CN1088260A

CN1088260A - 用于检测染色体易位的寡核苷酸探针和引物

Info

Publication number: CN1088260A
Application number: CN93116597.0A
Authority: CN
Inventors: N·普拉沙; M·布里克; M·L·库比治; M·阿斯加里; C·L·里丁; W·D·韦伯; S·-C·祝; J·布里泽
Original assignee: TAXAS SYSTEM, University of, Regents of; Aprogenex Inc
Current assignee: TAXAS SYSTEM, University of, Regents of; Aprogenex Inc
Priority date: 1992-07-17
Filing date: 1993-07-17
Publication date: 1994-06-22
Also published as: AU4774293A; WO1994002500A1; IL106379A0; AU4681693A; WO1994002643A1; EP0672185A4; EP0672185A1

Abstract

为在已经历染色体易位的细胞中杂交到核酸分子的跨越接合点的片段上和其扩增的复本产物上而设计的分子。

Description

本发明涉及通过使用核酸探针进行的核酸的检测。

通过使用特定的核酸（RNA或DNA）探针，可检测明显感染的核酸分子和其它疾病状态。某些遗传疾病的特征是存有在正常组织中不应存有的基因。其它病理状态的特征是表达在正常细胞中不表达的RNAs或RNA转译产物（即肽或蛋白）。某些疾病状态的特征是缺少某些基因或基因部份，或者缺少或交替表达基因产物或蛋白。

一种特别重要的细胞是由染色体易位造成的已经成为畸变细胞（可能是癌）的正常细胞。因此希望能够检测具有染色体易位的细胞。标准染色体组型技术能鉴别已发生染色体易位的细胞。然而，通过原位杂交的方法来完成鉴定是有利的，因为这通过流式细胞光度术可使大量细胞得到较快的分析。这种杂交技术需要专用于只有当细胞已经产生易位时才存在的核酸的探针、护增引物或引物组。实际上，核酸技术已经用于检测由染色体易位而产生的核酸（M.J.Embleton等人;上述引证;Fritsch等人，U.S.P.4725536;Stephenson等人U.S.P.4681840）。

当探针靶是DNA时，该靶通常是双链靶：一个“反义”链，由该链RNA（如mRNA）被转录，另一个“有意义链”，它在碱基序列中对反义链是互补的。这样就可以假定，对于所给定数量的细胞DNA靶，采用包括针对靶的有意义链和反义链的两个探针，可加倍由靶结合探针产生的信号。

然而一般说来，如果探针群体不仅含有与靶的一个链互补的分子而且还含有与靶的另一个链互补的分子，则存在杂交效率（加到试验体系中每μg探针所得到的靶结合探针量）降低的趋势。在努力于尽可能短时间内达到靶饱和的过程中，一个特别可行的途径是增加总的探针浓度，这种效率降低显然主要是由于存在探针分子相互杂交的倾向，因此产生高分子量聚集体。在本发明中，进行了适当的测量，结果是当探针群体具有针对有意义链探针和针对反义链探针时，杂交效率几乎不或根本不降低。

适用于设计向双链靶杂交的探针群体的一些原则也适用于设计仅向存在于已发生染色体易位的细胞中的RNA或DNA分子杂交的探针分子或引物分子。这类探针利用了由于产生易位接合点而存在的新的碱基序列的优越性，在该接合点处，两个正常染色体片段已连接形成易位染色体。

一方面，本发明涉及专门杂交于RNA或DNA的核酸探针或引物，该RNA或DNA跨越已发生染色体易位的细胞中的核酸易位接合点。

本发明的另一方面，形成一种核酸探针群体，使得尽管某些探针分子能够杂交于双链靶的一个链且其它的探针分子能够杂交于该靶的另一个链，但探针分子不会相互杂交。最佳的是有一系列可在该靶的各链上以端对端方式杂交的探针。通过限制探针分子的大小并限制任意两个探针分子间互补区的长度来避免探针群体的自杂交。

图1标记了Gen Bank序列HUMREPA84核苷酸101-400，且表明核苷酸101位于该序列的5′端而核苷酸400位于3′端。与核苷酸101-400之间的序列互补的序列中的核苷酸示于被补充的那些核苷酸之下。该图给出了五个探针（H18-100L、H18-100R、H18-110R、H18-10和H18-11）的核苷酸序列。

图2为表示用于实施例3中的探针间的关系图。

图3a为用实施例4中探针HYR-7-25所得结果的显微相片。

图3b为用实施例4中探针HYR-7-12所得结果的显微相片。

定义

“分析物分子”为设计检测试验的分子。

“扩增分子”为使用扩增方法生成的核酸分子（如，PCR、3SR、TAS）。其或具有与全部或部分RNA分析物分子互补的碱基序列或具有与全部或部分RNA分析分子相同的碱基序列。

“探针”为一含有寡核苷酸且通常还含有报导物部分的分子，该报导物可被检测，该寡核苷酸可杂交于一扩增RNA分子。报导物部分（也称为可检测标记）可放射性的、荧光的、化学发光的、酶（如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、或其它催化比色反应的酶）、或为可专门与直接连接到可检测部分的配体特性结合分子（诸如抗生蛋白链菌素）反应的配体（诸如生物素或半抗原，可与抗体反应的地谷新配基），该可检测部分例如为放射性的、荧光的、化学发光的，或酶。

如果“Watson-Crick”碱基配对规则限定了两个核苷酸序列间的关系：即无论何处，在一个序列中有一鸟嘌呤（G）而在另一序列中有一胞嘧啶（C），且无论何处，在一个序列中有一腺嘌呤（A）而在另一序列中或有一胸腺嘧啶（T）或有一尿嘧啶（V），则第一核苷酸序列与第二核苷酸序列“互补”。

“杂种”是由两个核酸分子形成的一个双链的（或部分双链的）分子，其中一个核酸分子具有与另一分子中的序列互补的核苷酸序列。

当由两个因易位会合的染色体片段形成一新的染色体时，这两个片段会合所在点为“染色体易位接合点”。

“核苷酸序列”一词意在包括这样一序列，其中存在有某种非磷原子（如硫）处于核苷间磷通常出现的一些位置。

“易位跨越接合点细胞RNA分子”为含有两个核苷酸序列的细胞RNA分子（诸如hnRNA或mRNA分子），这两个序列是邻接的且连接在该分子的RNA易位接合点处，一个核苷酸序列由染色体易位接合点一侧的一部分染色体转录，而第二个核苷酸序列由该染色体接合点另一侧的一部分染色体转录。例如，采用易位跨越接合点hnRNA分子的细胞处理便可在细胞中产生易位跨越接合点mRNA分子。

“易位跨越接合点细胞RNA片段”为含有两个核苷酸序列的细胞RNA分子（诸如hnRNA或mRNA分子）片段，这两个序列相邻接且连接在该分子的RNA易位接合点处，一个核苷酸序列由染色体易位接合点一侧的一部分染色体转录，而第二个核苷酸序列由该染色体接合点另一侧的一部分染色体转录。

“易位跨越接合点细胞DNA分子”为含有两个核苷酸序列的细胞DNA分子，这两个序列相互对接以使形成的序列长度等于它们各自的长度之和，一个核苷酸序列位于其易位接合这一侧的部分染色体上，而第二核苷酸序列位于该接合点另一侧的部分染色体上。

“易位跨越接合细胞DNA片段”为细胞DNA分子片段，该片段具有两个核苷酸序列，这两个序列彼此对接以使形成的序列长度等于它们各自的长度之和，一个核苷酸序列位于其易位接合点一侧的部分染色体上，而第二核苷酸序列位于该接合点另一侧的那部分染色体上。

在词组“易位跨越接合点细胞核酸片段或其扩增复本”中，“扩增复本”包括具有与所述核酸片段的碱基序列等同（将U看做RNA，同样将T看做DNA）或互补的碱基序列的片段。

“易位跨越接合点扩增核苷酸分子”为含有一与跨越接合点细胞核酸分子或片段互补的核苷酸序列的扩增核酸分子。

“易位跨越接合点细胞核酸分子”或为“易位跨越接合点细胞RNA分子”或为跨越接合点细胞DNA分子”。

“易位跨越接合点细胞核酸片段”或为“易位跨越接合点细胞RNA片段”或为“跨越接合点细胞DNA片段”的分子片段。

“引物”为被诸如DNA聚合酶的酶（如，在聚合酶链反应中，“RCR”）或逆转录酶（如，3SR法，Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，vol87，pp 1874-1878（1990））扩展成较长分子的寡核苷酸。

“易位跨越接合点引物”为具有与跨越接合点RNA片段互补或相同的核苷酸序列的引物。

“原位”一词用来描述发生在细胞或基本完整的病毒内部的过程（如，诸如PCR或3SR的杂交或扩增）;该细胞或病毒常常已经过交联或沉淀固定剂处理，其中许多（而不是全部）在本文中有命名。

“易位跨越接合点探针”为具有与跨越接合点RNA片段互补或相同的核苷酸序列的探针。

用于本文中的“生物实体”或为细胞，或为病毒。

“分子群体”指许多分子。由于探针及引物分子长度可小至20-50个核苷酸，且其加入反应混合物的浓度在100ng-10μg或（若有必要则）更高的范围内，故该分子数量常常很大。

