CN108676786B - 一种地生弯颈霉发酵生产脂肪酶的培养基及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种地生弯颈霉发酵生产脂肪酶的培养基及其培养方法。该产酶发酵培养基组成为：乳化芥花油2％(w/v)，α‑乳糖2％(w/v)，胰蛋白胨4％(w/v)，MnSO4·H2O 0.1％(w/v)，NH4NO30.1％(w/v)，pH＝5‑10，其余为水。与现有技术相比，本发明提供的发酵方法有条件温和，易于控制；提供用于地生弯颈霉C41‑3发酵生产脂肪酶的培养基，具有发酵时间短、脂肪酶活力高的优点。本发明摸索到的发酵培养条件，使酶活力从基础发酵培养基的102.69U/mL提高到6011.69U/mL，具有低温脂肪酶活力高等优点，有利于规模化生产，对提升该菌株的工业应用潜力有重大的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种真菌发酵产低温脂肪酶的方法，更具体地，本发明涉及一种地生弯颈霉发酵生产脂肪酶的培养基及方法。
背景技术
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)又称甘油三酯水解酶，催化三酰基甘油酯在不溶性底物与水之间界面的水解。它们本质上是普遍存在的，并且由各种植物，动物和微生物产生。由微生物来源的脂肪酶在其催化活性和底物特异性方面广泛多样化，微生物脂肪酶用于广泛的工业应用，如食品技术，洗涤剂，生物柴油，化学工业和生物医学科学等。
微生物脂肪酶酶解作用的pH和温度范围比动物脂肪酶的范围更宽，便于工业化生产获得高纯度酶制剂。虽然，现在有许多可用的低温脂肪酶的产生源，但只有少数微生物已被开发用于生产低温脂肪酶。低温脂肪酶的使用在降低能源成本、医疗应用、洗涤添加剂和降低工业过程中的微生物污染等多方面具有很大的潜力。
地生弯颈霉(Tolypocladium geodes)为子囊菌门(Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomy-cetes)、肉座菌目(Hypocreales)、线虫草科(Ophio-cordycipitaceae)、弯颈霉属(Tolypocladium)真菌，是喜冷真菌。地生弯颈霉为中国新纪录种，表现出高海拔分布的特点，同时是脂肪酶高产菌株。所以地生弯颈霉在脂肪酶工业化生产中具有很大的潜力。但是目前地生弯颈霉发酵培养基或培养方法产酶活性低、发酵条件苛刻，不利于大规模生产，因此，本领域亟需一种适用于地生弯颈霉产低温脂肪酶的发酵培养基及发酵方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种地生弯颈霉发酵生产低温脂肪酶的培养基及方法，该培养基发酵生产的低温脂肪酶活力高，发酵条件温和且易于控制，有利于工业化生产。
本发明采用如下技术方案，一种地生弯颈霉C41-3发酵生产脂肪酶的产酶发酵培养基包含：乳化芥花油2％(w/v)，α-乳糖2％(w/v)，胰蛋白胨4％(w/v)，MnSO4·H2O 0.1％(w/v)，NH4NO3 0.1％(w/v)，pH＝5-10，其余为水。
优选的，pH＝5，发酵温度为15-25℃，更优选15℃。
本发明同时请求保护采用上述培养基产低温脂肪酶的方法，具体步骤为：
(1)将接种量为1％的地生弯颈霉接种于种子培养基中于25℃，转速150r/min摇床培养3-4d得到发酵种子液；
(2)将发酵种子液接种于产酶发酵培养基中，产酶发酵培养基的装液量为30％，接种量为10％，于25℃，转速150r/min下摇床培养4d，得发酵液；
(3)将步骤(2)所得发酵液离心、收集上清即为粗酶液。
所述地生弯颈霉为C41-3，拉丁文学名为(Tolypocladium geodes)，所述的地生弯颈霉C41-3已提交保藏，具体保藏信息如下：
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2018年04月24日；
保藏编号：CGMCC No.15667。
地生弯颈霉菌株呈圆形辐射状生长，菌落正面平展呈现雪白色，绒毛状，致密，菌落背面通常白色，或在菌落起源附近呈深色或褐色，菌丝为白色丝状。
进一步的，所述的种子培养基组成为：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、水1000mL，pH＝5。
更为具体的，所述步骤(1)为：将种子培养基分装于三角瓶中，121℃灭菌30分钟，然后冷却；将接种量为1％的菌种接种于种子培养基中，置于摇床培养，培养条件：温度25℃，转速150r/min，培养3～4d即可得到发酵种子液；
所述步骤(2)中基础发酵培养基：乳化橄榄油20ml/L，蛋白胨40g/L，蔗糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，pH自然，其余为水。
产酶发酵培养基：乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，MnSO4·H2O1g/L，NH4NO3 1g/L，pH＝5，其余为水；
步骤(2)具体为：取基础发酵培养基按30％的装液量加入到培养容器中，121℃灭菌30分钟，冷却到常温；按10％的接种量，将发酵种子液加入到含产酶发酵培养基的培养容器中，发酵温度为25℃，pH＝5(即pH自然)，转速150r/min，发酵培养4d。
所述步骤(3)具体为：将发酵液用高速冷冻离心机于8000-10000r/min，4℃的条件下离心10min，收集上清液即为粗酶液。
本发明涉及的乳化芥花油、乳化橄榄油、乳化大豆油、乳化花生油、乳化芝麻油等油脂乳化液的制备方法具体为：将2％的聚乙烯醇溶于去离子水中，加热溶解。再将油脂加入到2％的聚乙烯醇溶液中，使用磁力搅拌器搅拌15min(每5分钟暂停一次)，至乳白色。
