CN108660167A - L-草铵膦的生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L‑草铵膦的生物合成方法，包括：以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物、以2‑丙胺为氨基供体，与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶和添加剂进行生物转化反应，得到含有L‑草铵膦的转化液。其工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化；L‑草铵膦的收率达85％以上，纯化后L‑草铵膦晶体纯度达到98％以上，光学纯度为99％以上；所使用的生物催化剂催化效果好，用量少，专一高效；芦荟提取粉、乙醇和氯化钙复配作为添加剂，缩短转化时间效果明显，L‑草铵膦的收率也显著提升。
Description
技术领域
本发明涉及农药的制备方法，具体地指一种L-草铵膦的生物合成方法。
背景技术
草铵膦，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，由赫斯特公司(现德国拜耳公司)于上个世纪80年代开发生产，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，非选择性触杀型除草剂，其作为除草剂获得登记使用是1984年。2004年我国才有草铵膦原药登记，2005年我国才有产品登记。
草甘膦自广泛应用以来，抗草甘膦杂草不断增加，危害逐步加重。百草枯是一种强烈的杀灭杂草除莠剂，对人畜有很强的毒性作用。2014年7月1日，我国撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。草铵膦是世界大吨位农药品种，也是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦毒性低，较为安全，在土壤中易于降解，对作物安全，不易飘移，除草谱广，活性高，用量少，环境压力小，杀草迅速，能快速杀死100种以上的禾本科和阔叶杂草，可用水做基剂，使用安全方便，这些是该品优于其他除草剂的特点，所以这个产品在出现了众多高效超高效的产品后，依然可以畅销。
目前国内外草铵膦的合成技术路线较多，严海昌等(《农药》，2002，41(9)，46-48)做过综述报道，但各路线普遍存在反应步骤多，生产成本高的问题。拜尔公司在专利US4521348及US6359162中提出了以合成二氯甲基膦再合成甲基亚磷酸酯，经过一系列反应合成草铵膦的方法。该路线收率高、成本低，但起始路线二氯甲基膦合成原料、产物物化性质活泼，易燃易爆。合成过程处于500～600℃，如控制不稳定，容易产生极易自然的黄磷和磷化氢，危险性很大。另外，物料具有强腐蚀性，对反应设备材质选择及其加工制造工艺要求苛刻，目前国内加工制造水平难以满足生产要求。
这些方法都是制备草铵膦的方法，草铵膦为L/D混合型，其中起主要作用的是L型，D型作用仅为L型的1/8；L-草铵膦可在土壤中经微生物降解，而D-型草铵膦较难降解，最终可导致土壤板结。因此，L-草铵膦比较传统草铵膦更加高效、更低成本、更加安全。
化学合成法合成光学纯L-草铵膦，工艺步骤多，收率低，所用不对称合成试剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，不利于工业化生产，手性拆分法是通过化学合成外消旋DL-草铵膦或其衍生物，再进行异构体分离，其工艺复杂，手性拆分剂昂贵，D-型草铵膦需要重新消旋回收利用；而生物合成法具有立体选择性强、反应条件温和、收率高、成本低等显著优点。
目前，国内外用生物法合成L-草铵膦的途径大概有以下几种，α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙胺磷乙酯制备L-草铵膦，其原料中的D构型对映体衍生化后无法回收利用，增加了成本；外消旋草铵膦经磷酸二酯酶、酰化酶、和谷氨酰胺酶3个酶分步作用后，得到L-草铵膦，其需要3个酶协同作用，在实际生产中难以应用；2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸在转氨酶的作用下，生成L-草铵膦，但现有技术中所使用的氨基供体分离困难，转化时间长，效率低。
因此，研发一种能提高原料利用率、提高转化效率、缩短转化时间、降低生产成本同时易于工业化的L-草铵膦的生物合成方法显得十分必要。
发明内容
本发明所要解决的问题就是要提供一种L-草铵膦的生物合成方法，该方法在保证高立体选择性、高转化率和高得率的基础上，能提高原料利用率、缩短转化时间、降低生产成本，同时易于工业化。
为解决上述技术问题，本发明所提供的L-草铵膦的生物合成方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物、以2-丙胺为氨基供体，与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶和添加剂进行生物转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。
优选地，生物催化剂为来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶，来源于Vibriofluvialis的草铵膦转氨酶的基因工程菌的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；辅酶为磷酸吡哆醛。
进一步地，溶剂为缓冲溶液，缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
再进一步地，添加剂选自芦荟提取粉、柳树叶提取粉、丙酮、聚乙二醇、二甲基亚砜、乙醇和氯化钙中的一种或几种的混合物。
再进一步地，添加剂为芦荟提取粉、乙醇和氯化钙按质量比为2-5:3-8:1优选为3:5:1组成的混合物。
再更进一步地，芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6-8h，粉碎，过30目筛，得到芦荟取物粉。柳树叶提取粉的制备方法为：将鲜柳树叶破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6-8h，粉碎，过30目筛，得到柳树叶取物粉。
再更进一步地，转化体系的pH值控制为5-10，优选为6-7，控制所述转化体系的温度为20-60℃，优选为20-40℃；反应体系搅拌转速控制为150-250r/min，优选为180-220r/min。
再更进一步地，生物催化剂的浓度控制为10-30g/L，优选为15-20g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为1-5％，优选为2.5-4％。
生物催化剂为来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶的基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组草铵膦转氨酶的重组草铵膦转氨酶基因工程菌。
将重组草铵膦转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶的基因工程菌全细胞。
