CN108865997A

CN108865997A - 一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法

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Publication number: CN108865997A
Application number: CN201810569605.0A
Authority: CN
Inventors: 吴冈义; 张靖宜; 王今朝
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2018-06-05
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-06-05
Also published as: CN108865997B

Abstract

本发明公开了一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法，属于细胞培养领域。本发明通过在星形胶质细胞培养基中添加表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，SAG和Purmorphamine，可以明显的延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、并能保持星形胶质细胞原有特性。发明人研究发现，本发明的培养基可以隔代使用，并维持星形胶质细胞传代至13代。培养至12代的星形胶质细胞纯度>95％，并能保持星形胶质细胞原有特性。

Description

一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法。

背景技术

星形胶质细胞(Astrocytes)是遍布整个中枢神经系统，从事多种复杂功能的一类胶质细胞，与神经元发生物质交换，对神经元的生长起着不可或缺的作用。鉴别星形胶质细胞主要的依据在于其能表达一种胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。在中枢神经系统中，应激性星形胶质细胞(Reactive astrocytes)会对各类损伤做出反应，最终形成胶质疤痕。生物学上常以此来判断中枢神经系统的损伤部位。星形胶质细胞参与血脑脊液屏障，对中枢神经系统血流有一定调节作用，进而对神经元的活动造成影响；星形胶质细胞与突触连接，对神经元的稳态起重要作用(Sofroniew and Vinters,2010)。最新的研究发现，在体外，星形胶质细胞可在特定的小分子化合物作用下转化成神经元，为癫痫、阿尔兹海默综合症、帕金森综合症等疾病的治疗开启了新的篇章(Zhang et al.,2015)，体外培养星形胶质细胞也成为研究胶质细胞的转换必不可缺少的一步，优化星形胶质细胞体外纯化传代的方法，为诱导其“活化”，为深入研究中枢神经系统提供了良好的模型。

现有的星形胶质细胞纯化传代的方法仍然存在一定的局限，研究的成果主要集中在星形胶质细胞纯化方面，在其体外培养传代，并保持细胞较好活性方面依旧没有新的进展。现有的技术普遍是在DMEM/F12培养基中培养，传代至第四代细胞就无法正常生长，贴壁后十分稀疏，不构成连接，最终个体细胞死亡。原代培养的细胞可含有5～10％的成纤维细胞和少突胶质细胞，并且此类细胞生长分裂旺盛，后期较难去除。Skytt.等人为去除此类细胞的污染，至细胞原代培养起在3周时间内将培养液中FBS浓度从20％至10％梯度降低，得到了≥95％的纯度(Skytt et al.,2010)。刘晓梅等通过对原代培养的细胞以不锈钢网(Φ＝200μM)过滤，一般每次传代后需要7～8天细胞才能铺满25cm²的培养瓶，传代时间长，通过多次更换培养基，然而细胞只能传至第三代，且实验的成本较高。刘晓梅的方法中，在培养过程中，多次对细胞进行换液，星形胶质细胞的生长环境多次变化，不利于细胞的分裂分化，甚至导致部分细胞死亡。很多研究表明，在培养的最后一周添加0.25μM二丁酰环腺苷酸(dBcAMP)可以增强星形胶质细胞的分裂活性(Lange et al.,2012)。但是此方法对多次传代的细胞作用较小，传代过程中失去分裂活性的细胞并不能通过添加dBcAMP再次获得分裂属性。同时，该培养方法耗用的成本较高，操作流程复杂。

综上，目前培养星形胶质细胞的方法较复杂，细胞生长较慢，一般体外培养至第三代才得到75～95％的星形胶质细胞纯度。实验过程中的多次更换培养基等操作不仅增加了实验的成本，还不利于细胞在相对稳定的环境中生长，增加了染菌的可能性。为使传代细胞保持分裂、分化活性而添加的dBcAMP对延长细胞传代、增加传代细胞可用的代数无明显作用。

目前，星形胶质细胞作为神经科学研究领域的研究重点，我们迫切需要一种能延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、保持星形胶质细胞原有特性的培养基及培养方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基及培养方法以及体外培养的星形胶质细胞。所述培养基体外培养星形胶质细胞可以延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、保持星形胶质细胞原有特性。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基，所述培养基是在基础培养基的基础上添加有表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，Smo蛋白激动剂Smoothenedagonist(SAG)和Hh激动剂Purmorphamine。