“分子均质群体”指在群体中的每一分子与其它各分子相同。

短语“含有一核苷酸序列的分子，该核苷酸序列与或为易位跨越接合点细胞核酸片段的或为其扩增复本的核苷酸序列20-50核苷酸但不大于20-50的核苷酸互补”指的是，那些不为跨越接合点序列部分的序列可为该分子的一部分。

跨越接合点探针或引物的设计

在本发明中，当跨越接合点引物或探针杂交于细胞中一跨越接合RNA分子时，便在该探针不会与非跨越接合分子杂交的条件下（温度、时间、离子强度等）发生了杂交作用。通过适当选择该引物或探针的长度，并按照下面的规则选择适当的杂交条件，可实现这一选择性杂交过程。该规则为：

对任意一对单链分子来说，若一个分子自身内部具有与该第二分子内核苷酸序列互补的核苷酸序列，且那两个核苷酸序列都为N核苷酸长（二者分子的总长度可大于N），则仅当N长于某临界值时，该分子会形成杂种。该临界值部分取决于杂交条件（温度、所选溶剂等）且部分取决于该互补序列的核苷酸组成。

变换杂交条件和/或该探针分子的碱基序列，便可变换N的临界值。采用常规实验，可确定任意杂交条件与靶序列组合态下的临界值，从而实施本发明的方法。

N必须超过一邻界值的事实构成了检测包含结合点的核酸序列的基础。正常细胞的核酸应具有这一序列的双重部分，但这两部分不连接。因此，若该探针与接合点一侧的不大于N-1核苷酸的序列（或者优选不大于N-3核苷酸的序列）互补并与该接合点另一侧的不大于N-1核苷酸的序列（或优选为不大于N-3核苷酸的序列）互补，该探针便不会与正常细胞核苷酸杂交。

优选的是，易位跨越接合点的探针或引物具有与长度为20-50核苷酸（更佳长度为20-35核苷酸）的易位跨越接合点片段的序列互补的核苷酸序列。较佳的是，对采用如下所述的探针L6-26和K28-26的情形而言，与该探针或引物互补的一半跨越接合点片段应在含该片段的易位接合点的一侧（意为其另一半应在该接合点的另一侧）。

重叠探针

应用规则来建立能够与分析物分子的双链形成杂种的探针群体。

应考虑到，对任一对单链分子来说，如果在一个分子自身内部具有与第二分子内的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且这两个核苷酸序列均为N核苷酸长（二者分子的总长主工可大于N），则仅当N大于某一临界值时该分子会形成杂种。该临界值部分取决于杂交条件（温度、溶剂选择等）还部分取决于互补序列的核苷酸组成。

可看出，下面实施例列举的实验中的该临界值介于12-23之间。在这些实施例中，通过使探针分子的长度为约24核苷酸且不使任一对探针分子的N超过12，便获得用于杂交到双链靶上的有效探针群体。该群体所以有效，是因为其可获得双倍于用只向单链杂交的探针所获得的那样大的信号。

变换杂交条件和/或该探针分子的碱基序列，便可变换N的临界值。这可从本文所包括的实施例中证实。然而，采用按照下面给出的规则所做的常规实验，可以确定任意组杂交条件下的临界值，从而实施本发明的方法。

一方面，本发明为一种用于检测双链核酸靶的方法，该方法包括的步骤为：

（1）使该靶链充分分离以使其各自与互补核苷酸序列的核酸探针杂交;

（2）将充分分离的靶链与一核酸探针群体共培养，该核酸探针群体包含与一个靶链呈核苷酸序列互补的分子和与另一个靶链呈核苷酸序列互补的分子;及

（3）检测与靶分子杂交的核酸探针分子：

进行步骤（2）所处的条件应使得各靶链与与该呈核苷酸序列互补的核酸探针分子形成杂种;

要使得对于每一核酸探针分子的核苷酸序列来说，在靶内存有全部的互补序列;

要使得每一核酸探针分子与至少一个另外的核酸探针分子呈核苷酸序列的部分互补;

要使得不应有两个核酸探针分子彼此的核苷酸序列完全互补;

要使得在一个核酸探针分子的一部分与另一核酸探针分子呈核苷酸序列互补之处，那一部分的长度短到在步骤（2）的条件下不能与其它核酸探针分子杂交。

“核苷酸序列”一词意在包括有在核苷间磷通常出现的一些位置存在一些非磷原子（如硫）的部分的序列。在这一状况下，与核苷酸序列互补的两个分子可替换为与核苷序列互补或与核苷酸序列互补。

通常用可检测标记（如放射性³²P、诸如荧光素的染料分子、或可进入化学发光反应的部分）来标记探针分子。

在本方法的一个总实施方案中，两个靶链位于或为细胞或为病毒的生物实体中。该细胞或病毒可悬浮于溶液中但不固定在固体承载物上。另一方面，该细胞或病毒可固定在固体承载物上。该细胞或病毒可为部分组织切片。

含有靶核酸分子的细胞可为真核细胞（如人体细胞）、原核细胞（如细菌）、植物细胞、或其它类型细胞。它们可为诸如酵母的简单真核生物或可衍生物复杂真核生物（诸如人体）。

核酸的靶链可在无包被病毒或包被病毒（具有诸如脂质蛋白膜的无包被膜）中。

在本发明的一个实施方案中，探针群中的多个分子或直接地或通过交联剂分子各个共价连接到一荧光染料分子上。

在该方法中，两个靶链可为纯化核酸。他们可能取自病毒、细胞或多细胞机体。

在该方法的步骤（2）中可将两靶链固定在固体承载物（诸如硝化纤维素纸或尼龙片）上。任选地，该靶链也可在溶液中而不固定在固体承载物上。

在该方法中，靶链可为DNA。靶链也可为RNA，如对其中在一个单细胞内可同时存在互补RNA链的病毒（如人体免疫缺乏病毒）的情形即是如此。

病毒核酸靶可为部分病毒，在此情形下该病毒可在或可不在细胞内部。任选地，病毒核酸靶可不为病毒部分，但可在细胞内部。

在本方法的一个优选实施方案中，探针分子具有核苷酸序列，以使得若该靶链的一个链为探针分子所饱和，则在探针分子之间不含有形成缺隙的未杂交的靶链序列。

优选的是，每一探针分子与存在于至少一个另外的探针分子中的长度不小于约12核苷酸而不大于约100核苷酸的一个序列互补。

更佳的是，每一探针分子与存在于至少一个其它的探针分子中的长度不小于约12核苷酸而不多于约20核苷酸的一个序列互补。

在一优选实施方案中，每一探针分子与存在于至少一个其它探针分子中的约12核苷酸长度的序列互补。

优选每一探针的长度介于约15-100核苷酸。更佳的是，每一探针的长度介于约15-40核苷酸。

该方法中，与另一探针分子互补的探针分子部分的长度优选不少于约12核苷酸而不大于约100核苷酸。更佳的是，与另一探针分子互补的探针分子部分的长度不少于约12核苷酸而不多于约20核苷酸。在本方法的一个最为优选的实施方案中，该与另一探针分子互补的探针分子部分约为12核苷酸长。

在上述方法的具体实施方案中，该双链靶具有第一靶链和第二靶链，且其中在核苷酸序列中与第一靶链互补的探针分子具有结构不同于与第二靶链互补的探针分子上的可检测标记的可检测标记。例如，在于核苷酸序列中与第一靶链互补的探针分子上的可检测标记可为荧光染料，而在与第二链互补的探针分子上的可检测标记也可为荧光染料。在一特殊的实施方案中，其中双链靶为DNA靶，在核苷酸序列中与第一靶链互补的探针分子也在核苷酸序列中与细胞的RNA分子互补。表明后一特殊实施方案有效的实施例中，在所关心的靶细胞内可能有一双链DNA病毒染色体组（或-RNA病毒染色体组的逆转录酶DNA复制），且若确实存在有这样一染色体组，则可能有或可能没有从这一染色体组转录的RNA。从临床的观点看，不仅了解DNA染色体组是否存在具有意义，而且了解该染色体组是否被表达为mRNA或染色体组的其它RNA复制也具有临床意义。若没有病毒mRNA（或其它RNA）存在，则由作用于反意义链的探针检测的核酸的量应等于由作用于意义链的探针检测的核酸量。若还存在有病毒mRNA，则由作用于DNA意义链的探针检测的核酸量超过由作用于DNA反意义链的探针检测的核酸量。这种超额是因为有mRNA的存在。确实，通过标定作用于已知量的病毒RNA及病毒DNA的探针，便可得知由给定量的杂交探针放出的荧光量，便可用这一结果计算存在于试验样品中的病毒RNA及病毒DNA的量（总质量），且还可根据RNA及DNA靶的分子量计算每一试验样品继而每一细胞的RNA分子复制数目及病毒DNA的复制数目。

如果实施例4和7的计划接续使用各带四个氟的30链节，且如果在载玻片上与细胞杂交，并且如果用足够的30链节覆盖靶的双链，则应该能够检测单细胞中靶的单复制，即使该靶短至750碱基对，可用眼睛通过显微镜观察到荧光，或当靶短至75-150碱基对时用象分析装置观测到。

