CN108611324A - 一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白的真核细胞系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白His‑T1R2和FLAG‑T1R3的真核细胞系，(1)该真核细胞系稳定携带编码带有His标签的人源甜味受体蛋白T1R2的核酸序列和编码带有FLAG标签的人源甜味受体蛋白T1R3的核酸序列；(2)该真核细胞系由人胚胎肾细胞HEK293制备得到。本发明还公开了所述真核细胞系的制备方法和在所述真核细胞系中表达带有HA标签的重组人源嵌合体蛋白G15‑gustducin44的制备方法。本发明可在细胞水平检测外源甜味分子的“甜度”，建立了一种可以快速、高效、灵敏检测甜味物质的方法。

Description

一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白的真核细胞系及其制 备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核细胞系及其制备方法。

背景技术

味觉在人们的生活中占有很重要的作用，而甜味是人们最喜欢的味道之一，它与人们的生活息息相关，可以预示着食物中含营养物质，同时还能增加食物的口感和味道，进而影响人们对食物的选择。摄入甜味食物可以给食用者带来愉悦，但同时部分碳水化合物类甜味剂含有高能量，过度的摄入则会引起肥胖及其随之而来的相关疾病，所以甜味化学感受分子机制的深入研究对于食品工业的发展及食用者的健康具有十分重要的影响和意义。而选取人源甜味受体基因作为研究对象可以更加直观地反应出甜味刺激对人的影响。

人的甜味受体是由T1R2和T1R3组成的异源二聚体蛋白复合体 (T1R2/T1R3)，每一个受体都包含了一个T1R2亚基及一个T1R3亚基。T1R2 和T1R3都是C类G蛋白偶联受体，拥有7个跨膜结构域。T1R2由839个氨基酸组成，翻译该蛋白的基因组DNA长20063bp，含有6个外显子，编码区核酸序列为2521bp；T1R3蛋白含852个氨基酸，翻译该蛋白的基因组DNA为3433bp，含有6个外显子，编码区核酸序列为2559bp。

甜味信号的传导需要下游的G蛋白、PLCβ2及TRPM5等相关蛋白的介导，进而引起下游PKC、Ca²⁺、PKA等相关分子的活化。同时研究还发现甜味受体 T1R2和T1R3可以通过结合GLP-1来控制体内葡萄糖的平衡和葡萄糖转运子的激活。这些相关分子是可供检测的下游信号分子。

关于甜味受体的检测，常规方法包括免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)、蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)等方法，这些方法能够准确检测到甜味受体蛋白T1R2和T1R3在细胞内的表达定位和表达水平。

本发明获得了稳定共表达重组人源甜味受体蛋白His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的人胚胎肾细胞HEK293，并且此真核细胞系能够对甜味物质响应，可以用于甜度测定。

发明内容

本发明第一方面公开了一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白His-T1R2 (序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核细胞系(保藏编号为CCTCC NO:C2017260；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期为：2017 年11月15日；分类命名为：人源细胞，拉丁文名称为“Homo sapiens,human”。保藏单位于2017年11月26检测完毕，结果为存活。见附件存活证明)，

(1)该真核细胞系稳定携带编码带有His标签的人源甜味受体蛋白T1R2 (简称为His-T1R2，序列见SEQ ID No.2)的核酸序列(序列见SEQ ID No.1) 和编码带有FLAG标签的人源甜味受体蛋白T1R3(简称为FLAG-T1R3，序列见SEQ ID No.6)的核酸序列(序列见SEQID No.5)；

(2)该真核细胞系由人胚胎肾细胞HEK293制备得到。

本发明第二方面公开所述的真核细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)构建表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)的重组质粒；构建表达 FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的两种重组质粒共同转染进入真核细胞中，并通过药物抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆体，再通过蛋白质免疫印迹技术检测，优选出能够同时表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3 (序列见SEQ ID No.6)的细胞克隆体；

(3)将步骤(2)中得到的细胞克隆体扩增培养，即得到稳定共表达His-T1R2 (序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核细胞系。

优选地，步骤(1)中所述的两种重组质粒能够在真核细胞中分别表达 His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)；

步骤(2)中所述的转染方法为电穿孔转染法，所述真核细胞为人胚胎肾细胞HEK293，所述抗性筛选所用的药物为G418，所述G418为遗传霉素，为一种氨基糖苷类抗生素。