EGF为表皮生长因子，作为一种有效的细胞分裂因子，与细胞膜表面的受体有高亲和性，有利于细胞的分裂分化；FGF为成纤维细胞生长因子，与EGF作用相似，在细胞生长过程中对分裂分化的诱导有明显作用。发明人研究发现，EGF和FGF的共同作用能有效的促进星形胶质细胞在体外培养过程中的分裂分化。SAG和Purmorphamine分别可诱导小鼠培养细胞中的Hh通路活化，共同作用对与细胞体外培养的生长和稳态有重要作用。发明人研究发现，星形胶质细胞对SHH激动剂十分敏感。Smo激动剂(Smoothened agonist,SAG)和Hedgehog激动剂(Purmorphamine)都是有效的Smoothened受体激动剂，能通过直接结合到一种Hh受体的信号转导因子Smoothened同族体(SMO)蛋白上，激活Hedgehog(Hh)信号通路。Hh信号通路是细胞内调节细胞分化和细胞增殖的重要信号通路。在典型的Hh信号通路中，SHH蛋白会和PTCH受体结合，解除PTCH对SMO蛋白的抑制作用，激发下游信号引起基因表达。很重要的是，SAG或者Purmorphamine能够显著诱导体外培养的星形胶质细胞[Ca²⁺]_i的上调，这能诱导星形胶质细胞释放胶质递质，比如ATP和谷氨酸，从而引发受体调控的神经元电流。发明人研究发现在基础培养基中添加表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，Smo蛋白激动剂Smoothened agonist(SAG)和Hh激动剂Purmorphamine，可以明显的延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高星形胶质细胞纯度、并能保持星形胶质细胞原有特性。

本行业技术人员可以在体外培养星形胶质细胞时添加适量表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，Smo蛋白激动剂Smoothened agonist(SAG)和Hh激动剂Purmorphamine，并根据需要或者公知常识对所加入的4种组分含量进行调整。

本发明实施例中所用的Smoothened agonist(SAG)和Purmorphamine均是购自Invitrogen公司。

其中基础培养基可以根据本行业技术人员的公知常识选择适合星形胶质细胞的基础培养基，或者根据现有技术的文献选择合适的基础培养基。本发明所采用的基础培养基：5％胎牛血清(FBS)，Gibco MEM无血清培养基GlutaMAX(MEM+GlutaMax)，1M葡萄糖，50g/L NaHCO₃，1％青霉素混合盘尼西林双抗(P/S)，这是本行业目前常用的一种用于培养星形胶质细胞的基础培养基。

优选的，表皮生长因子在所述培养基中的浓度为5-200ng/ml。

更优选的，表皮生长因子(EGF)在所述培养基中的浓度为10-20ng/ml。

优选的，成纤维细胞生长因子在所述培养基中的浓度为5-200ng/ml。

更优选的，成纤维细胞生长因子(FGF)在所述培养基中的浓度为10-20ng/ml。

当培养液中EGF和FGF浓度超过20ng/ml时，培养的星形胶质细胞形态变化较大，细胞形态细长，难以铺满培养瓶底部，效果稍差。

优选的，SAG在所述培养基中的浓度为0.05-1M。

优选的，Purmorphamine在所述培养基中的浓度为0.05-1M。

优选的，所述基础培养基包含下述组分：5％胎牛血清(FBS，v/v)，Gibco MEM无血清培养基GlutaMAX(MEM+GlutaMax)，1M葡萄糖，50g/L NaHCO₃，1％青霉素混合双抗(P/S，v/v)。

优选的，所述用于体外培养星形胶质细胞的培养基(实施例中记为星形胶质细胞的EFPS胶质细胞培养液)，包含下述组分：5％胎牛血清(FBS)，MEM+GlutaMax，1M葡萄糖，50g/L NaHCO₃，1％青霉素混合双抗(P/S)，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ng/ml成纤维细胞生长因子(FGF)，0.1μM SAG，0.1μM Purmorphamine。

其中，本发明实施例中所用的表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，SAG，和Purmorphamine的浓度是采用EC50半最大效应浓度。

EC50，半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect,EC50)是指能引起50％最大效应的浓度。EC50是药物安全性指标。其含义是：引起50％个体有效的药物浓度。这充分说明了培养基中添加4种组分后可以产生积极而有效的效果。当然，本行业领域技术人员在可以根据需要对4种物质含量进行调整以获得更好的培养效果。