该双链靶可为细胞DNA、细胞RNA、病毒DNA、或病毒RNA。

本发明除具有多种方法外，在此还涉及核酸探针群体，包括所有具体的及优选的实施方案，均公开在这些方法的使用当中。

相关的发明为用于本发明上述方法中的探针群体。此处的核酸探针群体为一例，其中

1）每一探针分子长度在约15核苷酸至约100核苷酸之间。

2）在核苷酸序列中没有完全与其它探针分子互补的探针分子，以及

3）在核苷酸序列中每个探针分子与至少1个其它探针分子是部份互补的。

使用跨越接合点的探针可检测的疾病和易位实例

表A是可使用本发明检测的疾病类型的说明。但这并不是试图限制能用本发明检测的疾病和易位的类型。

易位的跨越接合点的核苷酸序列或是已公开，或是可通过使用用于已公开序列的技术而被确定。

表A

公知易位的实例

t(2;8)(p11;q24)Burkitt淋巴瘤(Fujino et al.,Jpn. J. Cancer

Res.,vol 77,pp 24-77(1986)

t(11;14)(q13;q32) 慢性淋巴细胞白血病(Y.Tsujimoto et al.,

NAture,vol 315,pp 340-343(1985)

t(7;9)(q34;q34.3)急性T细胞淋巴母细胞白血病(T.C.Reynolds

et al.,Cell,vol 50,107-117(1987)

t(14;14)(q11;q32) T细胞慢性淋巴细胞白血病(M.P.Davey et

al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol 85,pp9287-9291(1988)

t(8;14)(q24;q32)Burkitt 淋巴瘤(F.G.Haluska et al.,Proc.

Natl.Acad.Sci.,USA,vol 84,pp 6835-6839(1987))

t(10;14)(q24;q11) T细胞急性淋巴细胞白血病(M.Zutter et

al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol 87,pp 3161-3165(1990)

t(9;14)(p13;q32) 扩散大细胞淋巴瘤(H.Ohmo et al.,Proc.

Natl.Acad.Sci.USA,vol 87,pp 628-632(1990))

t(1;14)(p33;q11) 白血病细胞(8)(C.G.Begley et al.,Proc.

Natl.Acad.Sci.USA,vol 86,pp 2031-2035(1989))

t(X;18)(p11.2;q11.2) 滑膜肉瘤

(X-Y易位) X连锁的隐性软骨发育异常点(punctata)(47,XY,

+del(s)(q12,q34),

t(15;21)(q21;q22) 急性成髓细胞白血病(AML)

47,XY,+del(s)(q12,q34) 急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)

t(8;14)(q24;q11) 急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)

t(8;14)(q24;q11) 白血病/淋巴瘤

13(q11) 其它各ALL

(近基的de115q) Prader-Willi综合征

t(1;15)(p36.2;p11.2) 扩散性肌肉张力减退

(X;5)(p11.2;q35.2) 色素失调症

(2q13) 横纹肌肉瘤

t(16;21)(q11;p11) 三体性16p

t(1;19) 前B细胞急性淋巴母细胞白血病

t(15;17) 急性前髓细胞白血病(APL)

t(1;7)(p11;p11) 急性骨髓白血病或脊髓发育不良

(8q24 14q32) Burkitt's淋巴瘤

Bcl-2

t(11;14)(q13;q32) Bcl-1

t(14;18)(q32;q21) Hodgkin淋巴瘤(NHL)

t(8;14)(q24;q32) 淋巴小结组织学型

t(3;22)(q24;q11) 类Burkitt淋巴瘤

t(11;14)(q13;q32) 扩散的大细胞淋巴瘤

t(9;22)(q34;q11) 慢性骨髓单核细胞白血病W/(Ph)

t(4;6)(p15;p12) 慢性骨髓单核细胞白血病W/(Ph)

inv(3)(q21;q26) 顽固性贫血

t(3;3)(q21;q26) RAEB-T

inv(3)(q21 q26) 伴随骨髓外化生的骨髓纤维变性(MMM)

3p上损伤肾细胞癌(RCC)

(3;21)(q26;q22) 继发性白血病

t(3;21)(q26.3;q22) 急性骨髓白血病

5q35 儿童期Malignant组织细胞增多病

t(5;6)(q35;q21)

t(2;13)(q37;q14) 横纹肌肉瘤(RMS)

(Y;11)(q11.2;q24) Jacobsen综合征

t(X;18)(p11;q11) 二阶级和一阶段滑膜肉瘤

t(X;15;18)(p11;q15;q11) "

t(X;7)(q11-12;q32) "

14q32(28%)或14q11(14%) 成人期T-细胞白血病/淋巴瘤

t(19;22)(q13.3;p11.2) 远基19q

在染色体*11和22之间*易位* 神经上皮瘤

+der(1q9p) 骨髓组织增殖紊乱

切断点在Xp22和Xq28 平衡的X-常染色体

11q23 成人期急性骨髓白血病

13q的畸变或三体性13 7q和1q

三体性1 1q

t(8;14)(q24;q32) Burkitt型白血病

t(9;22)(q34;q11) Philadelphia+All(PhL+ALL)

X;6 q15-16 先天性急性淋巴母细胞白血病(ALL)

(8;21) 顽固性贫血

46,XY,der(5)t(5;11)(p15.2;p14)[11p15]

Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)

11p15,fus(14p;21p),以及fus(15p;21p)

骨巨细胞瘤(GCT)

11q13 多发性内分泌腺瘤形成1型(MEN1)

t(7;22)(p22;q13) 与inv(16)(p13q22)急性非淋巴细胞

性白血病相关(M4)

46,XY/46,XY,t(7;19)(q22;p13.3) 急性骨髓单核细胞白血病

(FAB M4)

46,XY/46,XY,t(7;19)(q11;q13) 儿童期ALL

46,XY,t(3q;11q),t(7q;19p),t(15;17)(q26;q22)

ANLL(FABM3)'2

探针

核酸探针可以是DNA，RNA，或寡核苷酸或由DNA或RNA组成的多核苷酸。该DNA或RNA主要成份可为腺苷，尿苷，胸苷，鸟嘌呤，胞嘧啶或其任何天然可人造化学衍生物。该探针能够通过一种或多种化学键，通常通过氢键形式连接到互补的或镜象靶细胞的遗传序列上。

核酸探针在加入杂交溶液之前可以被可检测地标记。也就是说，可选择连接到杂交产物上的可检测标记。探针可用任何用于实施本发明的可检测基团标记。这种可检测基团可以是任何具有可检测物理或化学特性的物质。这种可检测标记在免疫学领域中已被深入地研究，并且一般说来多数用于这些方法的任何标记均可用于本发明。特别有用的是酶活性基团，例如酶（参看Clin，Chem.，22∶1243（1976）），酶底物（见British Pat.Spec.1548741），辅酶（见U.S.Patents Nos.4230797和4238565）和酶抑制物（见U.S.Patent No 4134792）;荧光剂（见Clin.Chem.，25∶353（1979））;发色团;发光剂例如化学发光剂和生物发光剂（见Clin.Chem.，25∶512（1979））;特定可连接配体;近端的相互作用对;以及放射性同位素如³H，³⁵S，³²P，¹²⁵I和¹⁴C。术语“核酸探针”被认为是包括以任何方式，包括以上述方式被标记的核酸。

生物素标记的核苷酸可通过断口转译，酶解法或化学方法掺入DNA或RNA。生物素化的探针在杂交后使用抗生物素蛋白/链状抗生物素蛋白，荧光的，酶解的或胶态金接合加以检测。核酸还可以用其它荧光化合物，用可免疫检测的荧光衍生物或用生物素的类似物标记。核酸也可借助于连接蛋白质来标记。还可使用交联到放射性或荧光组蛋白HI上，酶（碱性磷酸酶和过氧化物酶）上，或单链结合（ssB）蛋白质上的核酸。为了提高检测胶态金或过氧化物酶产物的敏感性，可使用一些采用银溶液的强化或扩增步骤。

也可利用间接的荧光免疫细胞化学步骤（Rudkin and Stollar（1977）Nature 265∶472;Van Prooijen等人（1982）Exp.Cell.Res.141∶397）。通过向动物注射多（rA）-多（dT）增高了多克隆抗体抗RNA-DNA杂种的能力。将DNA探针原位杂交到细胞上，而杂种通过用抗RNA-DNA杂种的抗体进行培养来检测。

探针的光生物素^TM标记对于生物素标记而言是较佳的。

核酸探针可用来针对各种病毒的、原核的和真核的核酸靶子。这些发明的探针群体的靶子通常是DNA靶子，例如基因（如致癌基因），控制成份（如启动子，阻遏物，或强化因子），染色体的易位连接点，或对核蛋白体RNA、转移RNA或RN酶P编码的序列。任选地，该靶子可以是任何核酸靶子，或是RNA或是DNA，它包括两个互补的靶核苷酸序列中的一个;它例如在希望用特性序列或其补体检测任何DNA或mRNA分子的场合就是该种情况。如在易位的跨越接合点的分子的情况下，或病毒RNA序列及其RNA补体在同一细胞中存在的情况下，该靶子可以是RNA。