优选地，所述表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)重组质粒的制备方法的步骤为：

(1)将编码人源甜味受体蛋白T1R2的编码区核酸序列与编码His标签的核酸序列连接，得到表达His-T1R2的核酸序列(序列见SEQ ID No.1)；

(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)的重组质粒。

优选地，步骤(2)中所述的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。

优选地，所述表达FLAG-T1R3重组质粒的制备方法的步骤为：

(1)将编码人源甜味受体蛋白T1R3的编码区核酸序列与编码FLAG标签的核酸序列连接，得到表达FLAG-T1R3的核酸序列(序列见SEQ ID No.5)；

(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的重组质粒。

优选地，步骤(2)中所述的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。

本发明第三分部公开了一种在真核细胞中同时表达His-T1R2(序列见SEQ IDNo.2)、FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)和带有HA标签的重组人源嵌合体蛋白G15-gustducin44(序列见SEQ ID No.12)的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)构建表达带有HA标签的重组人源嵌合体蛋白G15-gustducin44(简称为HA-G15-gustducin44，序列见SEQ ID No.12)的重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染进入稳定共表达His-T1R2(序列见SEQ IDNo.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核细胞系中，在真核细胞中同时表达三种重组人源蛋白，即His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)、 FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)和HA-G15-gustducin44(序列见SEQ ID No.12)。

优选地，步骤(1)中所述的重组质粒能够在真核细胞中表达 HA-G15-gustducin44(序列见SEQ ID No.12)；

步骤(2)中所述的转染方法为电穿孔转染法，所述的真核细胞系为权利要求1所述的真核细胞系。

优选地，所述表达HA-G15-gustducin44重组质粒的制备方法的步骤为：

(1)将编码人源嵌合体蛋白G15-gustducin44的核酸序列与编码HA标签的核酸序列连接，得到表达HA-G15-gustducin44的核酸序列(序列见SEQ ID No.11)；

(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达HA-G15-gustducin44(序列见SEQ ID No.12)的重组质粒。

优选地，步骤(2)中所述的真核表达载体为pLVX-Puro。

按照本发明的第一个方面，提供了一种能够在真核细胞系中表达重组人源甜味受体蛋白His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)的重组质粒，制备方法为将人源甜味受体蛋白T1R2的编码区核酸序列与编码His标签的核酸序列连接，并插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点处，得到能够在真核细胞系中表达His-T1R2重组质粒。

按照本发明的第一个方面，还提供了一种能够在真核细胞系中表达重组人源甜味受体蛋白FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核重组质粒，制备方法为将编码T1R3的编码区核酸序列与编码FLAG标签的核酸序列连接，并插入到真核表载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点处，得到能够在真核细胞系中表达 FLAG-T1R3重组质粒。

按照本发明的第一方面，提供了一种用于稳定表达His-T1R2(序列见SEQ IDNo.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核细胞系，其保藏编号为： CCTCC NO:C2017260。

按照本发明的第二方面，提供了一种在真核细胞中共表达His-T1R2(序列见SEQID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的方法。

按照本发明的第二方面提供了一种稳定表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2) 和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)真核细胞系的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将制备得到表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)的重组质粒和表达 FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的重组质粒用电穿孔转染法共转染进入人胚胎肾细胞HEK293中，并通过在细胞培养液中添加G418进行药物抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆体，所述细胞培养液为RMPI 1640，Gibco公司产品；

(2)将步骤(1)中得到的阳性细胞克隆体扩增培养，经过蛋白质免疫印迹技术检测到特异性的His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)条带，即得到稳定共表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和 FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核细胞系。

按照本发明的第三方面，提供了一种能够在真核细胞中表达 HA-G15-gustducin44(序列见SEQ ID No.12)的重组质粒，所述编码G15-gustducin44嵌合体蛋白的核酸序列与编码HA标签的核酸序列连接，并插入到真核表达质粒pLVX-Puro的多克隆酶切位点处，得到表达 HA-G15-gustducin44(序列见SEQ ID No.12)的重组质粒，所述HA标签的氨基酸序列YPYDVPDYA。

按照本发明的第三方面，提供了一种在真核细胞中同时表达His-T1R2(序列见SEQID No.2)、FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)和HA-G15-gustducin44 (序列见SEQ IDNo.12)的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

将制备得到的表达HA-G15-gustducin44(序列见SEQ ID No.12)的重组质粒用电穿孔转染法转染进入稳定表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和 FLAG-T1R3(序列见SEQID No.6)的真核细胞系(保藏编号为CCTCC NO:C2017260)中，在真核细胞中同时表达三种重组蛋白，即His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)、FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)和HA-G15-gustducin44 (序列见SEQ ID No.12)。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用电穿孔转染法建立共表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2) 和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核细胞系，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平，两种重组蛋白在细胞膜上共表达；