优选的，表皮生长因子在所述培养基中的浓度为5-200ng/ml，成纤维细胞生长因子在所述培养基中的浓度为5-200ng/ml，SAG在所述培养基中的浓度为0.05-1M，Purmorphamine在所述培养基中的浓度为0.05-1M。一般来说，在培养细胞的水平，我们将上述的EFPS浓度范围限制在这个水平内。

一种用于体外培养星形胶质细胞的培养方法，利用上述任一项所述的培养基隔代替代基础培养基对星形胶质细胞进行体外培养。如，第一代使用本发明添加了4种组分的培养基后，第二代使用基础培养基，第三代继续使用本发明添加了4种组分的培养基。如此往复循环。

发明人研究发现，本发明的培养基可以隔代使用，并维持星形胶质细胞传代至13代。其中图3B的结果显示，使用本发明培养基隔代培养到13代的星形胶质细胞，优于对照中仅用基础培养基培养至第5代的星形胶质细胞。但是本发明的培养基也不建议连续使用。如果连续使用，仅能将星形胶质细胞培养至5-6代，如果继续培养，星形胶质细胞形态变得十分细长，呈纤维状细胞质分枝，形态类似于神经干细胞。

优选的，培养中每次传代时，用酶液对细胞消化2-5min后，震荡培养器皿(如培养瓶)，使少突胶质细胞悬浮，弃去溶液；然后再加入酶液消化得到星形胶质细胞进行传代。

优选的，震荡时需剧烈震荡。

优选的，酶包括胰蛋白酶。目前来说胰蛋白酶是最常见的，也可以根据需要或者常识使用别的消化蛋白用酶。

优选的，利用酶液消化前，可以使用培养基或缓冲液进行漂洗。

优选的，再加入酶液消化，待细胞变圆，约有2/3细胞漂浮时，立即终止消化，得到星形胶质细胞。第二部消化过程为常规方法。

发明人研究发现：星形胶质细胞帖壁比较紧，而少突胶质细胞帖壁性差很多。所以采用两次消化的方法。第一次，利用酶(如胰蛋白酶)进行短时间消化，然后剧烈震荡培养瓶，使少突胶质细胞悬浮，弃去溶液。这个过程其实是起到了一个纯化的效果。发明人发现，剧烈震荡不会导致细胞数目的显著下降。统计表明，不经过震荡换液P2培养中，星形胶质细胞占比～72％，少突胶质细胞占比～19％；震荡换液P2培养中，星形胶质细胞～97％，少突胶质细胞占比～1％。且震荡换液P2培养中DAPI⁺的细胞(DAPI标记细胞核，其结果可以反应细胞的总数)可能还存在极少数的小胶质细胞或多功能干细胞等。明场观察可见，不震荡换液的星形胶质细胞培养(仅按照第二步消化的方法处理)中，少突胶质细胞在P1-P3中均明显存在，但是通过震荡换液的星形胶质细胞培养，P2视野可见基本为星形胶质细胞。这充分说明，通过震荡换液可以去除少突胶质细胞，保留星形胶质细胞。而且少了少突胶质细胞的干扰，星形胶质细胞的生长发育更佳，细胞总数没有明显减少，细胞生长状况较好。

一种体外培养的星形胶质细胞，所述星形胶质细胞是利用上述任一项所述的培养基进行隔代体外培养得到的。

一种体外培养的星形胶质细胞，所述星形胶质细胞是利用上述任一项所述的培养方法体外培养得到的。

本发明的有益效果是：

本发明通过在星形胶质细胞基础培养基中添加表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，Smo蛋白激动剂Smoothened agonist(SAG)和Hh激动剂Purmorphamine。EGF为表皮生长因子，作为一种有效的细胞分裂因子，与细胞膜表面的受体有高亲和性，有利于细胞的分裂分化；FGF为成纤维细胞生长因子，与EGF作用相似，在细胞生长过程中对分裂分化的诱导有明显作用。EGF和FGF的共同作用能有效的促进星形胶质细胞在体外培养过程中的分裂分化。SAG和Purmorphamine分别可诱导小鼠培养细胞中的Hh通路活化，共同作用对与细胞体外培养的生长和稳态有重要作用。4种组分合用，可以明显的延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、并能保持星形胶质细胞原有特性。