由各实施例可以看出，任何所希望序列的探针均可制作。

当靶子是提纯的核酸时

提纯的核酸在本文中被认为是已从细胞提取，或认为是已在异位的无细胞系统中合成。为将探针杂交到该提纯的核酸上，已公开了许多方法。在通常情况下，如果靶子是DNA分子，那么在杂交步骤发生之前通过加热或其它方法将其链分离。杂交可采取良好制定的步骤用固定在固态载体（如DNA用硝化纤维素纸，RNA用尼龙）上的靶子进行。该探针可以以与下述原位实验标记探针相同的方法而被标记;或以其它可检测的方法对它们进行标记。对于实验这些实验而言，标记的方法不限。如果已知一标记步骤适用于针对提纯核酸靶的探针，则可预料该标记步骤适用于打向双链的情况下的探针群。

在细胞，组织和流体中的靶子

对于在液态悬浮液中的，在玻片或其它固态载体上的细胞中的，在组织培养细胞中的，以及在组织切片中的生物实体内的靶子可进行杂交试验。当生物实体是细胞时，它可取自固态组织（例如骨髓，神经，肌肉，心脏，皮肤，肺，肾，胰，脾，淋巴结，睾丸，子宫颈，以及脑）或存在于衬在各种道，导管和腔体（例如胃肠道，尿道，输精管，子宫腔，子宫管，阴道，呼吸道，鼻腔，口腔，咽，喉，气管，支气管和肺）的膜内的细胞或有机体流体（例如尿，胃液，痰，血液和淋巴液）或粪便中的细胞。

当靶子在生物实体中时

可能的杂交条件的两份很有用的说明记载在公开号为WO90/02173和WO 90/02204的PCT国际专利申请中，二者均为Research Development Corp.的申请。

原位杂交使得可以在个自细胞中检测RNA或DNA序列。由于靶子足够大，所以它可以在2-4小时那样短的时间内检测少至1-5个靶分子/每个细胞。（PCT申请90/02173和WO90/02204）。它还允许同时检测单个细胞中多于1个的不同的多核苷酸序列。它还允许检测同一细胞中的蛋白质和多核苷酸。

如上所述，可能有许多不同的杂交条件（溶剂组成，温度，时间）。下述的几种仅仅是试图向读者建议某些更佳的杂交条件。所属领域的任何技术人员应知道，许多其它的条件也能有效地使用。

杂交步骤例如可在以下溶液中进行，该溶液含有离液序列高的试剂如50%甲酰胺，杂种稳定剂如5倍浓度的SSC溶液（1×＝0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸钠），缓冲液如0.1M磷酸钠（pH7.4），约100微克（μg）/毫升（ml）低分子量DNA以减少非特性连接，0.1%Triton X-100以促进探针进入细胞，以及约10-20mM氧钒基核糖核苷配合物。

除另加注明外，液体的所有百分数均以v/v为基础。

将探针群体加入杂交溶液，使与靶核酸杂交。如果最终载玻片（或其它固态载体）上观察细胞，则将或是作为单细胞悬浮液或是作为组织薄片的细胞沉积在该玻片上。通过选择一种固定剂使细胞固定，该固定剂提供了细胞的最佳空间溶解和最佳的杂交效率。固定之后，由载体约束的细胞可被脱水并在室温下贮存，或者可立即进行杂交步骤。

含有探针的杂交溶液以足够量添加，以覆盖住细胞。然后将细胞在适宜的温度下培育。

下述实施例所用的温度可看出是在42-46℃范围内。较佳的温度条件已由PCT申请WO 90/02173和WO 90/02204揭示为在50°-55°的范围内。但是可用15℃-80℃的温度范围。

杂交溶液可包括离液序列高的变性剂，缓冲液，孔形成剂，杂种稳定剂，以及靶特性探针分子。

离液序列高的变性剂（Robinson，D.W.and Grant，M.E.（1966）J.Biol.Chem.241：4030;Hamaguchi，K.and Geiduscheck，E.P.（1962）J.Am.Chem.Soc.84：1329）包括甲酰胺，尿素，硫氰酸盐，胍，三氯乙酸盐，三氟乙酸盐，四甲基胺，高氯酸盐，以及碘化钠。优选保持pH至少在7.0-8.0的缓冲液。

孔形成剂可为例如去垢剂，如Brij35，Brij58，十二烷基硫酸钠，CHAPS^TMTriton X-100。根据靶子生物高聚物的位置，选择孔形成剂以促进探针通过质膜或核膜，或细胞的分室结构进入。例如0.05%Brij 35或0.1%Triton X-100允许探针通过质膜而不允许通过核膜进入。另外脱氧胆酸钠则允许探针横穿核膜。因此，为限制向细胞质生物高聚物靶杂交，避免使用核膜孔形成剂。当靶子生物高聚物位于细胞质中时这种选择性的亚细胞定位通过限制探针杂交到互补的核序列上而有助于增强试验的特异性和敏感性。不用去垢剂的试剂如固定剂也可起这种功能。此外，也可选择生物高聚物探针使其尺寸足够小以能横穿细胞的质膜，但又大得不能通过核膜。

杂种稳定剂如一价和二价阳离子盐包括在杂交溶液中，以促成探针的互补核苷酸序列及其靶子生物高聚物之间氢键的形成。较佳的是使用浓度0.15M-1M的氯化钠。为防止核酸探针的非特性结合，将与靶生物高聚物无关的核酸以约100倍于探针的浓度加入杂交溶液。

在上述每个步骤之后，去除样品并使用相差显微镜观察细胞形态，与新的未处理细胞比较进行分析。为使每个步骤最优，选择确定的条件以保持细胞形态和各种亚细胞结构的空间溶解尽可能接近新的未处理细胞。

在核酸杂交之前，可在磷酸盐缓冲的盐水中使细胞与抗体反应。杂交后，可对结合的抗体和结合的杂交探针二者进行细胞分析。

封固生物实体/组织

许多类型固态载体可用于实施本发明。可用载体包括但不限于：玻璃，Scotch带（3M）尼龙，Gene Screen Plus（New England Nuclear）和硝化纤维素。使用显微镜玻片最佳。这些载体的使用和在其上沉积样品的步骤对所属领域的技术人员是显而易见的。载体物质的选择取决于目测细胞的方法和所用的定量方法。某些过滤材料厚度不均，因而在原位杂交过程中收缩和膨胀不均。此外，某些自身发荧光的载体将影响测定低水平的荧光。显微镜破片作为固态载体最佳，这是因为它们具有高的信号-噪声比，并能被处理以便较好地夹持组织。

生物实体/组织的固定

固定剂可选自以下物组：任何沉淀剂或交联剂，它们单独或联合使用，并且可以是含水的或不含水的。固定剂可选自以下物组：甲醛溶液，醇，盐溶液，氯化汞氯化钠，硫酸钠，重铬酸钾，磷酸钾，溴化铵，氯化钙，乙酸钠，氯化锂，乙酸铯，乙酸钙或乙酸镁，硝酸钾，重铬酸钾，铬酸钠，碘化钾，碘酸钠，硫代硫酸钠，苦味酸，乙酸，仲甲醛，氢氧化钠，丙酮，氯仿，甘油百里酚，等等。固定剂较佳地含有一种试剂，它通过沉淀作用固定细胞结构，并具有如下特性：作用是可逆的，保持细胞（或病毒）的形态，保持所需细胞组成的抗原性，使核酸保持在细胞中的适当位置，核酸不以使它们成为不能形成双链或三链杂种的方式被修饰，并且细胞组成不以阻止将核酸杂交到残留靶子序列上的过程这样的方式而受到影响。固定剂和固定步骤的选择能影响细胞组成和细胞形态，该影响可能是组织特异性的。用于本发明的固定剂较佳地是选自以下物组：乙醇，乙醇-乙酸，甲醇，以及甲醇-丙酮，这些固定剂赋予最高的杂交效率和良好保存细胞形态。

实施本发明的固定剂包括：95%乙醇/5%乙酸用于HL-60和一般骨髓细胞，75%乙醇/20%乙酸用于K562和一般周边血液细胞，50%甲醇/5%丙酮用于成纤维细胞和一般骨髓细胞，而10%甲醛/90%甲醇用于心肌组织。这些固定剂使得细胞形态能良好保存，提供了抗原良好的保存性和可及性，以及高的杂交效率。

同时，固定剂可含有将细胞组分交联在一起而使其固定的化合物，例如戊二醛或甲醛。在这一交联剂必须满足对沉淀剂的上述全部要求的同时，它一般是较“粘”的，并使细胞和膜组分被紧固或密封，从而保持上述特性。交联剂在使用时较佳地是小于10%（v/v）。

交联剂在保存超微结构的同时，常常降低杂交效率，它们形成截留核酸和抗原的网，并使它们不能进入探针和抗体。某些还共价地修饰核酸，防止后来的杂种形成。

生物实体/组织的贮存

固定之后，含有细胞的显微镜载玻片在室温下贮存风干达3周，在冷（4℃）的70%乙醇水溶液中贮存6-12个月，或在副质中贮存达2年。如果样品在无RN酶的条件下处理，它们可在分了级的醇中脱水，并在室温下保存至少5个月。

