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CN108841809A - 具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用 - Google Patents

具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用 Download PDF

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CN108841809A
CN108841809A CN201810812153.4A CN201810812153A CN108841809A CN 108841809 A CN108841809 A CN 108841809A CN 201810812153 A CN201810812153 A CN 201810812153A CN 108841809 A CN108841809 A CN 108841809A
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China
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amylase
gly
thr
tyr
ala
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Application number
CN201810812153.4A
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姚斌
罗会颖
邱锦
涂涛
黄火清
王苑
王亚茹
柏映国
苏小运
孟昆
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Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
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Publication date
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型淀粉酶进行S33A/S34E/V35H点突变，并去除178和179位氨基酸，从而获得所述淀粉酶突变体。本发明的淀粉酶突变体与野生型淀粉酶相比，具有如下性状：1)淀粉酶酶活性增强；2)淀粉酶热稳定性增强。

Description

具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用。
背景技术
淀粉酶，又称为1，4-α-D-葡聚糖水解酶，EC号为EC3.2.1.1.，是可以水解淀粉内部的α-1,4-糖苷键的酶。被广泛的应用于食品、医药、饲料、纺织等工业中。
目前，工业化生产淀粉酶的菌株主要来源于芽孢杆菌。传统生产淀粉酶的方法主要集中于利用紫外诱变或者化学诱变剂诱变的方法获得高产菌株，并对菌株培养的发酵条件进行优化以进一步提高菌株的产酶能力。但是，芽孢杆菌的发酵过程相对复杂、并伴随有产量较低、发酵产物不均一等特点，给后期加工工艺带来了困扰。因此，选择利用基因工程手段来改良和提高淀粉酶的生产。尽管利用基因工程的手段实现了淀粉酶的异源表达，由于表达量不高导致生产成本突出的问题仍然没有得到有效解决，阻碍了淀粉酶的大规模工业化生产及应用。所以，利用蛋白质工程的手段对淀粉酶进行分子改良以提高其催化性能。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种以来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的淀粉酶作为母本经点突变获得的突变体。
本发明的再一目的是提供编码上述突变体的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。
根据本发明的具体实施方式，对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型淀粉酶进行定点突变。
SEQ ID No.1
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLSSVGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAVEVNPSNRNQETSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKFRGTGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADIDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHIKFSFLKDWVDNARAATGKEMFTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAASTGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKAVTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKIEPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTREGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEIWYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPVNGGSVSVWVQQ*
根据本发明的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型淀粉酶进行以下点突变，S33A/S34E/V35H，并去除178和179位氨基酸，从而获得淀粉酶突变体。
根据本发明的具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2：
AATNGTMMQYFEWYVPNDGQQWNRLRTDAPYLAEHGITAVWTPPAYKGTSQADVGYGPYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKGELKSAVNTLHSNGIQVYGDVVMNHKAGADYTENVTAVEVNPSNRNQETSGEYNIQAWTGFNFPGRGTTYSNFKWQWFHFDGTDWDQSRSLSRIFKFTGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADIDYDHPDVVNEMKKWGVWYANEVGLDGYRLDAVKHIKFSFLKDWVDNARAATGKEMFTVGEYWQNDLGALNNYLAKVNYNQSLFDAPLHYNFYAASTGGGYYDMRNILNNTLVASNPTKAVTLVENHDTQPGQSLESTVQPWFKPLAYAFILTRSGGYPSVFYGDMYGTKGTTTREIPALKSKIEPLLKARKDYAYGTQRDYIDNPDVIGWTREGDSTKAKSGLATVITDGPGGSKRMYVGTSNAGEIWYDLTGNRTDKITIGSDGYATFPVNGGSVSVWVQQ*
根据本发明的具体实施方式，还提供了编码上述具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体的基因。
根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述淀粉酶突变体基因的重组载体，所述重组表达载体的出发载体具体为pHYP16。
根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述淀粉酶突变体基因的重组菌株，所述重组菌的出发菌株具体为SCK6。
所述重组表达载体具体为pHYP16-BKAMY；所述重组菌具体为SCK6/BKAMY。
根据本发明的制备具有高比活及热稳定性的淀粉酶的方法，包括以下步骤：
