CN108841785A - 脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法。该脂肪组织消化液由I型胶原酶、HEPES缓冲液和DMEM/F12培养基组成。本发明提供的脂肪组织消化液可使消化体系能够稳定维持在pH6.8～8.2之间，使I型胶原酶活性达到最佳，从而实现短时间消化完全。传统消化方案得到的SVF耗时40min，而采用本发明消化液对脂肪组织进行消化，可以在15～20min内获得高质量和数量的SVF。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法。
背景技术
难愈性创面在外科疾病中是常见病，具有病程长、并发症多、对外观影响大的特点，近年来有逐年增多的趋势，成为严重影响患者生活质量的因素。如何促进难愈性创面愈合是一直被探索的问题，然而到目前为止仍没有一种理想的方法。间充质干细胞(MSCs)被首次发现存在于骨髓中，它是一种具有多向分化潜能的细胞，具有促进组织再生的潜能。MSCs能通过促进局部组织的血管形成及组织再生从而加速创面的愈合。但是由于骨髓中的MSCs含量较低而且提取困难而限制了骨髓来源的MSCs在临床中的应用。近期的研究发现脂肪组织中也存在着大量的MSCs，而脂肪组织具有来源丰富、获取对组织损伤小的特点。而且脂肪中的干细胞含量、细胞的扩张及增殖能力都明显优于骨髓组织。
基质血管成分细胞(SVF)是从脂肪抽吸的颗粒中发现的含有脂肪源性的再生细胞，其中有30％以上为脂肪源性干细胞。SVF是脂肪组织通过消化、过滤、离心去除成熟的脂肪细胞后得到的。2001年Zuk首次发现SVF包含多种细胞成分，包括MSCs、内皮前体细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等成分，而且可以诱导分化为成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等。
近期的研究认为SVF可以通过分化成血管内皮细胞、分泌促血管形成及抗凋亡的生长因子等多方面来促进难愈性创面的愈合。在移植脂肪的过程中添加SVF，发现它的作用非常可观：能提升脂肪细胞的成活率，而且它还能明显改善皮肤质地，对移植部位有很好的修复作用，同时缓解敏感。
目前获得SVF的常规方法是采用一定浓度的I型胶原酶恒温震荡消化。常规的分离方法采用终浓度0.25％的I型胶原酶消化需要约40min得到SVF。每毫升脂肪通过胶原酶的消化可获得1.0～2.5×105的SVF，活率在70％～85％。可见常规获取基质血管成分细胞的时间较长，且活率较低。因此，需要提供一种消化时间更短、细胞活率更高的消化方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法。该方法可快速获得基质血管成分细胞，将时间缩短至15～20min，同时细胞活率也得到了显著提高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脂肪组织消化液，由I型胶原酶、HEPES缓冲液和DMEM/F12培养基组成。
传统的消化方法中并未关注消化过程中体系pH的变动，本研究发现常规方法中I型胶原酶并不是处于最佳pH环境，所以得到SVF时长较长。本发明方法在消化体系中添加HEPES缓冲液的缓冲体系，使消化体系能够稳定维持在pH6.8～8.2之间，使I型胶原酶活性达到最佳，从而实现短时间消化完全。传统消化方案得到的SVF耗时40min，而本发明添加有额外缓冲成分的消化方案可以在15～20min内获得高质量和数量的SVF。
作为优选，消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶：0.1wt％～0.3wt％；
HEPES缓冲液：1～30mM；
DMEM/F12培养基：补足。
优选地，消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶：0.25wt％；
HEPES缓冲液：5～25mM；
DMEM/F12培养基：补足。
优选地，消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶：0.25wt％；
HEPES缓冲液：10～25mM；
DMEM/F12培养基：补足。
更优选地，消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶：0.25wt％；
HEPES缓冲液：20mM；
DMEM/F12培养基：补足。
更优选地，消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶：0.25wt％；
HEPES缓冲液：25mM；
DMEM/F12培养基：补足。
本发明还提供了一种快速获得基质血管成分细胞的方法，包括如下步骤：
采用本发明提供的消化液消化脂肪组织，获得基质血管成分细胞；该消化液，由I型胶原酶、HEPES缓冲液和DMEM/F12培养基组成。
作为优选，消化的温度为36～38℃。
在本发明提供的实施例中，消化的温度为37℃。
作为优选，消化的转速为100～200rpm。
在本发明提供的实施例中，消化的转速为150rpm。
作为优选，消化的时间为15～25min。
在本发明提供的实施例中，消化的时间为20min。
在本发明提供的实施例中，消化后还包括离心终止消化、清洗的步骤。
本发明提供了脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法。该脂肪组织消化液由I型胶原酶、HEPES缓冲液和DMEM/F12培养基组成。本发明具有如下优势之一：
1、本发明提供的脂肪组织消化液可使消化体系能够稳定维持在pH6.8～8.2之间，使I型胶原酶活性达到最佳，从而实现短时间消化完全。传统消化方案得到的SVF耗时40min，而采用本发明消化液对脂肪组织进行消化，可以在15～20min内获得高质量和数量的SVF。试验结果显示，采用本发明消化液对脂肪组织进行消化获得的SVF活率在85％以上。
2、本发明消化液配方简单，适合工业化生产。
附图说明
图1示各细胞表面标记表达情况；
图2示细胞成脂染色效果。
具体实施方式
本发明公开了脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
脂肪组织(adipose tissue)：主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶。脂肪组织中的网状纤维很发达。黄(白)色脂肪组织呈黄色(在某些哺乳动物呈白色)，即通常所说的脂肪组织。它由大量单泡脂肪细胞集聚而成，脂肪细胞呈圆形或多边形，细胞中央有一大脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴。在HE切片上，脂滴被溶解成一大空泡。胞核扁圆形，被脂滴推挤到细胞一侧，连同部分胞质呈新月形。黄色脂肪组织主要分布在皮下组织、网膜和肠系膜等处，在成年男子一般约占体重的10％～20％，女人往往更多一些。体内最大的“能源库”。具有贮存脂肪、保持体温和参与脂肪代谢的功能。参与能量代谢，并具有产生热量、维持体温、缓冲保护和支持填充等作用。棕色脂肪组织呈棕色，其特点是组织中有丰富的毛细血管，脂肪细胞内散在许多小脂滴，线粒体大而丰富，核圆形，位于细胞中央。这种脂肪细胞称为多泡脂肪细胞。