各试剂可由任何多个来源购买，包括Aldrich Chemical CO.，Milwaukee，Wisconsin，Sigma Chemical Co.，St.Loulis，Missouri，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，Clontech，Palo Alto，California，Kodak，Rochester，NY，and Spectrum Chemical Manufacturing Corp.，Gardenea，California。

检测周边血液细胞和骨髓细胞中的致癌基因

在一个典型步骤中，将10ml人的周边血或2ml人的骨髓细胞在1.2%（215mOs）草酸铵溶液中于37℃培育，以溶解红血细胞。将白血细胞在临床离心机中以3000rpm离心处理10分钟。随后用10ml PBS洗涤细胞积片并使该积片重悬浮于PBS中。经细胞离心将细胞沉积在预先清洁过的载玻片上并风干5分钟。然后在室温下将细胞固定在75%乙醇/20%乙酸中20分钟。然后使用致癌特性探针进行杂交步骤。

固态组织的杂交

在一个典型的步骤中，由外科切除活体解剖试样获得的人乳房组织的4微米厚度的冰冻切片被固定在预先清洁过的载玻片上，并在室温下用50%甲醇/50%丙酮固定20分钟。然后使用本文别处所述的步骤进行杂交。

一阶段原位杂交试验

简言之，或是以单细胞悬浮液形式或是以组织薄片形式的细胞可被沉积在固态载体如载玻片上。可选择地，细胞被置入约10⁵-10⁶细胞/ml的单细胞悬浮液。通过选择一种固定剂使细胞固定，该固定剂保证了细胞最好的空间溶解和最佳的杂交效率。

然后在起固定作用的同一溶液中进行杂交。该溶液既含有固定剂又含有离液序列高的试剂如甲酰胺。该溶液中还包括杂种稳定剂如浓氯化锂或乙酸铵溶液，缓冲液，低分子量DNA和/或核蛋白体RNA（大至50碱基）用于减少非特性结合，以及孔形成剂用以促进探针进入细胞。还可包含核酸酶阻滞剂例如氧钒基核苷配合物。将一种探针（或多种探针）加入杂交溶液，使之与靶子多核苷酸杂交。

该一阶段步骤是一种进行固定，预杂交，杂交的方法，而检测阶段一般与一阶段中全部原位杂交步骤有关。通过调节该“一阶段”溶液的组分，可用适宜的温度进行杂交反应。此外，这还提供了能在溶液中用存活的或非存活的细胞完成的杂交试验。在二者的情况下，试验都是迅速的和敏感的。

一阶段步骤试样的处理

无论细胞样品是在悬浮液中或是在固态载体上，杂交步骤均使用还固定细胞的单杂交溶液进行。这种固定是在同一溶液中与杂交反应一起完成的。固定剂可选自以下物组：任何沉淀剂或交联剂，它们单独或联合使用，并可以是含水的或不含水的。

在一阶段步骤中细胞的制备

用物理的，化学的或酶解的方法将组织试样拆碎成单细胞悬浮液。将细胞以10⁵-10⁶细胞/ml的浓度置入PBS溶液（用牛血清蛋白（BSA）保持细胞的同渗重摩）。可将悬浮液中的细胞固定并在以后的时间处理，或固定并立即处理，或不固定并在本发明的原位杂交系统中处理。

将单溶液加入细胞/组织（后文称作样品）。该溶液含有：柔和的固定剂，离液序列高的试剂，核酸探针（预标记的RNA或DNA探针）和/或抗体探针，盐，去垢剂，缓冲剂，及阻断剂。可在55℃及其它例如下述实施例的条件下在该溶液中培育20分钟。

固定剂是已被证实对特定的被测试细胞类型是最优的那种固定剂（例如对于骨髓和周边血液有一种最优的固定剂，尽管该“组织”含有许多独特的细胞类型）。该固定剂通常是沉淀固定剂（例如醇）和交联固定剂（例如醛）的联合，同时交联固定剂的浓度保持在很低（小于10%）。该溶液常含有10-40%乙醇和5%甲醛水。沉淀剂和交联剂的浓度和类型根据探针和探针的严格要求，以及所需的杂交温度而变化。一般使用的沉淀剂和交联剂在PCT申请WO 90/02173和WO90/02204中说明。

杂交混合物含有变性剂，通常是约30%（v/v）的甲酰胺，但其它离液序列高的试剂如NaI，尿素等也可使用。此外，几种沉淀和/或交联固定剂也具有弱的变性性能，这些性能可以或是辅助形式或是协同形式与原变性剂配合使用。杂交混合物可构成得使仅仅优先形成RNA-RNA或RNA-DNA杂种。这是通过调整变性剂浓度同时调整盐的浓度（主要为Ⅰ族系列金属的一价阳离子和相伴随的铵离子），并且同时调整所用杂交温度来完成的。这就允许以不同的探针使其能选择性地杂交到或是细胞RNA或DNA上，或是同时杂交到RNA和DNA二者之上。这进而使探针能供入预先混合的溶液中，该溶液具有产生信号和最小噪声的最佳条件，同时最佳地“固定”细胞/组织形态。

本发明可以以适于一阶段过程的药盒形式提供。因而，另一个发明是一个在生物实体中检测核酸分子的药盒，该药盒包括本文所述的探针群体，以及一种或多种试剂，该试剂用于在溶液中使所说的探针群体与所说的生物实体反应，使得在生物实体中探针群体分子和核酸分子间形成杂种分子。而另一方面，本发明的药盒则是这样的药盒，即其中的生物实体是细胞，并且该一种或多种试剂包括选自固定剂和离液序列高的试剂（较佳的是本申请所指明的固定剂和离液序列高的试剂）。

例如，药盒可包括含固定剂/杂交混合物和一种或多种标记过的探针。该溶液例如可含有15-40%乙醇，25-40%甲酰胺，0-10%甲醛，0.1-1.5M LiCl，0.05-0.5M三乙酸盐（pH7-8），0.05%-0.15%Triton X-100，20μg/ml-200μg/ml不与一个和多个探针反应的非特性核酸，以及0.1μg/ml-10μg/ml直接用报导物分子标记的单链探针。更具体地，例如该溶液可含30%乙醇，30%甲酰胺，5%甲醛，0.8M LiCl，0.1M三乙酸盐（pH7.4），0.1%Triton-100，50μg/ml非特性核酸，以及2.5μg/ml直接用荧光报导物分子标记过的各单链探针。此外，本发明进行所述原位杂交反应会有较佳的方法和规程。

此外，药盒还可包括：

1.会与探针或探针靶杂种反应的第二可检测报导物系统。

2.待充分稀释而形成洗涤溶液的浓储液。

3.实施本发明所必需的或有用的任何机械组件，诸如固体承载物（如显微镜载玻片）、向所述承载物附着细胞的装置、或辅助进行标本的任何培育或洗涤处理的设备。

4.用以记录本发明所进行的试验结果的照相胶片或乳胶。

实施例1

在本实施例的杂交条件下证实，25碱基低聚物杂交而6-12碱基低聚物不杂交

制备细胞

在下面的实验中用H9细胞系。用无核酸酶的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤经培养过的细胞并将其以可产生明显分离的细胞的浓度置于单一细胞悬浮液中。细胞被旋转沉降为小球并排除上清液。将细胞再悬浮于40%乙醇、50%PBS和10%冰醋酸的溶液中并在4℃下搁置12-16小时。固定之后，旋转该含细胞液去除固定剂并将细胞在1X PBS中洗一次再于2X SSC中再悬浮。该细胞应立即使用。

制备探针

对于阳性对比探针，要设计和利用真核28SrRNA的保存片段;命名其为28S-25-AL并用做本文所述实验的阳性探针。称做NR25-AL的阴性探针衍生于存于细菌中的氮还原酶基因，已知其在真核细胞内不与核酸杂交。所用的这两种探针的DNA序列示于下面表1中。用下表1中所示的序列还制备了由这些25碱基低聚物衍生的12碱基、10碱基、8碱基和6碱基低聚物。在实施例中展示的所有序列均有5′端作为该序列的左端。

表1

探针序列

命名

28S-25-AL ATCAGAGTAGTGGTATTTCACCGGC

28S-21-AL ATCAGAGTAGTGGTATTTCAC

28S-18-AL ATCAGAGTAGTGGTATTT

28S-15-AL ATCAGAGTAGTGGTA

28S-12-AL ATCAGAGTAGTG

28S-10-AL ATCAGAGTAG

28S-8-AL ATCAGAGT

28S-6-AL ATCAGA

NR 25-AL TACGCTCGATCCAGCTATCAGCCGT

NR 121-AL TACGCTCGATCC

NR 10-AL TACGCTCGAT

NR 8-AL TACGCTCG

NR 6-AL TACGCT

探针合成和标记

合成寡脱氧核苷酸（使用推荐的A.B.I.试剂的380B型应用生物系统DNA合成仪），并在最后阶段将氨己基衔接物连接到5′端磷酸盐上。纯化5′-氨己基寡脱氧核苷酸并将其偶联于从“分子探针”衍生物的碱性蕊香红，再以采用基线810层析操作装置的Waters HPLC法纯化之。