1)制备包含上述突变体基因的重组载体；
2)以所述重组载体转化宿主；
3)发酵培养所述宿主，并分离淀粉酶。
本发明的淀粉酶突变体与野生型淀粉酶相比，具有如下性状：1)淀粉酶酶活性增强；2)淀粉酶热稳定性增强。
本发明提供了上述具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体的应用，具体可以应用于食品、医药、动物饲料和/或纺织行业领域中。
本发明克服了现有技术的不足，提供了一种高酶活力与优热稳定性的、适合于在食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的淀粉酶突变体。本发明提供的突变酶酶活力由野生型的5553.53U/mg提高到了17067.57U/mg；70℃处理5min，突变体S33A/S34E/V35H/ΔR178/G179仍有99％以上酶活，野生型剩余酶活10％左右；80℃处理5min后，S33A/S34E/V35H/ΔR178/ΔG179剩余32％酶活，野生型几乎无酶活。因此，本发明提供的淀粉酶突变体淀粉酶能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。
附图说明
图1显示野生型淀粉酶的酶学性质；
图2显示野生型淀粉酶及突变体的热稳定性比较；
图3显示淀粉酶在枯草芽孢杆菌SCK6中表达后的SDS-PAGE电泳检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主Bacillus subtilisSCK6，表达质粒载体pHYP16-BKAMY。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司。
3、培养基：LB培养基；淀粉培养基。
本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1、淀粉酶编码基因的定点突变
经优化突变位点设计为S33A/S34E/V35H/ΔR178/ΔG179，通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得突变基因淀粉酶。所用引物如表1所示：
表1.突变体淀粉酶特异性引物
测序结果表明，上述点突变扩增得到具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，共1458bp，其中编码区长1455bp，该编码区序列如序列表中SEQ ID No：1中第1-1455位核苷酸所示，编码序列表中SEQ ID No：2所示的氨基酸序列，共485个氨基酸残基。将该具有序列表中SEQ ID No：1中第33-35及178-179位的核苷酸序列的片段命名为突变体基因BKAMYA；将具有序列表中SEQ ID No：2所示氨基酸序列的蛋白命名为淀粉酶突变体BKAMYA。
实施例2淀粉酶突变体BKAMYA的制备
(一)重组质粒pHYP16-BKAYA的制备
利用POE-PCR方法，首先分别扩增得到载体及目的片段，将二者回收后，按合适的比例混合，加入PCR体系中进行构建，获得含有所述淀粉酶基因的重组质粒。以构建好的野生型质粒作为模板，利用点突变试剂盒引入突变碱基，将上述所得重组质粒送去测序，验证序列的正确性。将所得质粒中插入的外源基因的序列为SEQ ID No：1第1-1455位核苷酸的重组质粒，命名为pHYP16-BKAMYA。
(二)重组菌SCK6/BKAMYA的制备
将重组质粒pHYP16-BKAMYA转化芽孢杆菌SCK6细胞，获得重组菌株SCK6/BKAMYA。
(三)淀粉酶突变体淀粉酶的制备
取上述重组芽孢菌株SCK6/BKAMYA菌株，接种于50mL培养基的100mL三角瓶中，置于37℃，220rpm摇床培养24h；后将培养液转接于200mL培养基的1L三角瓶中，并再次置于37℃，220rpm条件下培养。离心后收集上清回收和亲和层析纯化淀粉酶突变体BKAMYA，用于酶活性检测。
实施例3淀粉酶突变体BKAMYA和野生型的性质分析比较
(一)酶活分析比较
采用紫外分光光度计法对淀粉酶酶活进行测定。具体方法如下：在给定条件下进行酶促反应，酶促反应体系为：1mL的反应体系，包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，在一定温度及pH条件下反应20min。在540nm波长处测定吸光度值，计算酶活。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，单位时间内生成1μmol的葡萄糖所需的酶量。
将上述实施例2制备的淀粉酶突变体淀粉酶纯化后，与野生型淀粉酶在pH 7.0、55℃下进行酶促反应以测定其酶活性。
酶活测定结果如图1所示，野生型的酶淀粉酶活力为5553.53U/mg，淀粉酶突变体的酶活力为17067.57U/mg。
(二)热稳定性分析比较
将上述实施例2制备的淀粉酶突变体淀粉酶纯化后，与野生型淀粉酶一同，测定在60℃或70℃下的热稳定性，测定方法如下：
所述突变体和野生型的热稳定性测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)缓冲液体系不同温度(60℃或70℃)下处理不同时间(60℃下分别处理10、30、60min；70℃下分别处理2、5、10min)，再在55℃下进行剩余酶活性测定。
如图2所示，70℃处理5min，突变体S33A/S34E/V35H/ΔR178/G179仍有99％以上酶活，野生型剩余酶活10％左右；80℃处理5min后，S33A/S34E/V35H/ΔR178/ΔG179剩余32％酶活，野生型几乎无酶活。同时此突变体的比活较野生型相比也有所提高，S33A/S34E/V35H/ΔR178/ΔG179比活为17067.57U/mg。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 485
<212> PRT
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
Ala Ala Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Val Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln Gln Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Pro Tyr Leu
20 25 30
Ser Ser Val Gly Ile Thr Ala Val Trp Thr Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Lys Ser Ala Val Asn Thr Leu His Ser Asn Gly Ile Gln
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Tyr Thr
100 105 110
Glu Asn Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn Gln Glu
115 120 125
Thr Ser Gly Glu Tyr Asn Ile Gln Ala Trp Thr Gly Phe Asn Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Thr Thr Tyr Ser Asn Phe Lys Trp Gln Trp Phe His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Ser Leu Ser Arg Ile Phe Lys
165 170 175
Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn
180 185 190
Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro
195 200 205
Asp Val Val Asn Glu Met Lys Lys Trp Gly Val Trp Tyr Ala Asn Glu