发明人研究发现，本发明的培养基可以隔代使用，并维持星形胶质细胞传代至13代。培养至12代的星形胶质细胞纯度>95％，并能保持星形胶质细胞原有特性。

其中图3B的结果显示，使用本发明培养基隔代培养到13代的星形胶质细胞，优于对照中仅用基础培养基培养至第5代的星形胶质细胞。但是本发明的培养基也不建议连续使用。如果连续使用，仅能将星形胶质细胞培养至5-6代，如果继续培养，星形胶质细胞形态变得十分细长，呈纤维状细胞质分枝，形态类似于神经干细胞。

发明人研究发现：星形胶质细胞帖壁比较紧，而少突胶质细胞帖壁性差很多。所以采用两次消化的方法。第一次，利用酶(如胰蛋白酶)进行短时间消化，然后剧烈震荡培养瓶，使少突胶质细胞悬浮，弃去溶液。这个过程其实是起到了一个纯化的效果。第二次按照常规方法进行。通过震荡换液可以去除少突胶质细胞，保留星形胶质细胞。而且少了少突胶质细胞的干扰，星形胶质细胞的生长发育更佳，细胞总数没有明显减少，细胞生长状况较好。

附图说明

图1为震荡换液有利于星形胶质细胞纯化。

图2为EFPS条件下传代星形胶质细胞分裂旺盛。

图3为EFPS条件下星形胶质细胞继代培养次数延长。

图4为接种于实验组中的星形胶质细胞上的神经元的钙信号活动。

图5为EFPS条件下传代星形胶质细胞与神经元共培养。

图6为EFPS培养液连续培养以及间隔培养对星形胶质细胞的形态影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于此。

实施例1

一、实验方法：

1、实验材料见表1。

表1实验材料

2、主要仪器和设备见表2。

表2实验所涉及的主要仪器和设备

3、记录处理数据所用软件见表3。

表3记录处理数据所用软件

4、培养基

基础培养基包含下述组分：5％胎牛血清(FBS，v/v)，MEM+GlutaMax，1M葡萄糖，50g/L NaHCO₃，1％青霉素混合双抗(P/S，v/v)。

用于体外培养星形胶质细胞的培养基(实施例中记为星形胶质细胞的EFPS胶质细胞培养液)，包含下述组分：5％胎牛血清(FBS)，Gibco MEM无血清培养基GlutaMAX(MEM+GlutaMax)，1M葡萄糖，50g/L NaHCO₃，1％青霉素混合双抗(P/S)，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ng/ml成纤维细胞生长因子(FGF)，0.1μM SAG，0.1μM Purmorphamine。

实验步骤：

1.星形胶质细胞的原代培养

在无菌条件下取新出生1d的小鼠，用75％酒精擦拭皮肤，用眼科剪刀小心剪开头骨头，取出两侧大脑于预冷的D-Hanks液，在体视镜下剥净脑膜，除净血管，分离出大脑皮质，转移至无菌的15ml离心管内。而后，用预冷的D-Hanks液冲洗2次，按照1:100的比例加入1ml木瓜蛋白酶(1mg/ml)和10ul DNase I，用1ml枪头机械吹打1次，使组织分散，置于37℃5％CO₂培养箱消化30min。用含有5％胎牛血清和1％P/S的DMEM基础培养基漂洗2次并终止消化，轻轻吹打至无组织块，2000r/min离心5min。加入1ml含5％胎牛血清和1％P/S的DMEM，轻轻吹打至细胞分散，转移至Matrigel包被的25cm²培养瓶内5h后，轻轻摇动培养瓶，换液以除去贴壁性较低的少突胶质细胞，置于37℃5％CO₂培养箱培养，24h后轻柔换液。在倒置显微镜下观察细胞生长情况，培养8～10d，待培养瓶底部铺满胶质细胞，消化传代。