基质血管成分细胞(SVF)：脂肪组织主要由脂肪细胞、ASCs、血管内皮细胞、周细胞、成纤维细胞、巨嚼细胞和细胞外基质组成。每立方厘米体积的脂肪组织中，包括有1×106个脂肪细胞、1×106个ASCs、1×106个血管内皮细胞和(1～2)×106个其他细胞(如血液来源的细胞)自体脂肪组织为组织工程和再生医学的研究及应用提供了丰富的基质干细胞来源。研究者现已通过酶消化的方法，从腹壁整形术或吸脂术废弃的脂肪组织中分离提取基质血管成分细胞(StromalVascular Fraction Cells,SVF)。SVF是一个脂肪来源干细胞与其他细胞成分相混杂的群体，经过体外贴壁培养后可获得较纯的脂肪来源基质/干细胞(adipose-derived stromal/stemcells，ASCs)。
磷酸盐缓冲液：PBS，全称Phosphate Buffered Saline。在医学词汇中表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养，pH＝7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。
胶原酶：在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质，因此，这对温度、pH和导致蛋白质变性的各种因素均非常敏感，极易受到外界条件的影响而改变其本身的构象和性质。胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动细胞的分离，其最适pH为6.3～8.8。
DMEM/F12培养基：F12培养基成分丰富，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基(DME/F12medium)，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。
HEPES缓冲液：对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。
以下实施例中％表示质量百分含量。
本发明提供的脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、本实施例消化配方为：
I型胶原酶：0.25％；
HEPES缓冲液：5mM；
DMEM/F12培养基：补足。
上述原料皆为无菌。
2、消化方法：
清洗脂肪组织直至无肉眼可见红细胞，剪碎至30立方毫米左右，采用上述消化液进行消化，消化20min，37℃，150rpm震荡。
实施例2
1、本实施例消化配方为：
I型胶原酶：0.25％；
HEPES缓冲液：10mM；
DMEM/F12培养基：补足。
上述原料皆为无菌。
2、消化方法：
清洗脂肪组织直至无肉眼可见红细胞，剪碎至30立方毫米左右，采用上述消化液进行消化，消化20min，37℃，150rpm震荡。
实施例3
1、本实施例消化配方为：
I型胶原酶：0.25％；
HEPES缓冲液：15mM；
DMEM/F12培养基：补足。
上述原料皆为无菌。
2、消化方法：
清洗脂肪组织直至无肉眼可见红细胞剪碎至30立方毫米左右，采用上述消化液进行消化，消化20min，37℃，150rpm震荡。
实施例4
1、本实施例消化配方为：
I型胶原酶：0.25％；
HEPES缓冲液：20mM；
DMEM/F12培养基：补足。
上述原料皆为无菌。
2、消化方法：
清洗脂肪组织直至无肉眼可见红细胞，剪碎至30立方毫米左右，采用上述消化液进行消化，消化20min，37℃，150rpm震荡。
实施例5
1、本实施例消化配方为：
I型胶原酶：0.25％；
HEPES缓冲液：25mM；
DMEM/F12培养基：补足。
上述原料皆为无菌。
2、消化方法：
清洗脂肪组织直至无肉眼可见红细胞，剪碎至30立方毫米左右，采用上述消化液进行消化，消化20min，37℃，150rpm震荡。
对比例1
传统的消化方法：终浓度0.25％I型胶原酶(含0.25％I型胶原酶的PBS溶液)消化40min，37℃，150rpm震荡。
对比例2
传统的消化方法：终浓度0.25％I型胶原酶(含0.25％I型胶原酶的PBS溶液)消化20min，37℃，150rpm震荡。
对比例3
本对比例消化配方为：
I型胶原酶：0.25％；
DMEM/F12培养基：补足。
上述原料皆为无菌。
2、消化方法：
清洗脂肪组织直至无肉眼可见红细胞，采用上述消化液进行消化，消化20min，37℃，150rpm震荡。
试验例1消化试验
采集脂肪组织(均经过志愿者授权同意，年龄20～30岁，无传染性疾病)，生理盐水清洗后用终浓度0.25％的上述实施例1-5和对比例1-3配方在37℃、150rpm震荡下消化20min或40min，后离心终止消化，仅留底部细胞，生理盐水清洗后得到SVF，检测SVF活率和数量。试验结果见表1：
表1 SVF活率和数量
可见：在SVF获取量上本发明实施例1-5配方明显优于对比例1-3配方；在SVF活率上，实施例1-5配方也明显优于对比例1-3配方。
试验例2 SVF培养试验
试验例1中各组消化得到的SVF，各取5.0×105SVF接种在一个10cm皿，加入10mLDMEM/F12+10％FBS培养基，于5％CO2、37℃培养箱培养，每2天换液(于第3、5天时换液)，每天观察细胞汇合度，记录汇合度变化趋势。试验结果见表2：
表2 SVF汇合度变化趋势
可见，本发明实施例1-5配方获得的SVF的增殖能力明显优于对比例1-3配方获得的SVF。
试验例3 SVF培养后脂肪干细胞免疫表型分析
取实施例1-5和对比例1-3消化液消化得到的SVF第3代细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。试验结果见表3、图1：
表3细胞表面标记表达情况
上述检测结果表明该细胞是脂肪间充质干细胞。
试验例4体外向脂肪细胞诱导分化检测
取实施例1-5和对比例1-3消化液消化得到的SVF第3代细胞，按2.5×104细胞浓度接种于含有DMEM/F12+20％FBS培养基的24孔板中，至细胞80％融合时，更换为含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培养液，每周换液2次，3周后用多聚甲醛固定，油红O染色。成脂效果如图2所示，可见清晰被染色脂滴，证明细胞具有成脂分化能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种脂肪组织消化液，其特征在于，由I型胶原酶、HEPES缓冲液和DMEM/F12培养基组成。