210 215 220
Val Gly Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe
225 230 235 240
Ser Phe Leu Lys Asp Trp Val Asp Asn Ala Arg Ala Ala Thr Gly Lys
245 250 255
Glu Met Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu
260 265 270
Asn Asn Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Leu Phe Asp Ala
275 280 285
Pro Leu His Tyr Asn Phe Tyr Ala Ala Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Tyr
290 295 300
Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Asn Thr Leu Val Ala Ser Asn Pro Thr
305 310 315 320
Lys Ala Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser
325 330 335
Leu Glu Ser Thr Val Gln Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe
340 345 350
Ile Leu Thr Arg Ser Gly Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Met
355 360 365
Tyr Gly Thr Lys Gly Thr Thr Thr Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Glu Pro Leu Leu Lys Ala Arg Lys Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln Arg Asp Tyr Ile Asp Asn Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asp Ser Thr Lys Ala Lys Ser Gly Leu Ala Thr Val Ile Thr Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Val Gly Thr Ser Asn Ala Gly
435 440 445
Glu Ile Trp Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Thr Asp Lys Ile Thr Ile
450 455 460
Gly Ser Asp Gly Tyr Ala Thr Phe Pro Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Val Trp Val Gln Gln
485
<210> 2
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Ala Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Val Pro
1 5 10 15
Asn Asp Gly Gln Gln Trp Asn Arg Leu Arg Thr Asp Ala Pro Tyr Leu
20 25 30
Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Thr Pro Pro Ala Tyr Lys Gly
35 40 45
Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu
50 55 60
Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys
65 70 75 80
Gly Glu Leu Lys Ser Ala Val Asn Thr Leu His Ser Asn Gly Ile Gln
85 90 95
Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Tyr Thr
100 105 110
Glu Asn Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asn Arg Asn Gln Glu
115 120 125
Thr Ser Gly Glu Tyr Asn Ile Gln Ala Trp Thr Gly Phe Asn Phe Pro
130 135 140
Gly Arg Gly Thr Thr Tyr Ser Asn Phe Lys Trp Gln Trp Phe His Phe
145 150 155 160
Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Ser Leu Ser Arg Ile Phe Lys
165 170 175
Phe Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val
195 200 205
Val Asn Glu Met Lys Lys Trp Gly Val Trp Tyr Ala Asn Glu Val Gly
210 215 220
Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe
225 230 235 240
Leu Lys Asp Trp Val Asp Asn Ala Arg Ala Ala Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Asn Asn
260 265 270
Tyr Leu Ala Lys Val Asn Tyr Asn Gln Ser Leu Phe Asp Ala Pro Leu
275 280 285
His Tyr Asn Phe Tyr Ala Ala Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Asn Ile Leu Asn Asn Thr Leu Val Ala Ser Asn Pro Thr Lys Ala
305 310 315 320
Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Ser Gly Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Thr Thr Thr Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Leu Leu Lys Ala Arg Lys Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln Arg
385 390 395 400
Asp Tyr Ile Asp Asn Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Thr Lys Ala Lys Ser Gly Leu Ala Thr Val Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Val Gly Thr Ser Asn Ala Gly Glu Ile
435 440 445
Trp Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Thr Asp Lys Ile Thr Ile Gly Ser
450 455 460
Asp Gly Tyr Ala Thr Phe Pro Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Gln Gln