(2)本发明构建的表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)、FLAG-T1R3(序列见SEQ IDNo.6)和HA-G15-gustducin44(序列见SEQ ID No.12)的重组质粒中，除了分别包含插入编码T1R2、T1R3和G15-gustducin44蛋白的核酸序列外，还分别对应含有编码His标签序列、FLAG标签序列和HA标签序列的核酸序列，所述标签序列都有商业化抗体提供，便于后期应用蛋白质免疫印迹技术检测蛋白表达；

(3)本发明提供的稳定共表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和 FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)的真核细胞系能够在细胞膜上大量表达重组甜味受体蛋白His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ ID No.6)，可以通过检测细胞内钙离子的浓度来评估真核细胞系中甜味受体T1R2/ T1R3的活化水平，所述方法易标准化、重复性好；

(4)本发明提供了共表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)、FLAG-T1R3 (序列见SEQID No.6)的真核细胞系，通过检测所述细胞系中甜味受体T1R2/ T1R3的活化水平来，即通过检测添加待测物后所述细胞系的胞内钙离子浓度变化，来评估待测物的甜度，建立了一种可以快速、高效筛选糖分子甜度的方法，为食品甜度的检测、糖尿病的治疗、甜味拮抗剂和激动剂的筛选与研制提供一种技术方法，可以用于食品工业、医学及药学等领域。具有较好的应用前景。

(5)本发明细胞系的制备方法简单、成本低廉、准确性高，能够高通量、低成本、准确的筛选不同甜度的糖分子激动剂，具有很好的稳定性和可靠性，有很好的市场前景。

附图说明

图1和图2是稳定共表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3 (序列见SEQID No.6)细胞系克隆的蛋白质免疫印迹检测结果(分别应用T1R2 特异性抗体和T1R3特异性抗体)；

图3是稳定共表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ IDNo.6)细胞系克隆的免疫荧光检测结果(应用T1R2特异性抗体和T1R3 特异性抗体)；

图4是稳定共表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见SEQ IDNo.6)细胞系克隆免疫荧光检测结果(应用His特异性抗体和FLAG 特异性抗体)；

图5是在共表达His-T1R2(序列见SEQ ID No.2)和FLAG-T1R3(序列见 SEQ IDNo.6)细胞系克隆中转染表达G15-gustducin44嵌合体蛋白的蛋白质免疫印迹检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3真核细胞系的构建及检测。

1.His-T1R2重组质粒的构建及检测

1.1.编码His-T1R2的核酸序列设计及制备

以人源T1R2基因编码区核酸序列为模板，设计用于编码His-T1R2(SEQ ID No.2)的特异性正向引物T1R2-F(SEQ ID No.3)和特异性反向引物T1R2-R(SEQ ID No.4)。T1R2-F的核酸序列中在起始密码子前加入Hind III酶切位点和保护性碱基，并在起始密码子后连接编码His标签的核酸序列，再连接T1R2基因编码区核酸序列。T1R2-R的核酸序列中在T1R2编码序列末端加有终止子、Xho I酶切位点与保护性碱基。

以人源T1R2基因的编码区核酸序列为模板，加入引物T1R2-F和T1R2-R 进行基因扩增，得到编码His-T1R2的核酸序列(序列见SEQ ID No.1)。扩增体系见表1：

表1

DNA扩增预混液	20μL
		引物T1R2-F(10μM)	2μL
引物T1R2-R(10μM)	2μL
		T1R2编码区核酸序列(0.1-1μg)	2μL
去离子水	14μL
		总体积	40μL

扩增条件为95℃预变性5min，再进行35个循环反应，最后72℃延伸5min。所述循环反应条件为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s。

基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后回收，再经Hind III和Xho I 酶切后回收，得到酶切的His-T1R2基因扩增产物。

1.2.重组质粒的构建

将真核表达载体pcDNA3.1(+)用Hind III和Xho I酶切后回收，然后与酶切的His-T1R2基因扩增产物在T4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，经核酸测序鉴定，确认插入核酸序列正确的阳性质粒即为本实施例所需的重组质粒，保存质粒。