与现有技术相比，本发明提供的发酵方法有条件温和，易于控制；提供用于地生弯颈霉C41-3发酵生产脂肪酶的培养基，具有发酵时间短、脂肪酶活力高的优点。本发明摸索到的发酵培养条件，使酶活力从基础发酵培养基的102.69U/mL提高到6011.69U/mL，具有低温脂肪酶活力高等优点，有利于规模化生产，对提升该菌株的工业应用潜力有重大的意义。
附图说明
图1为对硝基苯酚标准曲线。
图2为不同产酶培养基对地生弯颈霉低温脂肪酶产量的影响，其中A是对比例1的培养基，B是对比例2的培养基，C是对比例3的培养基，D是对比例4的培养基，E是对比例5的培养基，F是对比例6的培养基，G是对比例7的培养基。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
(1)种子培养基
种子培养基：马铃薯200g/L、蔗糖20g/L、水1000mL，pH值自然；
将配置好的培养液分装于若干个250ml的三角瓶中，每个三角瓶装种子培养基100ml，121℃灭菌30分钟，然后冷却。
在每个装种子培养基100ml的三角瓶中接入接入3个直径为5mm菌块(接种量1％)，置于摇床培养，培养条件：温度25℃，转速150r/min，培养3～4d即可得到发酵种子液；
(2)产酶发酵培养
发酵培养基：乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，MnSO4·H2O 1g/L，NH4NO3 1g/L，pH＝5，其余为水；
取发酵培养基75ml加入到250ml的三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却到常温；
按10％的接种量，将7.5ml发酵种子液加入到含75ml发酵培养基的250ml三角瓶中，发酵温度为25℃，pH＝5，转速150r/min，发酵培养4d；
(3)油脂乳化液的制备方法
将2％的聚乙烯醇溶于去离子水中，加热溶解。再将油脂加入到2％的聚乙烯醇溶液中，使用磁力搅拌器搅拌15min(每5分钟暂停一次)，至乳白色。
(4)脂肪酶液制备
取发酵液，将发酵液用高速冷冻离心机于10000r/min，4℃的条件下离心10min，收集上清液即为粗酶液，取得粗酶液；
(5)酶活力的测定
酶活测定方法采用对硝基苯基棕榈酸酯(p-NPP)作为底物测量脂肪酶活性。将一个单位的脂肪酶定义为在37℃，pH 8.0条件下，每分钟释放出1μmol对硝基苯酚(p-NP)所需要的酶的量。
方法：溶液A：15mg p-NPP溶于5ml异丙醇中；溶液B：在45ml的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中加入0.05g阿拉伯胶和0.2ml Triton X-100。
以对硝基苯酚棕榈酸酯p-NPP为底物，将5ml的溶液A与45ml溶液B均匀混合，一个酶样品分为4只试管，分别加入混合液1.8mL，37℃预热5min。3只试管加入200μL酶样品溶液，另外1只加入200μL经煮沸变性(100℃，10min)的酶样品溶液作为对照，混合均匀。37℃水浴反应15min，取出后于波长410nm下测定吸光度值。
酶活计算公式：X＝CV/(TV′)
式中：
X—脂肪酶活力，U·m L-1；
C—对硝基苯酚浓度，μmol·mL-1；
V—反应液终体积，mL；
V′—酶液的用量，mL；
T—反应时间，min。
(6)标准曲线的制作：
| 2.0mmol/LpNP(uL) | 0 | 7.5 | 15 | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 |
| 异丙醇(uL) | 250 | 242.5 | 235 | 220 | 190 | 160 | 130 | 100 |
| 底物缓冲液(mL) | 2.25 | 2.25 | 2.25 | 2.25 | 2.25 | 2.25 | 2.25 | 2.25 |
| pNP浓度(umol/L) | 0 | 6 | 12 | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 |
在波长410nm处测定吸光度值。以OD410值为横坐标，pNP浓度为纵坐标绘制标准曲线，经处理得到的线性回归方程，y＝69.968x-0.993，R2＝0.9991，结果见图1。
对比例
改变发酵培养基的组成成分作为对比，根据标准曲线测试不同发酵培养基其组成对低温脂肪酶的产酶酶活。下述对比例1-7中涉及到的发酵种子液采用实施例1步骤(1)的方法制备。
对比例1
制作七种产酶发酵培养基作为对比：
(1)乳化橄榄油20ml/L，动物蛋白胨40g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，蔗糖20g/L，pH＝5，其余为水。
(2)乳化橄榄油20ml/L，动物蛋白胨40g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，葡萄糖20g/L，pH＝5，其余为水。
(3)乳化橄榄油20ml/L，动物蛋白胨40g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，D-果糖20g/L，pH＝5，其余为水。
(4)乳化橄榄油20ml/L，动物蛋白胨40g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，D(+)-麦芽糖20g/L，pH＝5，其余为水。
(5)乳化橄榄油20ml/L，动物蛋白胨40g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，可溶性淀粉20g/L，pH＝5，其余为水。
(6)乳化橄榄油20ml/L，动物蛋白胨40g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，α-乳糖20g/L，pH＝5，其余为水。