2.星形胶质细胞传代培养

用星形胶质细胞基础培养基培养。原代培养的星形胶质细胞合成单层铺满瓶底后，弃培养瓶内原培养液，DMEM漂洗2次后，2ml TrypLE消化2min，剧烈震荡培养瓶(同时设置培养瓶不震荡换液处理为对照组)，使少突胶质细胞悬浮，弃去培养瓶中溶液，用DMEM漂洗1次，加2ml TrypLE消化，待细胞变圆，约有2/3细胞漂浮时，立即加入1.5倍体积的星形胶质细胞基础培养基终止消化，转移至15ml离心管，800r/min离心5min，弃去上清液，加入少量基础培养基，吹打至细胞均匀分散，转移至已包被的培养瓶，基础培养基补足至5ml，37℃5％CO₂培养箱培养。按照此方法传代，每次传代前在倒置相差显微镜下拍照记录。细胞传至P4代开始，在原传代方法的基础上，离心，弃去上清液后，使用在基础培养基内加入10ng/mlEGF，10ng/ml FGF，0.1μM Purmorphamine，0.1μM SAG的EFPS胶质细胞培养液适量，吹打至细胞均匀分散，调整密度1x10⁶/ml转移至已包被的培养瓶内，用EFPS胶质细胞培养液补足至5ml，置于37℃5％CO₂培养箱培养，用于传代，2d后将星形胶质细胞EFPS胶质细胞培养液换成基础培养基；按密度1x10⁶接种至放有已包被的细胞爬片的24孔板中，每孔40ul，静置1min后，一组加500ulEFPS胶质细胞培养液，另一组星形胶质细胞基础培养基500ul，置于37℃5％CO₂培养箱培养，倒置相差显微镜拍照记录细胞生长状况，待细胞贴壁长满后用于染色鉴定。而后，在离心后传代用EFPS胶质细胞培养液培养细胞(即第一代使用EFPS胶质细胞培养液)，2d后换成基础培养基(即第二代使用基础培养基)，如此循环往复，每一代细胞都接种至24孔板，分别用星形胶质细胞EFPS胶质细胞培养液(隔代使用添加EFPS的胶质细胞培养液)和含有5％胎牛血清的星形胶质细胞基础培养基在37℃5％CO₂培养箱培养。

3.星形胶质细胞的鉴定

3.1星形胶质细胞免疫组化鉴定

在应激性胶质细胞中，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)丰富表达，纯化传代的细胞可通过抗GFAP抗体免疫细胞化学染色或免疫荧光染色鉴定。将本实验接种至24孔板的细胞用于免疫细胞化学染色。待细胞爬片长满后，取出细胞爬片在1xPBS(pH 7.4)洗涤标本3次，每次摇床5min，吸去液体，加4％的多聚甲醛于室温摇床固定细胞15min，再用1xPBS(pH 7.4)洗涤3次，每次摇床5min。将液体吸去，加0.05％PBST(1×PBS和吐温配制)在室温下透膜，摇床30min。加5％驴血清封闭1h，摇床。按照免疫组织化学试剂盒说明书，取出载玻片，孵育GFAP单抗(2％驴血清配制)，置于湿盒，4℃过夜，1×PBS(pH7.4)洗3次，每次摇床5min。孵育荧光二抗，置于湿盒，室温2h，1xPBS(pH 7.4)洗3次，每次摇床5min。加含DAPI封片液，封片，荧光显微镜下成像记录，统计GFAP阳性细胞比率。

3.2对神经元的支持作用

星形胶质细胞在大脑中最重要的作用就在于对神经元生长的支持作用，与神经元发生如乳酸、谷氨酸盐等的物质交换。通过这一特性，我们将至于添加了EGF、FGF、Purmo、SAG培养液中培养的胶质细胞种在铺有Matrigel包被细胞爬片的24孔板中，培养7天待胶质细胞完全铺满细胞爬片并成熟后，种入神经元(添加阿糖胞苷完全抑制取脑后带有的胶质细胞的生长)。与不种有培养的星形胶质细胞的一组对比，并用钙成像和膜片钳的方法检测神经元的钙电流和放电活动来判断对神经元的生长是否有支持作用。

4.统计学方法

所有数据都是以平均值±标准误(Mean±SEM)来表示。用one-wayANOVA test分析比较实验组和对照组的差异，当p<0.05时，数据之间具有显著性差异。

二、实验结果：

1.震荡换液促进星形胶质细胞的纯化

采用不同的培养基对小鼠的胶质细胞进行培养，将星形胶质细胞基础培养基作为对照组(control)，含有四种生长因子(或称小分子)的星形胶质细胞的EFPS胶质细胞培养液作为实验组，分别对小鼠的星形胶质细胞进行传代培养。用同一只新生小鼠的两边大脑皮层进行原代培养(P0)，将P0代细胞传至两个培养瓶中(P1)。结果见图1。