本发明在生物转化过程中利用HPLC-MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产；
其二，本发明L-草铵膦的收率达85％以上，纯化后L-草铵膦晶体纯度达到98％以上，光学纯度为99％以上；
其三，本发明生物催化剂为来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶基因工程菌全细胞，催化效果好，用量少，专一高效；
其四，本发明以芦荟提取粉和氯化钙复配为添加剂，芦荟含丰富糖类、蛋白质、维生素C以及矿物质等，乙醇、氯化钙具有有助于穿透细胞，芦荟提取粉、乙醇和氯化钙复配缩短转化时间效果明显，L-草铵膦的收率也显著提升。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。
L-草铵膦的生物合成方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物、以2-丙胺为氨基供体，与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶和添加剂进行生物转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。
优选地，生物催化剂为来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶，来源于Vibriofluvialis的草铵膦转氨酶的基因工程菌的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；辅酶为磷酸吡哆醛。
进一步地，溶剂为缓冲溶液，缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
再进一步地，添加剂选自芦荟提取粉、柳树叶提取粉、丙酮、聚乙二醇、二甲基亚砜、乙醇和氯化钙中的一种或几种的混合物。
再进一步地，添加剂为芦荟提取粉、乙醇和氯化钙按质量比为2-5:3-8:1优选为3:5:1组成的混合物。
再更进一步地，芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6-8h，粉碎，过30目筛，得到芦荟取物粉。柳树叶提取粉的制备方法为：将鲜柳树叶破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6-8h，粉碎，过30目筛，得到柳树叶取物粉。
再更进一步地，转化体系的pH值控制为6-10，优选为5-7，控制所述转化体系的温度为20-60℃，优选为20-40℃；反应体系搅拌转速控制为150-250r/min，优选为180-220r/min。
再更进一步地，生物催化剂的浓度控制为10-30g/L，优选为
15-20g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为1-5％，优选为2.5-4％。
生物催化剂为来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶的基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶的基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组草铵膦转氨酶的重组草铵膦转氨酶基因工程菌。
将重组草铵膦转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶的基因工程菌全细胞。
实施例1
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在1L摇瓶中进行，将30g(0.1657mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入300mL的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为18g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为11mM，再向反应体系中加入22.8g(0.2mol)的2-丙胺和0.162g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.054g的芦荟提取粉、0.09g的乙醇和0.018g的氯化钙组成的混合物。芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到芦荟提取物粉。控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
反应进行到14.9h时，高效液相色谱监测，底物完全转化，所制备的L-草铵膦的收率为94.6％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到99.6％，光学纯度为99.7％。
实施例2
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在5L烧杯中进行，将200g(1.1050mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入2L的磷酸盐缓冲溶液(以磷酸氢二钠和磷酸二氢钠为缓冲对的生理盐溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为18g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为11.05mM，再向反应体系中加入228g(2mol)的2-丙胺和1.08g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.36g的芦荟提取粉、0.6g的乙醇和0.12g的氯化钙组成的混合物。芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到芦荟提取物粉。控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为30℃；机械搅拌转速控制为200r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
反应进行到15.3h时，高效液相色谱监测，底物完全转化，所制备的L-草铵膦的收率为94.2％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到99.5％，光学纯度为99.8％。
实施例3
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在5L烧杯中进行，将180g(0.9945mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入2L的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为20g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为9.945mM，再向反应体系中加入228g(2mol)的2-丙胺和1g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.5g的芦荟提取粉、0.4g的乙醇和0.1g的氯化钙组成的混合物。芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到芦荟提取物粉。控制转化体系的pH值为7，控制转化体系的温度为25℃；机械搅拌转速控制为220r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