(7)乳化橄榄油20ml/L，动物蛋白胨40g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，糊精20g/L，pH＝5，其余为水。
将上述7种产酶发酵培养基于121℃灭菌30min。
向上述产酶发酵培养基各接入10％的发酵种子液，在25℃、150r/min的摇床中培养4d，然后测酶活。结果如图2A所示，产酶发酵培养基(2)、(6)的发酵产酶活力极显著，其中产酶发酵培养基(6)的产酶活力最高，(2)的产酶活力仅次之；其余的产酶培养基发酵产酶活力比较低，其中产酶发酵培养基(3)的发酵产酶活力最低。
对比例2
制作五种产酶发酵培养基作为对比：
(1)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，胰蛋白胨40g/L，pH＝5，其余为水。
(2)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，大豆蛋白胨40g/L，pH＝5，其余为水。
(3)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，动物蛋白胨40g/L，pH＝5，其余为水。
(4)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，牛肉膏40g/L，pH＝5，其余为水。
(5)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，酵母浸粉40g/L，pH＝5，其余为水。
将上述5种产酶发酵培养基于121℃灭菌30min。
向上述产酶发酵培养基各接入10％的发酵种子液，在25℃、150r/min的摇床中培养4d后测酶活。结果如图2B所示，产酶发酵培养基(1)使地生弯颈霉发酵酶活力更高。
对比例3
制作四种产酶发酵培养基作为对比：
(1)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，NH4NO31g/L，pH＝5，其余为水。
(2)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，尿素1g/L，pH＝5，其余为水。
(3)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，NH4Cl1g/L，pH＝5，其余为水。
(4)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1g/L，(NH4)2SO41g/L，pH＝5，其余为水。
将上述4种产酶发酵培养基于121℃灭菌30min。
向上述产酶发酵培养基各接入10％的发酵种子液，在25℃、150r/min的摇床中培养4d后测酶活。结果如图2C所示，地生弯颈霉C41-3对无机氮源(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3的利用率都是比较高，其中NH4NO3使其发酵产酶活力高达5052.35U/mL。
对比例4
制作七种产酶发酵培养基作为对比：
(1)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，CaSO4·2H2O 1g/L，pH＝5，其余为水。
(2)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，CuSO4·5H2O 1g/L，pH＝5，其余为水。
(3)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH＝5，其余为水。
(4)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，MnSO4·4H2O 1g/L，pH＝5，其余为水。
(5)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，pH＝5，其余为水。
(6)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，FeSO4·7H2O1g/L，pH＝5，其余为水。
(7)乳化橄榄油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，pH＝5，其余为水。
将上述7种产酶发酵培养基于121℃灭菌30min。
向上述产酶发酵培养基各接入10％的发酵种子液，在25℃、150r/min的摇床中培养4d后测酶活。由图2D可知，相对于未添加金属离子的发酵产酶活力来说，Fe2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+对地生弯颈霉C41-3的发酵产酶起到了促进的作用，产酶发酵培养基(1)、(2)、(4)、(6)发酵产酶活力高，其中产酶发酵培养基(4)Mn2+的促进作用最明显，高达4988.59U/mL；产酶发酵培养基(5)中Zn2+则是抑制了发酵产酶活力。
对比例5
制作四种产酶发酵培养基作为对比：
(1)α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，乳化芝麻油20ml/L，pH＝5，其余为水。
(2)α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，乳化大豆油20ml/L，pH＝5，其余为水。
(3)α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，乳化芥花油20ml/L，pH＝5，其余为水。
(4)α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O 1g/L，乳化橄榄油20ml/L，pH＝5，其余为水。
(5)α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·4H2O 1g/L，乳化花生油20ml/L，pH自然，其余为水。
