白的亚细胞定位
A-D:阴性对照(35S-GFP)；E-H:OSIDS2蛋白的定位(35S-OEOSIDS2-GFP)
具体实施方式
本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号(WT)和不确定性小穗突变体(osids2)均购买自西南大学水稻研究所； Reagent Kit With gDNA Eraser逆转录试剂盒、高保真DNA聚合酶Primer Star Max、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、pMD19-T载体、SYBR Green荧光染料及DL5,000 DNA Marker购自TaKaRa公司；；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)和卡拉霉素(Kanamycin，Kan)为Sigma公司产品；DNA MarkerIII，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，快速质粒小提试剂盒、植物总RNA提取试剂盒购自天根(TIANGEN)生物公司，pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit重组酶购自全式金生物公司，引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其他化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；pCAMBIA1300、pTCK303植物表达载体、pA7植物表达载体、大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404在BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买。
表1实施例中所用到的引物
实施例1 osids2突变体的获得及表型分析
水稻花器官突变体OSIDS2是在泸恢1089的育种中间材料中发现的天然突变体，经过多代自交，遗传稳定。研究中，以重庆西南大学水稻研究所选育的优良籼稻恢复系缙恢10号(J10)作为野生型对照，对突变体进行相关分析。
在水稻抽穗期，取osids2与野生型的小穗进行形态学和组织学分析。形态学分析：一方面取新鲜的成熟小穗放置于尼康SM1500体视显微镜下进行解剖、观察花器官形态和数目，并拍照记录；另一方面取幼嫩花序和成熟小穗利用日立SU3500电子扫描显微镜在-20℃真空条件下进行扫描电镜的观察。组织学分析：取新鲜的小穗，在FAA固定液(50％乙醇，0.9M冰醋酸和3.7％甲醛)中，4℃固定过夜，经过乙醇梯度脱水，二甲苯置换，最后将材料包埋在石蜡(Sigma)中。将包埋后的材料切成8μm的切片，然后将切好的材料放置于涂满多聚赖氨酸的载玻片上，用二甲苯脱蜡，利用不同浓度的乙醇梯度进行脱水。用1％的番红和1％固绿对切片进行染色，然后通过一系列乙醇梯度进行脱水，用二甲苯浸润切片，最后树胶封片。利用尼康E600光学显微镜进行组织学分析。结果如下：
野生型中，一个正常水稻小穗从下到上依次包括一对副护颖、一对护颖和一朵可育的顶生小花。顶生小花由外稃、内稃、两枚浆片、一枚雌蕊及六枚环绕雌蕊的雄蕊构成(图1，A1-A3)。在osids2突变体小穗具有三种类型，一类小穗具有外稃化的内稃或额外的外稃(B1-B7)，一类小穗内稃退化，外稃一定程度上向内稃弯曲(C1-C8)，另外一类小穗无明显异常并能正常结实。剥去内外稃进一步观察发现，部分小花除内外稃还有额外的颖壳状器官(B1-B2,B4,B6-B7,C5)，雄蕊数目出现增多或减少(B2-B3,C2,C5)，且观察到心皮增多的现象(B6-B7)，暗示多花小穗的形成(B6)。
在水稻小穗早期发育分化的Sp4-Sp8期(即小穗发育时期4-8，参考Itoh等2005年的文献)，取新鲜野生型和osids2突变体小穗，利用日立SU3500电子扫描显微镜在-20℃观察。野生型小穗中，在Sp4时期副护颖和护颖已经形成，同时顶花内、外稃原基开始形成(图2,A)；随后的Sp5-8，顶花内部的雄蕊、雌蕊原基依次起始分化，内外稃增大，最终闭合在一起(图2,B-D)。与野生型相比，突变体osids2的小穗相较于野生型小穗在早期发育过程中发生了明显的变化。小穗分生组织转化为花分生组织后，外稃发育基本正常，但部分内稃发育明显变迟缓，小于野生型内稃(图2，E-H)。部分小穗内稃原基形态较于野生型明显变大，且发育速度明显比野生型内稃原基快，并与外稃原基发育相似，内外稃不能闭合在一起(图2，I-L)。
实施例2 OSIDS2基因的遗传分析、基因定位和图位克隆
osids2突变体与西大1A(由西南大学水稻研究所提供)进行杂交。得到的表现型与osids2突变体表型相同的F2植株用于OSIDS2基因的遗传分析和基因定位。F2代分离群体显示突变体与野生型植株分离比符合3：1的分离比例，表示osids2突变体表型受一对显性核基因控制。