2.FLAG-T1R3重组质粒的构建及检测

2.1.编码人源FLAG-T1R3的核酸序列设计及制备

以人源T1R3基因编码区核酸序列为模板，设计用于编码FLAG-T1R3(SEQ ID No.6)的特异性正向引物T1R3-F(SEQ ID No.7)和特异性反向引物T1R3-R (SEQ ID No.8)。T1R3-F的核酸序列中在起始密码子前加入Hind III酶切位点和保护性碱基，并在起始密码子后加入编码FLAG标签的核酸序列，后面连接T1R3 基因编码区核酸序列。T1R3-R的核酸序列中在T1R3编码末端加有终止子、Xho I酶切位点与保护性碱基。

以人源T1R3基因的编码区核酸序列为模板，加入引物T1R3-F和T1R3-R 进行基因扩增，得到编码FLAG-T1R3的核酸序列(SEQ ID No.5)。扩增体系见表2：

表2

DNA扩增预混液	20μL
		引物T1R3-F(10μM)	2μL
引物T1R3-R(10μM)	2μL
		T1R3编码区核酸序列(0.1-1μg)	2μL
去离子水	14μL
		总体积	40μL

扩增条件为95℃预变性5min，再进行35个循环反应，最后72℃延伸5min。所述循环反应条件为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s。

基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后回收，再经Hind III和Xho I 酶切后回收，得到酶切的FLAG-T1R3基因扩增产物。

2.2.重组质粒的构建

将真核表达载体pcDNA3.1(+)用Hind III和Xho I酶切后回收，然后与酶切的FLAG-T1R3基因扩增产物在T4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，经核酸测序鉴定，确认插入核酸序列正确的阳性质粒即为本实施例所需的重组质粒，保存质粒。

3.稳定表达His-T1R2和FLAG-T1R3的真核细胞系的构建及检测

3.1.表达His-T1R2和FLAG-T1R3的重组质粒共转染真核细胞HEK293

利用电穿孔方法将表达His-T1R2和FLAG-T1R3的重组质粒共同转染入真核细胞HEK293，具体步骤如下所示：

取传代的真核细胞HEK293，移除细胞培养液，所述细胞培养液为RMPI 1640，Gibco公司产品。用5mL磷酸缓冲液(10mM，pH 7.4)洗涤HEK293细胞两次，用1mL 0.25wt％的胰蛋白酶(Trypsin)消化细胞2min，加入新鲜的细胞培养液中止消化，转移细胞至15ml离心管中，180g离心5min，除去上层清液；再用 5mL磷酸缓冲液(10mM，pH 7.4)重悬细胞，180g离心5min，除去上层清液，向下层沉淀加入适量5x电转缓冲液(表3)制备悬浮细胞。配制电转溶液，体系如表4所示。

表3：5x电转缓冲液(pH＝7.4)

试剂	浓度
		K2HPO4	250mM
CH3COOK	100mM
		KOH	100mM

表4：电转溶液

溶液	体积
		表达His-T1R2重组质粒(1μg/μL)	4μL
表达FLAG-T1R3重组质粒(1μg/μL)	4μL
		5X电转缓冲液	40μL
MgSO4	8μL
		加入超纯水至总体积	200μL

取100μL细胞悬浮液加至200μL电转溶液中，轻轻混匀，室温静置10min。将300μL混合液加入电转槽按照设定程序进行电转操作，电容设定为1000μF，电压设定为260V。将转染的细胞转移至10mL新鲜细胞培养液中，混匀后加入培养皿中，转入CO₂培养箱中培养。

3.2.阳性克隆的筛选

转染后的细胞培养约48h后，在细胞培养液中加入G418，使其终浓度为 600μg/mL(所述G418为遗传霉素，为一种氨基糖苷类抗生素)。继续培养48h 后换入新的、G418终浓度为600μg/mL的新鲜细胞培养液培养细胞。每隔2天换含600μg/mL的G418的新鲜细胞培养液培养2天，重复6次。消化、收集细胞，用有限稀释法将细胞分在96孔板中，加入含600μg/mL的G418的新鲜细胞培养液，继续培养10天。挑取96孔板中由单个细胞克隆体到24孔板中，待其长到合适的数量后，传代到12孔板中。重复此过程，将细胞依次扩大培养到6 孔板、60mm培养皿、100mm培养皿，并保种。