杂交

在杂交时，向成小球的细胞中加入50μl含有30%甲酰胺、5X SSC、0.16M磷酸钠缓冲剂（pH7.4）、1μg/μl剪切的DNA、3%（v/v）Triton X-100（聚氧烯烃醚的醇衍生物，见Aldrich Chemical Co.1990-91目录）、5%PEG 4000（聚乙二醇）、25mM DTT（二硫苏糖醇）、0.4M异硫氰酸鈲、15X Ficoll/PVP的杂交混合物，并以2.5μg/ml的浓度加入探针。杂交作用在42℃下进行30分钟。上面的15X Ficoll/PVP为用水以15/500的稀释度稀释的500X Ficoll/PVP，而500X Ficoll/PVP为溶于水中总体积达100ml的含5g Ficoll400型（分子量400，000的聚蔗糖）加5g PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）的溶液。

洗涤

杂交反应后适当进行洗涤对于消除由探针的非特性结合体造成的本底是必需的。将杂交后的细胞置于-15ml锥形试管并向其中加入10ml预热至42℃，含有0.1X SSC、0.4M异硫氰酸鈲和0.1%Triton的洗涤溶液。搅拌该溶液直至使该细胞呈单细胞悬浮体而后以250Xg旋转分离5分钟。去除上清液再向小球加入10ml预热至42℃的含0.1X SSC和0.1% Triton的洗涤液。搅拌该溶液直至使细胞呈单细胞悬浮体。以250Xg旋转处理该细胞5分钟。排除上清液并将细胞小球再悬浮于0.2ml由0.0025%Evans Blue在1X PBS中构成的复染剂溶液中。

流动血细胞计数器的使用和解读

在用Coulter仪制成的Profile Ⅱ^TM上分析细胞。该仪器用488nm氩激光束、525nm的FL1滤波器和635nm的复染剂滤波器。对每一分析试样来说，先分析含阴性探针的试样并确立象限位置以使少于0.01%的细胞落在右上象限。以与分析含阴性探针的试样完全相同的参数分析下一个带有阳性探针的试样。由于象限位置确立正确且等同处理该两个试样，则在右上象限内记录的细胞的任意数值（大于0.01%）记为阳性。

步骤顺序

将约500，000个H9细胞等分装入两个试管并进行如前所述的固定处理。向其中一个等分试样加入含阳性探针（28S）的杂交溶液并向另一试样加入含阴性探针（NR）的杂交溶液，探针尺寸相应于前面表1中所列的阳性探针的尺寸。在杂交和洗涤之后，进行流式细胞光度术记数。

结果

用流式细胞光度术，得到以下结果：采用探针28S-25-AL时;＞99%细胞为阳性，采用28S-21-AL探针时，0.01%-99%的细胞为阳性;且采用其它探针时，＜0.01%的细胞为阳性。而且当测量平均LFL1时，结果如表2所示。

表2

信号(平均LFLI)

长度 NR 28S 折叠差

6 .322 .370 1.1

8 6.4 .441 负

10 .422 .3 .70

12 .321 .231 .72

15 .327 .373 1.1

18 .407 .339 .83

21 .281 .616 2.2

25 .3 50.0 168

实施例2

证实制备用在“重叠”的DNA对生链的25碱基低聚物提高了线型信号的强度。

细胞制备

使带有附加染色体18（XX+18）的细胞系生长为会合的单细胞层后用胰蛋白酶消化，再用细胞旋转法使近5，000个细胞沉降到干净的载玻片上。

探针制备

用于列在下表3及图1中的25碱基合成寡核苷酸探针的序列得自于用于染色体18上的α着丝粒重复DNA序列的公开序列。

表3

探针序列

命名

H18-10 ACTCTACACACATGAGTGTGATTCT

H18-11 CTTAACTTGGTGGCAAAACTTCCTC

H18-10-OL CTCAGAACTTATTTGAGATGTGTGT

H18-10-OR ACTCACACTAAGAGAATTGTTCCAC

H18-11-OR CGTTTTGAAGGAGCAGTTTTGAAAC

探针合成和标记

合成寡脱氧核苷酸（以用推荐的A.B.I.试剂的380B型应用生物系统DNA合成仪进行），并在最后阶段将氨己基衔接物连接到5′端的磷酸盐上。随后将5′-氨己基寡脱氧核苷酸偶联到源于Clontech的碱性蕊香红染料上并以采用基线810层析操作装置的Waters HPLC法将其纯化。

杂交

对杂交过程来说，向沉积在载玻片上的细胞加入20-25μl由30%甲酰胺、5X SSC、0.1M磷酸钠缓冲剂（pH7.4）、100μg/ml低分子量变性鲑精子或鲱精子DNA、5%（v/v）Triton X-100、15X Ficoll/PVP、0.4M异硫氰酸鈲、10mMDTT和0.025M EDTA构成杂交混合物，并以2.5μg/ml的浓度加入探针。将该载玻片在一恒温箱中于85℃下放置15分钟来同时进行变性和杂交。

洗涤

杂交反应后适当进行洗涤对于消除由探针的非特性结合造成的本底是必须的。杂交后，将载玻片置于一柯普林缸中并向其中加入100ml组成为0.1X SSC.0.4M异硫氰酸鈲和0.1%TritonX-100的洗涤液。搅拌该溶液并保持该溶液2分钟。去除这一洗涤液并加入其组成为0.1X SSC和0.1% Triton X-100的第二洗涤液。将溶液搅拌5分钟并倒出。然后使用15μl含溶于50%甘油中0.1%的1，4-苯二胺抗褪色剂和1μg/ml Hoechst（33258）的封固溶液。

荧光检测

在一有荧光能力的Olympus BH10显微镜上用Kodak Ektachrome EES-135（PS 800/1600）胶片拍显微照片，曝光，并以1600ASA推进。始终用20秒的曝光时间，以便使所拍的全部显微照片可相互直接比较。

结果

视测该玻片可以看出，用所有探针获得的信号强度约为单用有意义链探针或单用反意义链探针所获信号强度的两倍。

实施例3

这一实施例表明，当有第二个25节低聚物杂交于DNA的对生链时，25碱基低聚物可有效杂交于DNA的一个链。设计探针的使得制得的用来检测DNA的一个链的探针与设计为检测DNA的另一链的探针重叠12-13碱基。见图2，说明了探针结构以及探针向其靶杂交的方式。

细胞制备

这一实施例采用二个细胞系。

1.HTB31“C-33A”为取自颈癌活组织检查的人体颈癌衍生细胞系（J.National Cancer Institute 32：135-148，1964）且不含有人体乳头状瘤病毒，其用作阴性对比物。

培养基：带有非必需氨基酸、丙酮酸钠、10%胎牛血清的Eagles MEM。

2.CCL1550“CAski”为含有结合入其染色体组的HPV16的400-500个复制品的人体颈癌细胞系（Science196：1456-1458，1977），其用作阳性对比物。

培养基：带有L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI 1640。

使两个细胞系的细胞在含5%CO₂的100ml培养烧瓶中生长会合。将其在1X PBS中漂洗一次。向该细胞加入2ml在0.02EDTA中含0.25%Trypsin的溶液。使其在37℃下保温5分钟，轻缓排液以沉积细胞。向这些细胞加入10ml各自的培养基。然后使5×10³个细胞在700rpms下旋转7分钟置于洁净载玻片上并搁置至风干。向这些细胞加入20μl乙醇/甲醇（3∶1）。然后使其风干。

探针制备

后面图1中所列的命名为HPV16-426-436和HPV16-501-512的25碱基合成寡核苷酸探针得自于HPV16型公开序列且可通过Genetic Sequence Data Bank（GenBank，Version 69.0）引入。

探针合成和标记

合成寡脱氧核苷酸（以用推荐的A.B.I.试剂的380B型应用生物系统DNA合成仪进行），并在最后阶段将一氨己基衔接物连接于5′端磷酸盐。然后将5′-氨己基寡脱氧核苷酸偶联于源于Clontech的碱性蕊香红染料，并以采用基线810层析操作装置的Waters HPLC法将其纯化。

杂交

在杂交过程中，向该载玻片加入20μl组成为21%PEG、25%甲酰胺、5X SSC、1mg/ml鲑精子DNA、15X Ficoll/PVP、0.4M异硫氰酸鈲、50mM DTT、5%Triton X-100、50mM EDTA、50mM Na₂PO₄的杂交混合物和浓度为0.06μg/μl的探针。加上盖玻片并将载玻片热至95℃5分钟，使其冷至42℃并在该温度下保温25分钟。

洗涤

杂交后，将玻片置于一柯普林缸内，并向其中加入100ml组成为0.1X SSC、0.4M异硫氰酸鈲和1% Triton X100的洗涤液。搅拌该溶液并保持这一溶液2分钟。去除该洗涤液并加入组成为0.1X SSC和0.1% Triton X100的第二洗涤液。搅拌这一溶液1分钟并将洗涤液倾除，且重复2次最后的洗涤过程。洗涤之后，加入8μl Antifade/Hoechst复染剂。用盖玻片盖住载玻片，再在荧光显微镜下观察。