结果显示：对P2的星形胶质细胞培养3DIV(Days in vitro)免疫细胞化学染色表明，可见杂质细胞减少，其中少突胶质细胞为主要杂质细胞，结果见图1。少突胶质细胞胞体呈圆形或较小多边形，从胞体伸出细小纤维状的主要分支，分枝沿胞体向四周发散(图1A，绿色，O4)。而星形胶质细胞平铺在底部，展现扁平，海绵状，伸展的形态，并伸出网络状的众多分支(图1A，红色，GFAP)，但在融合的体外细胞培养中一般其众多的分枝的突起(Finelybranching processes)与众多中间纤维不明显。在不震荡换液组(仅按照第二步消化的方法处理)中(图1A)中，O4⁺阳性的细胞(少突胶质细胞)明显较经过震荡换液组多(图1A)，且DAPI⁺阳性的细胞(DAPI标记细胞核，其结果可以反应细胞的总数)显示两者细胞总数相近，表明震荡不会导致细胞数目的显著下降。

统计表明，不经过震荡换液P2培养中，星形胶质细胞占比～72％，少突胶质细胞占比～19％；震荡换液P2培养中，星形胶质细胞～97％，少突胶质细胞占比～1％(图1A，n＝12，p<0.05，n表示从4只小鼠培养中随机选取12个视野)。P2培养中DAPI⁺的细胞可能还存在极少数的小胶质细胞或多功能干细胞等。明场观察可见，不震荡换液的星形胶质细胞培养中，少突胶质细胞在P1-P3中均明显存在，但是通过震荡换液的星形胶质细胞培养，P2视野可见基本为健康的星形胶质细胞(图3)。图1的B和C为柱状图，B图显示不震荡组的GFAP⁺的细胞占约76％，震荡组GFAP⁺的细胞占约98％。C图显示不震荡组O4⁺细胞占约20％，震荡组O4⁺细胞占约2％。

2.EFPS胶质细胞培养条件促进细胞分裂分化

接着利用细胞免疫荧光染色的方法对实验组的细胞进行鉴定，以确定在实验组的条件下仍保持星形胶质细胞的特性。

结果显示：EFPS胶质细胞培养液培养的星形胶质细胞分裂和分化活动旺盛(图2)。Ki67标记分裂细胞的细胞核(图2A，绿色)，GFAP标记星形胶质细胞细胞骨架(图2A，红色)，DAPI标记全部细胞核(图2A，蓝色)。对于P4 2DIV星形胶质细胞培养中，对照组(Control)分裂期的细胞占比～15％；实验组(EFPS)分裂期的细胞占比～38％(图2B，n＝17，p<0.05，n表示从4只小鼠大脑皮层星形胶质细胞培养染色中随机选取12个视野)，明显在EFPS胶质细胞培养液中细胞生长更加旺盛，细胞分裂分化活力更佳。通过免疫荧光染色可见，EFPS培养条件下，细胞的总数明显较对照组多，我们通过对DAPI⁺细胞进行统计，得到在对照条件下，DAPI⁺细胞～494个，在EFPS培养条件下DAPI⁺细胞～695个(图2C，n＝17，p<0.05，n表示从4只小鼠大脑皮层星形胶质细胞培养染色中随机选取12个视野)。结果显示，利用EFPS胶质细胞培养液获得的胶质细胞比对照基础培养基培养条件下的胶质细胞数增加了40％。

3.EFPS胶质细胞培养条件增加星形胶质细胞传代次数

在明场下观察记录星形胶质细胞的形态与细胞是否能够形成至少80％融合的细胞单层，由此判断是否对细胞继续传代。

结果显示：单一使用星形胶质细胞基础培养基对传代星形胶质细胞培养，细胞传代至P4(图3Control对照)细胞形成融合单层；在P5不能形成融合单层，不再继续传代。通过EFPS胶质细胞培养液与星形胶质细胞基础培养基轮流培养的细胞可以传代至P12(图3A中EFPS的P1-P12小图分别表示不同代的细胞图)，细胞在12mm小圆片培养能形成至少80％融合的星形胶质细胞的细胞单层(图3A)；在P13不能形成融合单层，不再继续传代。明显可见实验组(图3EFPS)细胞从P5开始，能明显观察到部分星形胶质细胞展现细长纤维状分枝。Control中P5代细胞和EFPS中P13代细胞分散，细胞间间隙较大，部分细胞接种至12mm小圆片后不能分化出星形胶质细胞的形态，呈现圆形或不规则立体多边形(图片3B，箭头)，不能形成80％融合的细胞单层，不具有继续传代的能力(图3B)。对10只小鼠大脑皮层星形胶质细胞传代次数进行统计分析(图3C)，对照组传代次数～4.8代，EFPS传代次数～10.5代，其中60％培养能传代至P12或以上(n＝10，p<0.05，n表示10只小鼠大脑皮层星形胶质细胞培养)。