3.3.阳性克隆体的鉴定

将阳性克隆体在100mm培养皿中培养2天，收集细胞并裂解，用蛋白质免疫印迹技术进行鉴定，以获得阳性克隆体中His-T1R2和FLAG-T1R3的表达情况。利用T1R2特异性抗体和T1R3特异性抗体，通过蛋白质免疫印迹技术检验，我们发现并挑选出His-T1R2和FLAG-T1R3共表达的阳性克隆体，继续扩大培养后保存，将该细胞系命名为HEK293-T1R2/T1R3，进行后续实验。图1所示蛋白质免疫印迹显影结果表明阳性克隆体中有His-T1R2表达，图2所示蛋白质免疫印迹显影结果表明阳性克隆体中有FLAG-T1R3表达。图1和图2中所示肌动蛋白(β-actin)在本实例用作为内参蛋白。

实施例2

免疫荧光检测His-T1R2和FLAG-T1R3甜味受体蛋白在真核细胞中的表达和定位。

1.样品的制备

通过使用免疫荧光技术，我们检测上述真核细胞系中His-T1R2和 FLAG-T1R3的表达和定位。使用新鲜细胞培养液将5-10x10⁵个稳定共表达 His-T1R2和FLAG-T1R3的HEK293细胞种植在3.5cm的培养皿中，培养皿中放置13mm的圆形盖玻片。在细胞覆盖密度达到50％-80％时，将盖玻片取出，经过含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定、含3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液封闭后，用T1R2特异性抗体(兔源)和T1R3特异性抗体(羊源)共同孵育，去除未结合抗体，最后用抗兔的二抗FITC抗体和抗鼠的二抗TRITC抗体分别孵育，去除未结合抗体，制成可用于共聚焦显微镜检测免疫荧光的样品一，所述FITC为荧光标签异硫氰酸荧光素，所述TRITC为荧光标签罗丹明。

另外使用新鲜细胞培养液将5-10x10⁵个稳定共表达His-T1R2和 FLAG-T1R3的HEK293细胞种植在3.5cm的培养皿中，培养皿中放置13mm的圆形盖玻片。在细胞覆盖密度达到50％-80％时，将盖玻片取出，经过含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定、含3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液封闭后，用His 特异性抗体(鼠源)孵育，去除未结合抗体，再用抗鼠的二抗TRITC抗体孵育，去除未结合抗体，制成可用于共聚焦显微镜检测免疫荧光的样品二。

另外使用新鲜细胞培养液将5-10x10⁵个稳定共表达His-T1R2和 FLAG-T1R3的HEK293细胞种植在3.5cm的培养皿中，培养皿中放置13mm的圆形盖玻片。在细胞覆盖密度达到50％-80％时，将盖玻片取出，经过含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液固定、含3％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液封闭后，用FLAG 特异性抗体(鼠源)孵育，去除未结合抗体，最后用抗鼠的二抗FITC抗体孵育，去除未结合抗体，制成可用于共聚焦显微镜检测免疫荧光的样品三。

2.荧光检测

将制备好的玻片倒置在共聚焦显微镜下，在明场下，用60x物镜找到细胞密度适中的观察区域，调节焦距，清晰地观测细胞样品。转换为荧光观察，根据荧光染料选择合适观测参数，图像满足要求时，尽量使用低激光强度。并通过调节 PMTHV(增强图像信号)，Gain(增强信号)和Offset(扣除背景)参数得到适合图像。然后进行荧光扫描。

在显微镜下检测样品一，结合在T1R2蛋白抗体上的FITC，在488nm激光法激发下，呈绿色荧光信号，拍摄结果如图3A；结合在T1R3蛋白抗体上的TRITC，在559nm激光法激发下，呈红色荧光信号，拍摄结果如图3B。免疫荧光成像结果表明在稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3的HEK293细胞中，His-T1R2和 FLAG-T1R3分布在细胞的质膜上。

在显微镜下检测样品二，结合在His标签蛋白抗体上的TRITC在559nm激光法激发下，呈红色荧光信号，拍摄结果如图4A；在显微镜下检测样品三，结合FLAG标签蛋白抗体上的FITC在488nm激光法激发下，呈绿色荧光信号，拍摄结果如图4B。免疫荧光成像结果表明应用His标签蛋白抗体和FLAG标签蛋白抗体可以分别观察到His-T1R2和FLAG-T1R3分布在细胞的质膜上。