荧光检测

在具有荧光能力的Olympus BH10显微镜上用Kodak Ektachrome EES-135（PS 800/1000）胶片拍摄显微照片，曝光，并以1600ASA推进。始终用20秒曝光时间，以使所拍的全部显微照片可彼此直接进行对比。

用细胞系C-33A和Caski来测定用导向DNA的一个链的探针与用导向双链（“交叉重叠”探针）所得信号之间的强度差。

表4中的结果表明，在杂交溶液中，当使用有意义链或反意义链探针之一的12低聚物时，信号强度为采用双链探针所得强度的一半。

表4

细胞探针标记 #低聚物结果(强度)

C-33A 有意义 FITC 12 -

Caski 有意义 FITC 12 ++

C-33A 反意义 FITC 12 -

Caski 反意义 FITC 12 ++

C-33A 有意义和反意义 FITC 24 -

Caski 有意义和反意义 FITC 24 ++++

实施例4

证实在所用的杂交条件下，25碱基低聚物杂交而6-12碱基低聚物不杂交。

细胞制备

用旋转细胞法使得自正常男性人供体的近5000个白血细胞沉积在载玻片上。

探针制备

下面所列出的命名为HYR7的用于25碱基合成寡核苷酸探针的序列取自用于Y染色体上α-着丝粒重复DNA序列的公开序列。还制备了由这些25碱基低聚物衍生的12碱基、10碱基、8碱基和6碱基低聚物，如下面表5中所示。

表5

探针

命名序列

HYR-7-25 GAGTCGATTTTATTGCATTAGATTC

HYR-7-15 GAGTCGATTTTATTG

HYR-7-12 GAGTCGATTTTA

HYR-7-10 GAGTCGATTT

HYR-7-8 GAGTCGAT

HYR-7-6 GAGTCG

探针合成和标记

合成寡脱氧核苷酸（以用推荐的A.B.I试剂的380B型应用生物系统DNA合成仪进行），且在最后阶段将一氨己基衔接物连接于5′端磷酸盐。然后将5′-氨己基寡脱氧核苷酸偶联于得自Clontech的碱性蕊香红染料并通过采用基线810层析操作装置的Waters HPLC法将其纯化。

杂交

在杂交过程中，向沉降在载玻片上的细胞加入20-25μl组成为30%甲酰胺、5X SSC、0.1M磷酸钠缓冲剂（pH7.4）、100μg/ml低分子量变性鲑精子或鲱精子DNA、5%（v/v）Triton X-100、15XFicoll/PVP、0.4M异硫氰酸鈲、10mM DTT、和0.025M EDTA的杂交混合物并以2.5μg/ml的浓度加入探针。通过将该载玻片置于一恒温箱中于85℃保温10分钟来同时进行变性与杂交作用。

洗涤

由于探针的非特性结合，杂交反应后为除去本底进行适宜的洗涤是必要的。杂交后，将玻片置于其中加有100ml洗涤溶液的科普林缸中，该溶液的组成为0.1X SSC和0.4M异硫氰酸鈲，以及0.1%Triton X-100。搅拌并保持该溶液2分钟。除去该洗涤溶液，再加入由0.1X SSC和0.1%Triton X-100组成的第二洗涤溶液。搅拌该溶液5分钟并倒出。然后使用15μl含0.1%在50%甘油中的1，4-苯二胺抗退色剂和1μg/ml Hoechst（33258）的封固溶液。

荧光检测

在具有荧光能力的Olympus BH10型显微镜上，使用Kodak Ektachrome EES-135（PS800/1600）胶片进行显微照相，曝光并以1600ASA按动处理。始终使用20秒曝光时间，以便能全部被摄显微照片之间直接进行比较。

结果

结果表明，用HYR-7-15和HYR-7-25探针而不使用任何其它探针HYR-7-12，HYR-7-10，HYR7-8，以及HYR-7-6时发现有可检测的杂交（例如参看图3a和3b）。

实施例5

在所用杂交条件下，验证25-碱基低聚物杂交而6-12-碱基低聚物不杂交

制备细胞和DNA及南方印迹

细胞株（GM02504G，Coriell Inst.of Med.Research，Camden NJ）以单细胞层的形式生长并被胰蛋白酶消化。DNA用Maniatis等人的方法基本分离（Molecular Cloning，T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1982），并在Maniatis等人所述的条件下，使用限制性内切酶Bam H1和EcoR1消化至完全。然后每10μg被消化的DNA的等分样由2mm宽的槽缝通过1.25%的琼脂糖凝胶电泳。然后经电泳分级的DNA使用南方步骤被固定在硝化纤维素滤纸上（参看Maniatis等人所述）。

制备探针

下列被命名为HYR7的25碱基合成的寡核苷酸探针的序列得自Y染色体上阿尔法着丝粒重复DNA序列的公开序列。由这些25碱基低聚物衍生的12碱基，10碱基，8碱基和6碱基低聚物也如下表6所示而制备。

表6

探针

命名序列

HYR-7-25 GAGTCGATTTTATTGCATTAGATTC

HYR-7-12 GAGTCGATTTTA

HYR-7-10 GAGTCGATTT

HYR-7-8 GAGTCGAT

HYR-7-6 GAGTCG

探针合成和标记

上述寡脱氧核苷酸使用Applied Biosystems DNA Synthesizer Model 380B，并使用推荐的A.B.I.试剂合成，并使用基线810层析工作装置通过Waters HPLC法纯化之。

然后使用购自Boehringer Mannheim Biochemical（BMB）的末端标记药盒，并使用BMB推荐的步骤在3′末端用地谷新配基对探针作末端标记。

杂交

将滤纸裁成尺寸约10cm×2cm，并在预杂交溶液中于65℃培育3小时，继而在含有末端标记的寡核苷酸探针的杂交溶液中于56℃培育过夜。

杂交混合物的组成为：30%甲酰胺，5X SSC，0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.4），100μg/ml低分子量的变性鲑或鲱精子DNA，5%（v/v）Triton X-100，15X Ficoll/PVP，0.4M异硫氰酸鈲，10mM DTT，以及0.025M EDTA，以2.4μg/ml（微克/毫升）的浓度加入探针。

洗涤

杂交后，将滤纸洗涤，阻断，平衡并按BMB原始记录与抗抗地谷新配基/碱性磷酸酶结合体反应，并在基质中浸渍（Iumipos 530，BMB）。然后将滤纸曝光到X射线胶片上，并使胶片显影。

结果

结果表明，用HYR-7-25探针，而不用任何其它探针HYP-7-12，HYR-7-10，HYR-7-8，和HYR-7-6时，发现有可检测的杂交。

实施例6

使用合成的寡核苷酸作为杂交靶子DNA双链的探针

本实施例证实了将低聚物制备到DNA靶子的双链上，并且其结果可通过流式细胞光度术控制。它还证实了对双DNA链的杂交能力使得人们能同时估计单个细胞中DNA和RNA的量。

制备细胞

在以下试验中使用H9细胞株。将被培养的细胞用无核酸酶磷酸盐缓冲的盐水（PBS）洗涤，并以导致明显分离细胞的浓度置于单细胞悬浮液中。使细胞离心沉降为积片并将上清液排出。将该细胞重新悬浮在40%乙醇，50%PBS以及10%冰醋酸中并在4℃放置12-16小时。固定后，离心该细胞以去除固定剂，然后在1X PBS中洗涤一次并重新悬浮在2X SSC中，该细胞应立即使用。

制备探针

用作探针的HIV序列通过GenBank，复本69.0接收，将其按图2对HPV序列所述切成30mers制备成探针。这种设计导致15碱基的“重叠”区域。

探针名称 GenBank位置名称荧光标记分子探针,Inc.Cat#

HIV-有意义链 HUMHB 102 FITC 1-3

HIV-反义链 HUMHB 102 碱性蕊香红

衍生物 T488

探针合成与标记

将上述序列切割成30碱基寡核苷酸，并使用DNA合成器（Applied Biosystem DNA Synthesizer，Model 380B）和推荐的ABI试剂合成为硫代磷酸盐寡核苷酸。然后使多硫化的寡核苷酸偶联到荧光染料上并通过柱层析法和HPLC法纯化。使用30碱基NR寡核苷酸（30mers）作为阴性对比探针。

使用Applied Biosystem（ABI）DNA Synthesizer，Model 380B和推荐的ABI试剂，将探针制成每30mer具有4个硫原子的硫代磷酸盐寡核苷酸。硫原子的配置如下：第1个在探针极端的5′末端，第2个在第7和第8核苷（由5′末端计数）之间，第3个在第22和第23核苷之间，而第4个在第29和第30核苷之间。然后将多硫化的寡核苷酸的硫原子按如下方式偶联到荧光染料碘乙酰胺-荧光素上（通过调整体积可合成较小的量）：将200μg无水寡核苷酸溶于100μl250mM Tris缓冲液（pH7.4），以形成第1溶液。将1mg碘乙酰胺-荧光素与100μl无水二甲基甲酰胺（即100%DMF）结合成第2溶液。将两种溶液混合在一起并摇动过夜。经过夜培育后，被标记的寡核苷酸用乙醇和3M乙酸钠使其沉淀。然后将该粗物料放在PD-10柱上以去除游离染料。然后收集所需级份。再在真空下除去液相。然后用HPLC（高性能液相层析法）纯化该粗物料。