初步定位：采用BSA(混合分群分析)法进行。选取均匀分布于水稻12条染色体上Gramene、the Rice Genomic Research Program网站已公布的480对SSR引物，在亲本osids2和西农1A间检测多态性。选取F2代分离群体中的10株野生型和10株突变体单株叶片分别等量混合，分别提取正常池和突变池基因组DNA，用筛选出的亲本间具有多态性的引物在正常和突变基因池中进行基因连锁分析。经PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后，一般将具有母本带型的单株记为A,具有父本带型的单株记为B,具有双亲带型的单株记为H，经数据分析和作图并将重组率转化为遗传距离，筛选与基因OSIDS2连锁的SSR标记，发现OSIDS2与第4染色体长臂上SSR标记S-5320和S-3276连锁，我们对S-5320和S-3276间已公布的SSR标记进行亲本间差异筛选，其中找到三对差异标记S-17349、S-17407和S-17411。用连锁标记分析491株F2分离群体中的隐性突变单株，结果显示，OSIDS2基因与标记S-17349、S-17411和S-17407间的遗传距离分别为0.1cM，1.02cM和2.34cM，OSIDS2基因位于S-17349和S-17411之间(图3，A)。
精细定位：继续在S-17349和S-17407间筛选具有亲本差异的SSR标记，找到两个SSR标记S-6365和S-17391，在亲本间表现多态性(S-6365,S-17391见引物序列表1)。用这两对引物与S-17349一起分析新的1464株定位群体，S-6365和S-17391分别筛选出71个和58个重组个体，而S-17349标记筛选出3个重组个体，S-17349与S-17391的重组子互不相同，且S-6365的重组个体包含在S-17391中，表明OSIDS2基因位于SSR标记S-17349和S-17391之间。再结合已公开的水稻基因组序列结果(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)，S-17349和S-17391之间物理距离约为1.02M(图3，A)。
精细定位区间相对较大，注释基因较多，经分析后选取了6个转录因子(ORF1-ORF6)进行测序。分别设计这六个候选基因编码框引物(引物ORF1-F/R,ORF2-F/R,ORF3-F/R,ORF4-F/R,GRF5-F/R,ORF6-F/R见引物表1)，对野生型(J10)和突变体osids2植株进行测序发现，在osids2中ORF1基因即OSIDS2基因在第5个外显子上第198位氨基酸有一个C碱基的缺失，引起移码突变，导致第213位氨基酸转化为终止密码子，使蛋白质翻译提前终止(图3，A；图5)。根据已知的水稻基因组信息，OSIDS2基因属于MYB基因家族MYB-1R类转录因子。由6个外显子组成，基因cDNA全长921bp，编码框DNA全长3887bp。
为了证实此推测，采用实时定量PCR，以Actin为内参，(引物Actin-F和Actin-R序列见表1)分析OSIDS2基因(引物RT-OSIDS2-F和RT-OSIDS2-R序列见表1)在野生型和突变体小穗中的表达情况。利用天根的RNAprep Pure Plant RNA Purification Kit试剂盒提取突变体osids2和野生型植株的小穗RNA。取1微克的总RNA用 Reagent KitWith gDNA Eraser试剂盒进行反转录。定量PCR利用SYBR permix Ex Taq II Kit(TaKaRa)试剂盒在Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System中进行扩增，选用Actin作为内参(引物Actin-F和Actin-R序列见表1)，每个反应进行三个重复取平均值计算表达水平。结果表明，OSIDS2基因在突变体幼穗中的表达均高于野生型幼穗(图3，C)。
进一步，构建OSIDS2基因互补载体并进行遗传转化分析。
首先在载体pCAMBIA1300上选取XbaⅠ和KpnⅠ两个酶切位点作为pCAMBIA1300载体骨架的酶切位点，并结合已公开的水稻基因组序列结果(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/)，并根据pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit重组酶说明书，设计扩增OSIDS2基因片段的重组引物(引物OSIDS2-com-F和OSIDS2-com-R，见序列见表1)。以OSIDS2基因组DNA为模板，用引物OSIDS2-com-F/R扩增包含启动子序列的OSIDS2基因片段。再用快速限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ酶切消化pCAMBIA1300载体骨架，37℃条件下温浴30-45min，电泳回收骨架。用pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit重组酶将胶回收的酶切产物与酶切后的载体骨架连接构成pCAMBIA1300-OSIDS2互补载体(图3，B)，再转入农杆菌后转化osids2突变体植株。