将上述5种产酶发酵培养基于121℃灭菌30min。
向上述产酶发酵培养基各接入10％的发酵种子液，在25℃、150r/min的摇床中培养4d后测酶活。结果如图2E所示，地生弯颈霉在上述产酶发酵培养基作用下都产生低温脂肪酶，其中向发酵培养基中加入乳化芥花油时，发酵产酶活力最高，达到4839.33U/mL；花生油和大豆油次之，常用的橄榄油发酵产酶活力为3668.54U/mL，次于大豆油；芝麻油发酵产酶活力最低。
对比例6
制作七种产酶发酵培养基作为对比：
(1)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O1g/L，pH＝4，其余为水。
(2)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O1g/L，pH＝5，其余为水。
(3)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O1g/L，pH＝6，其余为水。
(4)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O1g/L，pH＝7，其余为水。
(5)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O1g/L，pH＝8，其余为水。
(6)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O1g/L，pH＝9，其余为水。
(7)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·H2O1g/L，pH＝10，其余为水。
将上述7种产酶发酵培养基于121℃灭菌30min。
向上述产酶发酵培养基各接入10％的发酵种子液，在25℃、150r/min的摇床中培养4d后测酶活。结果如图2F表明，在pH 5～10范围内，发酵产脂肪酶活力维持在较高水平；pH值小于5时的酶活力大幅度降低。所以地生弯颈霉C41-3发酵产脂肪酶pH范围是5～10，当pH值为5时，发酵产酶活力最高，达到6011.69U/mL。
对比例7
制作六种产酶发酵培养基作为对比：
(1)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·4H2O1g/L，pH＝5，其余为水，发酵温度为5℃。
(2)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·4H2O1g/L，pH＝5，其余为水，发酵温度为10℃。
(3)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·4H2O1g/L，pH＝5，其余为水，发酵温度为15℃。
(4)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·4H2O1g/L，pH＝5，其余为水，发酵温度为20℃。
(5)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·4H2O1g/L，pH＝5，其余为水，发酵温度为25℃。
(6)乳化芥花油20ml/L，α-乳糖20g/L，胰蛋白胨40g/L，NH4NO3 1g/L，MnSO4·4H2O1g/L，pH＝5，其余为水，发酵温度为30℃。
将上述6种产酶发酵培养基于121℃灭菌30min。
向上述产酶发酵培养基各接入10％的发酵种子液，在150r/min的摇床中培养3d后测酶活。结果如图2G所示，地生弯颈霉在以上发酵温度中，在发酵温度为15℃、20℃、25℃中的发酵产酶能力都比较高，其中在15℃下的产酶活力最高，25℃下的产酶活力仅次之；在5℃中不产酶。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
Claims (3)
1. 一种地生弯颈霉（Tolypocladium geodes ） C41-3 发酵生产脂肪酶的产酶发酵培养基， 其特征在于， 所述地生弯颈霉 C41-3 保藏编号为 CGMCC No.15667， 发酵培养基为： 乳化芥花油 2%(w/v)， α-乳糖 2%(w/v)， 胰蛋白胨4%(w/v)， MnSO4·H2O 0.1%(w/v)， NH4NO3 0.1%(w/v)， pH= 5-10， 其余为水。
2. 一种发酵生产低温脂肪酶的方法， 其特征在于， 利用权利要求 1 所述地生弯颈霉 C41-3 发酵生产， 具体包括以下步骤：
(1) 将种子培养基分装于三角瓶中， 121℃灭菌 30 分钟， 然后冷却； 将接种量为1%的菌种接种于种子培养基中， 置于摇床培养， 培养条件： 温度 25℃， 转速 150r/min，培养 3~4d 即可得到发酵种子液； 所述地生弯颈霉 C41-3 保藏编号为 CGMCC No.15667；所述的种子培养基组成为： 马铃薯 200g/L、 蔗糖 20g/L、水 1000mL， pH=5；
(2) 按 10%的接种量， 将发酵种子液加入到含产酶发酵培养基的培养容器中，发酵温度为 25℃， pH=5， 转速 150r/min 下摇床培养 4d， 得发酵液；其中，产酶发酵培养基：乳化芥花油 20ml/L， α-乳糖 20g/L， 胰蛋白胨 40g/L， MnSO4·H2O 1g/L ， NH4NO3 1g/L， pH= 5， 其余为水；
(3)将步骤(2)所得发酵液离心、 收集上清即为粗酶液。
3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述步骤（3） 具体为： 将发酵液用高速冷冻离心机于 8000-10000 r/min， 4℃的条件下离心 10min， 收集上清液即为粗酶液。
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