杂交

为进行杂交步骤。向沉积片细胞中加入50μl杂交混合物，其组成为30%甲酰胺，5X SSC，0.16M磷酸钠缓冲液（pH7.4），1μg/μl剪切的DNA，3%（v/v）Triton X-100，5%PEG4000，25mM DTT，4M异硫氰酸鈲，15X Ficol/PVP，并以2.5μg/ml的浓度加入探针。杂交于42℃进行30分钟。

洗涤

杂交反应后为除去由于探针的非特性结合造成的本底进行适宜的洗涤是必要的。杂交后，在42℃将细胞置于其中加入10ml洗涤溶液的15ml锥形管中，该溶液的组成为0.1X SSC，0.4M异硫氰酸钣，以及0.1%的Triton。搅拌该溶液直至细胞成为单细胞悬浮液，然后以250Xg旋转5分钟。去除上清液并在42℃向沉积片中加入10ml的洗涤溶液，该溶液的组成为0.1X SSC，0.1%Triton。搅拌该溶液直至细胞成为单细胞悬浮液。以250Xg离心旋转该细胞5分钟。除去上清液并将细胞沉积片重悬浮于0.2ml复染色溶液中，该溶液为在1X PBS中含0.0025%Evans Blue的溶液。

流式细胞光度术的使用和说明

将该细胞在Beckon Dickinson制的FACSTAR^TM上进行分析。该仪器使用偶联到染料头上的5瓦特氩激光，对于FL1用525nm的带式滤波器，而对于若丹明用584nm的带式滤波器。对于每个被分析试样而言，首先分析含有阴性探针的试样，并定位四象限，使得小于0.01%的细胞落入上右象限或下右象限。下一个用HIV探针分析的试样在与以阴性探针分析的试样严格相同的参数下进行分析。由于正确地设置象位，并且两个试样已被单独处理，所以对于双链和/或mRNA而言被记录在上右象限内的任何细胞数（约0.01%）均被计为阳性。而仅对于DNA而言，被记录在下右象限内的任何细胞数（0.01%以上）被计为阳性。

构成直方图，使FL-3为Y轴，FL-1为X轴。

实施例7

杂交的替代程序

实施例4或6的程序可接续一项或多项下列改变：

1）杂交混合物附加地含有10%DMSO（v/v）和5%（v/v）维生素E;

2）不是将50μl杂交混合物加入沉积片细胞，而是将45μl杂交混合物加入2.5μl角鲨烷和2.5μl吡咯烷酮（Pyrrolidinone），并将所得50μl加入积片细胞;以及

3）对于流式细胞光度术分析，将10%（v/v）十二烷基醇加入其中悬浮有细胞的溶液，

4）将5μl 1M（1摩尔）DTT和5μl蛋白酶K（1mg/ml）溶液加入100μl杂交混合物，并且例如在42℃进行杂交反应5分钟，然后在95℃进行5分钟，再在42℃进行2分钟，以及

5）将0.05%或0.10%金精三羧酸加到杂交混合物中。

实施例8

跨越接合点的探针的一个实例是在此被称作L6-40的探针，它具有一个碱基序列（取5′至3′方向，左至右）：

TACTGGCCGCTGAAGGGCTTCTTCCTTATTGATGGTCAGC

一个缩短的L6-40探针是L6-26探针，它具有的碱基序列为

CGCTGAAGGGCTTCTTCCTTATTGAT

跨越接合点的探针的另一个实例是K28-40探针，它具有的碱基序列为

TACTGGCCGCTGAAGGGCTTTTGAACTCTGCTTAAATCCA

一个缩短的K28-40探针是K28-26探针，它具有下列碱基序列：

CGCTGAAGGGCTTTTGAACTCTGCTT

荧光染料标记的L6-26和K28-26探针，使用Applied Biosystems，Inc.DNA Synthesizer Model 380 B（使用推荐的A.B.I.试剂），并在最后阶段将一个氨己基衔接物连接到5′磷酸盐上而被制作。将5′-氨己基寡脱氧核苷酸纯化，并由分子探针偶联到荧光素衍生物（荧光素异硫氰酸盐）上，并使用基线810层析法工作装置通过Waters HPLC法纯化之。所得的是一个基本均质的探针分子的群体。制出的数量超过10ng。

该L6-26，L6-40，K28-26，以及K28-40探针将由K-562细胞（ATCC No.CCL243）杂交到mRNA分子上，该分子是由慢性骨髓性白血病患者身上取得的。

Claims

1、一种分子，它包含与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增的复本的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2、权利要求1所述分子的均质群体。

3、权利要求1所述的分子，它包含与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增的复本的核苷酸序列20至50核苷酸，但不大于20至50核苷酸互补的核苷酸序列。

4、权利要求3所述分子的均质群体。

5、权利要求3所述的分子，它包含与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增的复本的核苷酸序列20至50核苷酸，但不大于20至50核苷酸互补的核苷酸序列，所述20至50核苷酸的大约一半在所述易位接合点的一侧上，而另一半在所述接合点的另一侧上。

6、权利要求5所述分子的均质群体。

7、权利要求3所述的分子，它包含与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增复本的约26核苷酸，但不大于26核苷酸的核苷酸互补的核苷酸序列。

8、权利要求7所述分子的均质群体。

9、权利要求7所述的分子，它包括与或是易位的跨越接合点的核酸片段或是其扩增复本的约26核苷酸，但不大于26核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所术26核苷酸的约一半在所述易位接合点的一侧，而另一半在所述接合点的另一侧。

10、权利要求9所述分子的均质群体。

11、权利要求1所述的分子，它的核苷酸序列与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增复本的核酸序列完全互补。

12、权利要求11所述分子的均质群体。

13、权利要求11所述的分子，它的核苷酸序列与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增复本的核苷酸序列20至50核苷酸，但不大于20至50核苷酸完全互补。

14、权利要求13所述分子的均质群体。

15、权利要求13所述的分子，它的核苷酸序列与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增的复本的核苷酸序列20至50核苷酸，但不大于20至50核苷酸完全互补，所述20至50核苷酸的大约一半在所述易位接合点的一侧上，而另一半在所说接合点的另一侧上。

16、权利要求15所述分子的均质群体。

17、权利要求13所述的分子，它的核苷酸序列与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增的复本的约26核苷酸，但不大于26核苷酸序列完全互补。

18、权利要求17所述分子的均质群体。

19、权利要求17所述的分子，它的核苷酸序列与或是易位的跨越接合点的细胞核酸片段或是其扩增复本的约26核苷酸，但不大于26核苷酸的核酸序列完全互补，所述26核苷酸的大约一半在所述易位接合点的一侧，而另一半在所述接合点的另一侧。

20、权利要求19所述分子的均质群体。

21、权利要求1所述的分子，其中易位的跨越接合点的细胞核酸片段取自下列病型之一的细胞：白血病、淋巴瘤、肉瘤、软骨发育异常、Prader-Willi综合征、肌肉张力减退、色素失调症、横纹肌肉瘤、三体性、脊髓发育不良、不应性贫血、癌、恶性组织细胞增多病、Jacobsen综合征、神经上皮瘤、骨髓增生紊乱、平衡的X-常染色体、Beckwith-Wiedermann综合征、骨瘤，以及内分泌发育异常。

22、权利要求15所述的分子，其中易位的跨越接合点的细胞核酸片段取自下列病型之一的细胞：白血病、淋巴瘤、肉瘤、软骨发育异常、Prader-Willi综合征、肌内张力减退、色素失调症、横纹肌肉瘤、三体性、脊髓发育不良、不应性贫血、癌、恶性组织细胞增多病、Jacobsen综合征、神经上皮瘤、骨髓增生紊乱、平衡的X-常染色体、Beckwith-Wiedermann综合征、骨瘤，以及内分泌发育异常。

23、权利要求19所述的分子，其中易位的跨越接合点的细胞核酸片段取自下列病型之一的细胞：白血病、淋巴瘤、肉瘤、软骨发育异常、Prader-Willi综合征、肌肉张力减退、色素失调症、横纹肌肉瘤、三体性、脊髓发育不良、不应性贫血、癌、恶性组织细胞增多病、Jacobsen综合征、神经上皮瘤、骨髓增生紊乱、平衡的X-常染色体、Beckwith-Wiedermann综合征、骨瘤、以及内分泌发育异常。

24、权利要求12的群体，其中每个分子还包括报导物部份。

25、权利要求14的群体，其中每个分子还包括报导物部份。

26、权利要求16的群体，其中每个分子还包括报导物部份。

27、权利要求26的群体，其中报导物部份是荧光部份。

28、权利要求18的群体，其中每个分子还包括报导物部份。

29、权利要求20的群体，其中每个分子还包括报导物部份。

30、权利要求29的分子，其中报导物部份是荧光部份。