在得到的转基因植株中，共观察到15株转基因植株的突变体表型得以恢复，小穗内稃发育正常，且内部花器官数目、形态都与野生型小穗一致(图3，D)。
互补植株中osids2的突变表型得到恢复，表明LOC_Os04g47890就是OSIDS2基因。
实施例3 OSIDS2基因的表达模式分析
利用实时定量PCR(引物RT-OSIDS2-F和RT-OSIDS2-R序列见表1，以Actin为内标，引物Actin-F和Actin-R序列见表1)，检测OSIDS2基因在水稻生长发育的各个时期(幼苗期、分蘖早期、抽穗期、开花期)不同部位(根、叶、茎、鞘、芽、叶耳、节、穗、内外稃、浆片、雄蕊、雌蕊)的表达情况，结果表明OSIDS2基因在各时期不同部位均有表达，特别是在抽穗早期花序长0.5cm以下表达最强烈，并在各个花器官中也有表达(图4，A)。
进一步检测了三个内外稃特征基因OsMADS1，OsMADS6和DL在不同时期小穗中的表达。OsMADS1基因在整个外稃和内稃的主体部分(边缘部分除外)表达，决定外稃和内稃主体部分的特征发育(Prasad et al.,2005)。在osids2突变体中该基因的表达相较于野生型有明显的上调，这与突变体内稃外稃化、额外颖壳状器官的表现是相符的(图4，B)；DL基因主要在外稃的中脉中表达，决定外稃的特征发育(Yamaguchi et al.,2004)，在突变体幼穗长到0.5-2cm时明显上调，这与突变体内稃外稃化、甚至有些外稃直接转化成外稃相符(图4，C)；OsMADS6基因，在内稃中表达，决定内稃的特征发育(Prasad et al.,2005)，在突变体幼穗中该基因的表达明显下调，这与突变体内稃退化、内稃外稃化相符(图4，D)。
实施例4 OSIDS2蛋白的亚细胞定位
为了明确OSIDS2蛋白的功能，利用水稻原生质体瞬时表达系统来研究OSIDS2蛋白的定位。扩增OSIDS2的编码区(引物为OEOSIDS2-GFP-F1和OEOSIDS2-GFP-R2，序列见表1)并连接到了35S-GFP-NOS(pA7)表达载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建了35S-OEOSIDS2-GFP融合蛋白载体。然后将35S-GFP和35S-OEOSIDS2-GFP融合蛋白载体分别转入水稻原生质体中，用奥林巴斯激光扫描共焦显微镜来观察GFP的荧光。在显微镜下观察到对照融合蛋白在除液泡外的整个细胞中表达(绿色荧光)，其中红色荧光为叶绿体的自发荧光(图6,A-D)；而OEOSIDS2-GFP融合蛋白，只在细胞核中观察到绿色荧光(图6,E-H)。结果表明，OSIDS2蛋白是一个定位在细胞核内的转录因子。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.调控水稻产量的制剂，其特征在于：其主要活性成分为OSIDS2基因编码的蛋白质，或表达OSIDS2基因的元件或载体。
2.如权利要求1所述的调控水稻产量的制剂，其特征在于：所述的OSIDS2基因编码的蛋白质具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的调控水稻产量的制剂，其特征在于：所述的OSIDS2基因具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4核苷酸序列。
4.调控水稻穗粒数的制剂，其特征在于：其主要活性成分为OSIDS2基因编码的蛋白质，或表达OSIDS2基因的元件或载体。
5.如权利要求4所述的调控水稻穗粒数的制剂，其特征在于：所述的OSIDS2基因编码的蛋白质具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2示的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的调控水稻穗粒数的制剂，其特征在于：所述的OSIDS2基因具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4核苷酸序列。
7.OSIDS2基因在调控水稻产量中的用途。
8.如权利要求7所述的OSIDS2基因在调控水稻产量中的用途，其特征在于：所述的用途为调控水稻穗粒数。
9.如权利要求7或8所述的OSIDS2基因在调控水稻产量中的用途，其特征在于：所述的OSIDS2基因编码的蛋白质具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2示的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的OSIDS2基因在调控水稻产量中的用途，其特征在于：所述的OSIDS2基因具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4核苷酸序列。
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