反应进行到17.7h时，高效液相色谱监测，底物完全转化，所制备的L-草铵膦的收率为92.3％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到99.2％，光学纯度为99.6％。
实施例4
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在500mL摇瓶中进行，将18g(0.0994mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入150mL的柠檬酸盐缓冲溶液(以柠檬酸和柠檬酸钠为缓冲对的溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为15g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为13.3mM，再向反应体系中加入22.8g(0.2mol)的2-丙胺和0.09g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.03g的芦荟提取粉、0.05g的乙醇和0.01g的氯化钙组成的混合物。芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到芦荟提取物粉。控制转化体系的pH值为6，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为250r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
反应进行到16.5h时，高效液相色谱监测，底物完全转化，所制备的L-草铵膦的收率为90.4％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到98.7％，光学纯度为99.5％。
实施例5
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在1L摇瓶中进行，将45g(0.1657mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入300mL的甘氨酸缓冲溶液(以甘氨酸和氢氧化钠为缓冲对的溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为30g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为11mM，再向反应体系中加入22.8g(0.2mol)的2-丙胺和0.45g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.0818g的芦荟提取粉、0.3273g的乙醇和0.0409g的氯化钙组成的混合物。芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到芦荟提取物粉。控制转化体系的pH值为10，控制转化体系的温度为60℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
反应进行到16.8h时，高效液相色谱监测，底物完全转化，所制备的L-草铵膦的收率为91.6％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到97.8％，光学纯度为99.5％。
实施例6
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在1L摇瓶中进行，将24g(0.1326mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入300mL的柠檬酸盐缓冲溶液(以柠檬酸和柠檬酸钠为缓冲对的溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为10g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为8.8mM，再向反应体系中加入22.8g(0.2mol)的2-丙胺和0.03g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.0115g的芦荟提取粉、0.0139g的乙醇和0.0046g的氯化钙组成的混合物。芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到芦荟提取物粉。控制转化体系的pH值为5，控制转化体系的温度为20℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为150r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
转化时间为19.2h，所制备的L-草铵膦的收率为89.1％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到98.0％，光学纯度为99.3％。
对比例1
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在1L摇瓶中进行，将30g(0.1657mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入300mL的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为18g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为11mM，再向反应体系中加入22.8g(0.2mol)的2-丙胺进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
转化时间为27.2h，所制备的L-草铵膦的收率为80.4％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到96.9％，光学纯度为99.1％。
对比例2
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在1L摇瓶中进行，将30g(0.1657mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入300mL的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为18g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为11mM，再向反应体系中加入22.8g(0.2mol)的2-丙胺和0.162g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.162g的芦荟提取粉。芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥7h，粉碎，过30目筛，得到芦荟提取物粉。控制转化体系的pH值为6，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