2.根据权利要求1所述的消化液，其特征在于，所述消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶： 0.1wt％～0.3wt％；
HEPES缓冲液： 1～30mM；
DMEM/F12培养基： 补足。
3.根据权利要求1所述的消化液，其特征在于，所述消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶： 0.25wt％；
HEPES缓冲液： 5～25mM；
DMEM/F12培养基： 补足。
4.根据权利要求1所述的消化液，其特征在于，所述消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶： 0.25wt％；
HEPES缓冲液： 10～25mM；
DMEM/F12培养基： 补足。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的消化液，其特征在于，所述消化液中各组分的用量为：
I型胶原酶： 0.25wt％；
HEPES缓冲液： 20mM；
DMEM/F12培养基： 补足。
6.一种快速获得基质血管成分细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用如权利要求1至5中任一项所述消化液消化脂肪组织，获得基质血管成分细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述消化的温度为36～38℃。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述消化的转速为100～200rpm。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述消化的时间为15～25min。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述消化后还包括离心终止消化、清洗的步骤。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019237812A1 (zh) * | 2018-06-15 | 2019-12-19 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法 |
| CN112226406A (zh) * | 2020-10-19 | 2021-01-15 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1443846A (zh) * | 2002-03-07 | 2003-09-24 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 大鼠睾丸特异基因rtSH3p13的克隆及其蛋白质的生物学功能 |
| WO2003087108A2 (en) * | 2002-04-10 | 2003-10-23 | Esperion Therapeutics, Inc. | Mimics of acyl coenzyme-a, compositions thereof, and methods of cholesterol management and related uses |
| CN101500514A (zh) * | 2005-08-01 | 2009-08-05 | 路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会 | 脂肪组织衍生的基质细胞在脊柱融合术中的应用 |
| CN106236745A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-21 | 中国科学院微生物研究所 | 芳香族法尼基类化合物的用途 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108841785A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-11-20 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1443846A (zh) * | 2002-03-07 | 2003-09-24 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 大鼠睾丸特异基因rtSH3p13的克隆及其蛋白质的生物学功能 |
| WO2003087108A2 (en) * | 2002-04-10 | 2003-10-23 | Esperion Therapeutics, Inc. | Mimics of acyl coenzyme-a, compositions thereof, and methods of cholesterol management and related uses |
| CN101500514A (zh) * | 2005-08-01 | 2009-08-05 | 路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会 | 脂肪组织衍生的基质细胞在脊柱融合术中的应用 |
| CN106236745A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-21 | 中国科学院微生物研究所 | 芳香族法尼基类化合物的用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 辛灵彪: "SND1转基因小鼠改善高脂饮食诱导的脂肪肝和胰岛素抵抗", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019237812A1 (zh) * | 2018-06-15 | 2019-12-19 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 脂肪组织消化液和快速获得基质血管成分细胞的方法 |
| CN112226406A (zh) * | 2020-10-19 | 2021-01-15 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种人体血管周围脂肪组织单细胞悬液制备方法 |
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