4.EFPS培养液培养星形胶质细胞支持神经元生长

通过钙成像和膜片钳的方法，记录与EFPS条件传代所得的星形胶质细胞共培养海马神经元的生长。

结果表明：P12继代培养的星形胶质细胞能在4d内达到80％的融合，并能基本铺满小圆片。分别记录两个共培养14DIV的海马神经元(图4A,B,C)，产生动作电位，能得到神经元的自发兴奋性突触后电流(Spontaneous excitatory postsynaptic current,sEPSC)。钙成像同时记录的6个神经元，神经元产生即保持神经元固有属性，产生自发放，又密切连接形成网络，有同步活动的产生(图4D,E)。将P12继代培养的星形胶质细胞与神经元共培养14DIV，免疫细胞化学的染色结果也表明(图5)，继代培养的星形胶质细胞支持的神经元突触结构呈Synapsin⁺，能正常形成与突触结构。Synapsin标记包被突触囊泡的神经元磷酸蛋白。共培养的神经元活力较高，表明在EFPS胶质细胞培养液培养的传代星形胶质细胞能很好的和神经元之间形成联系，支持神经元的正常活动与突触结构的形成。

综上所述，本发明通过在星形胶质细胞培养液中添加表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，SAG和Purmorphamine，可以明显的延长星形胶质细胞体外培养时间、增加传代次数、提高纯度、并能保持星形胶质细胞原有特性。

对比例1

按照同样的配方(同实施例1)，将星形胶质细胞连续至于EFPS胶质细胞培养液中培养。即每一代均用添加有表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，Smo蛋白激动剂Smoothened agonist和Hh激动剂Purmorphamine的EFPS胶质细胞培养液进行星形胶质细胞培养。

结果显示：将细胞连续置于EFPS培养液中培养，第5-6代时，星形胶质细胞形态变得十分细长，呈纤维状细胞质分枝，形态类似于神经干细胞，难以正常支持神经元的生长(图6)。而相应的，图6中左图为连续在EFPS条件下培养，右图间隔培养，间隔培养时星形胶质细胞传代至6仍保持较好的星形胶质细胞的形态。

对比例2

同实施例1，不同之处在于EFPS胶质细胞培养液中EGF的浓度为30ng/ml、FGF浓度为30ng/ml。

结果显示，培养至第5代时，培养的星形胶质细胞形态变化较大，细胞形态细长，难以铺满培养瓶底部，效果稍差。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于体外培养星形胶质细胞的培养基，其特征在于：所述培养基是在基础培养基的基础上添加表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、Smo蛋白激动剂Smoothened agonist和Hh激动剂Purmorphamine。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基中，表皮生长因子的浓度为5-200ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为5-200ng/ml，Smo蛋白激动剂Smoothenedagonist的浓度为0.05-1μM，Hh激动剂Purmorphamine的浓度为0.05-1μM。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述培养基中，表皮生长因子的浓度为10-20ng/ml，成纤维细胞生长因子的浓度为10-20ng/ml，Smo蛋白激动剂Smoothenedagonist的浓度为0.05-1μM，Hh激动剂Purmorphamine的浓度为0.05-1μM。

4.根据权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于：所述基础培养基中包含有下述组分：5％v/v胎牛血清，Gibco MEM无血清培养基GlutaMAX，1M葡萄糖，50g/L NaHCO₃，1％v/v青霉素混合盘尼西林双抗。

5.一种用于体外培养星形胶质细胞的培养方法，其特征在于：利用权利要求1-4任一项所述的培养基隔代替代基础培养基对星形胶质细胞进行体外培养。

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于：培养中每次传代时，用酶液对细胞消化2-5min后，震荡培养器皿，弃去溶液；然后再加入酶液消化得到星形胶质细胞进行传代。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：震荡时需剧烈震荡。

8.一种体外培养的星形胶质细胞，其特征在于：所述星形胶质细胞是利用权利要求1-4任一项所述的培养基进行隔代体外培养得到的。

9.一种体外培养的星形胶质细胞，其特征在于：所述星形胶质细胞是利用权利要求5-7任一项所述的培养方法体外培养得到的。