转化时间为23.9h，所制备的L-草铵膦的收率为86.3％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到97.2％，光学纯度为99.5％。
对比例3
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在1L摇瓶中进行，将30g(0.1657mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入300mL的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为18g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为11mM，再向反应体系中加入22.8g(0.2mol)的2-丙胺和0.162g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.162g的乙醇。控制转化体系的pH值为6，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
转化时间为24.6h，所制备的L-草铵膦的收率为83.9％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到96.8％，光学纯度为99.2％。
对比例4
L-草铵膦晶体的制备过程，包括如下步骤：
L-草铵膦的生物合成方法，反应在1L摇瓶中进行，将30g(0.1657mol)的2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸底物加入300mL的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)中，控制含草铵膦转氨酶的工程菌全细胞的浓度为18g/L，控制磷酸吡哆醛的浓度为11mM，再向反应体系中加入22.8g(0.2mol)的2-丙胺和0.162g添加剂进行转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。其中，添加剂为0.162g的氯化钙。控制转化体系的pH值为6，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min。反应过程中，通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行。
转化时间为25.1h，所制备的L-草铵膦的收率为84.7％，对含有L-草铵膦的转化液进行纯化，纯化后，L-草铵膦晶体纯度达到97.6％，光学纯度为99.3％。
实施例1、实施例2与对比例1对比可知，当转化体系中加入添加剂时，转化时间明显缩短，L-草铵膦的收率也显著提升，纯化后的L-草铵膦晶体的品质也显著改善。实施例1、实施例2与对比例1、对比例2、对比例3对比可知，添加剂为芦荟提取粉、乙醇和氯化钙复配组成的混合物与单一添加芦荟提取粉、乙醇或氯化钙相比，转化时间明显缩短，L-草铵膦的收率也显著提升，纯化后的L-草铵膦晶体的品质也显著改善，芦荟提取粉、乙醇和氯化钙复配添加达到了意想不到的技术效果。
本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。
<110> 武汉茵茂特生物技术有限公司
<120> L-草铵膦的生物合成方法
<160> 1
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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Claims (10)
1.一种L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物、以2-丙胺为氨基供体，与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入生物催化剂、辅酶和添加剂进行生物转化反应，得到含有L-草铵膦的转化液。
2.根据权利要求1所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，所述生物催化剂为来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶，所述来源于Vibrio fluvialis的草铵膦转氨酶的基因工程菌的编码基因是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述辅酶为磷酸吡哆醛。
3.根据权利要求2所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，所述的溶剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
4.根据权利要求3所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，所述添加剂选自芦荟提取粉、柳树叶提取粉、丙酮、聚乙二醇、二甲基亚砜、乙醇和氯化钙中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求4所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，所述添加剂为芦荟提取粉、乙醇和氯化钙按质量比为2-5:3-8:1组成的混合物。
6.根据权利要求5所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，所述添加剂为芦荟提取粉、乙醇和氯化钙按质量比为3:5:1组成的混合物。
7.根据权利要求5或6所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，所述芦荟提取粉的制备方法为：将鲜芦荟破碎、榨汁，汁渣分离，将所得渣在80℃下干燥6-8h，粉碎，过30目筛，得到芦荟取物粉。
8.根据权利要求7所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，转化体系的pH值控制为5-10，控制所述转化体系的温度为20-60℃；反应体系搅拌转速控制为150-250r/min。
9.根据权利要求7所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，所述生物催化剂的浓度控制为10-30g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为1-5％。
10.根据权利要求8或9所述的L-草铵膦的生物合成方法，其特征在于，转化体系的pH值控制为6-7，所述转化体系的温度控制为25-40℃；反应体系搅拌转速控制为180-220r/min，所述生物催化剂的浓度控制为15-20g/L；所述添加剂与生物催化剂的质量比控制为2.5-4％。
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