Claims (7)

1.具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的野生型淀粉酶进行S33A/S34E/V35H点突变，并去除178和179位氨基酸，从而获得所述淀粉酶突变体。
2.一种淀粉酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体。
3.包含权利要求2所述的淀粉酶突变体基因的重组载体。
4.包含权利要求2所述的淀粉酶突变体基因的重组菌株。
5.一种制备具有高比活及热稳定性的淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)制备包含权利要求2所述的淀粉酶突变体基因的重组载体；
2)以步骤1)所得重组载体转化宿主细胞；
3)发酵培养所述宿主细胞，并分离淀粉酶。
6.权利要求1所述具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体的应用。
7.权利要求2所述淀粉酶突变体基因的应用。
CN201810812153.4A 2018-03-21 2018-07-23 具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用 Pending CN108841809A (zh)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109810961A (zh) * 2019-03-20 2019-05-28 中粮集团有限公司 用于高浓度淀粉液化的a-淀粉酶突变体及其编码基因和它们的应用
CN109897842A (zh) * 2019-03-25 2019-06-18 中国农业科学院饲料研究所 淀粉酶突变体zdamya及其编码基因和应用
WO2019179485A1 (zh) * 2018-03-21 2019-09-26 中国农业科学院饲料研究所 具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118207187B (zh) * 2024-05-22 2024-08-30 潍坊康地恩生物科技有限公司 高比活淀粉酶突变体

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484441A (zh) * 2013-09-17 2014-01-01 江南大学 一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用
US20150152401A1 (en) * 2012-06-08 2015-06-04 Danisco Us Inc. Alpha amylase variants derived from the alpha amylase of cytophaga sp. amylase (cspamy2)
CN105209614A (zh) * 2013-05-17 2015-12-30 诺维信公司 具有α淀粉酶活性的多肽
CN105229148A (zh) * 2013-03-11 2016-01-06 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶组合变体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887986B1 (en) * 1998-11-16 2005-05-03 Novozymes A/S α-amylase variants
CN108841809A (zh) * 2018-03-21 2018-11-20 中国农业科学院饲料研究所 具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150152401A1 (en) * 2012-06-08 2015-06-04 Danisco Us Inc. Alpha amylase variants derived from the alpha amylase of cytophaga sp. amylase (cspamy2)
CN105229148A (zh) * 2013-03-11 2016-01-06 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶组合变体
CN105209614A (zh) * 2013-05-17 2015-12-30 诺维信公司 具有α淀粉酶活性的多肽
CN103484441A (zh) * 2013-09-17 2014-01-01 江南大学 一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHII-LING JEANG ET AL.: ""Cloning of a Gene Encoding Raw-Starch-Digesting Amylase from a Cytophaga sp. and Its Expression in Escherichia coli"", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
JEANG,C.L. ET AL.: ""Cytophaga sp. raw starch digesting amylase precursor, gene, complete cds"，Accession Number：AF067653.1", 《GENBANK》 *
RONG-JEN SHIAU ET AL.: ""Improving the Thermostability of Raw-Starch-Digesting Amylase from a Cytophaga sp. by Site-Directed Mutagenesis"", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
邱锦: ""中温淀粉酶的热稳定性及水解活性改良研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019179485A1 (zh) * 2018-03-21 2019-09-26 中国农业科学院饲料研究所 具有高比活及热稳定性的淀粉酶突变体及其基因和应用
CN109810961A (zh) * 2019-03-20 2019-05-28 中粮集团有限公司 用于高浓度淀粉液化的a-淀粉酶突变体及其编码基因和它们的应用
CN109897842A (zh) * 2019-03-25 2019-06-18 中国农业科学院饲料研究所 淀粉酶突变体zdamya及其编码基因和应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

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