实施例3

1.pLVX-Puro-HA-G15-gustducin44重组质粒的构建及检测

1.1.编码人源HA-G15-gustducin44的核酸序列设计及制备

以表达人源Gα15蛋白的编码区核酸序列(SEQ ID No.9)和表达人源 Gustducin蛋白的编码区核酸序列(SEQ ID No.10)为模板，合成编码带有HA 标签的嵌合体蛋白G15-gustducin44的核酸序列(SEQ ID No.11)，表达带有HA 标签的由人源Gα15蛋白第1位到第340位氨基酸和人源Gustducin蛋白第331 位到第374位氨基酸组成的嵌合体蛋白(简称为HA-G15-gustducin44，序列见 SEQ ID No.12)。设计用于扩增编码HA-G15-gustducin44核酸序列(SEQ ID No.11)的特异性正向引物G15-gustducin44-F(SEQ ID No.13)和特异性反向引物G15-gustducin44-R(SEQ ID No.14)。正向引物G15-gustducin44-F(SEQ ID No.13)的核酸序列中在起始密码子前加入BstB I酶切位点和保护性碱基。反向引物G15-gustducin44-R(SEQ ID No.14)的核酸序列中在G15-gustducin44编码末端加有终止子、Xba I酶切位点与保护性碱基。

以人源G15-gustducin44的编码区核酸序列为模板，加入引物 G15-gustducin44-F和G15-gustducin44-R进行基因扩增。扩增体系见下表5：

表5

DNA扩增预混液	20μL
		引物G15-gustducin44-F(10μM)	2μL
引物G15-gustducin44-R(10μM)	2μL
		G15-gustducin44编码区核酸序列(0.1-1μg)	2μL
去离子水	14μL
		总体积	40μL

扩增条件为95℃预变性5min，再进行35个循环反应，最后72℃延伸5min。所述循环反应条件为95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s。

基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后回收，再经BstB I和Xba I酶切后回收，得到酶切的G15-gustducin44基因扩增产物。

1.2.重组质粒的构建

将真核表达载体pLVX Puro用BstB I和Xba I酶切后回收，然后与酶切的G15-gustducin44基因扩增产物在T4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，经核酸测序鉴定，确认核酸序列正确的阳性质粒即为本实施例所需的重组质粒，保存质粒。

2.HA-G15-gustducin44在稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3真核细胞系中的表达及检测

2.1.表达HA-G15-gustducin44的重组质粒转染真核细胞HEK293

利用电穿孔转染法将表达HA-G15-gustducin44的重组质粒转染进入稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3的真核细胞系中，具体步骤如下所示：

取传代的稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3真核细胞，移除细胞培养液，用5mL磷酸缓冲液(10mM，pH 7.4)洗涤两次，用1mL 0.25％的胰蛋白酶(Trypsin) 消化细胞2min，加入新鲜的细胞培养液中止消化，转移细胞至15ml离心管中， 180g离心5min，除去上层清液；再用5mL磷酸缓冲液(10mM，pH 7.4)重悬细胞，180g离心5min，除去上层清液，向下层沉淀加入适量5x电转缓冲液(表 3)制备悬浮细胞。配制电转溶液，体系如下表6所示，

表6

溶液	体积
		表达HA-G15-gustducin44重组质粒(1μg/μL)	4μL
5X电转缓冲液	40μL
		MgSO4	8μL
加入超纯水至Total	200μL

取100μL细胞悬浮液加至200μL电转溶液中，轻轻混匀，室温静置10min。将300μL混合液加入电转槽按照设定程序进行电转操作，电容设定为1000μF，电压设定为260V。将转染的细胞转移至10mL新鲜细胞培养液中，混匀后加入培养皿中，转入CO₂培养箱中培养。

两天后，收取细胞样品，利用HA特异性抗体，通过蛋白质免疫印迹技术检验，检测HA-G15-gustducin44在稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3真核细胞系中的表达情况，实验结果表明通过转染，HA-G15-gustducin44能够在稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3真核细胞系中表达，如图5所示。图5中所示肌动蛋白(β-actin)在本实例用作为内参蛋白。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

附序列表：

Seq 1

编码His-T1R2的核酸序列，序列长度：2550，人工序列

Seq 2

His-T1R2蛋白氨基酸序列，序列长度：849，人工序列

Seq 3

His-T1R2正向引物，序列长度：66，人工序列

Seq 4

His-T1R2反向引物，序列长度：32，人工序列

Seq 5

编码FLAG-T1R3的核酸序列，序列长度：2592，人工序列

Seq 6

FLAG-T1R3蛋白氨基酸序列，序列长度:863，人工序列

Seq 7

FLAG-T1R3正向引物，序列长度：68，人工序列

Seq 8

FLAG-T1R3反向引物，序列长度：29，人工序列

Seq 9

编码G15的核酸序列，序列长度：1125，人体

Seq 10

编码gustducin的核酸序列，序列长度：1065，人体

Seq 11

编码HA-G15-gustducin的核酸序列，序列长度：1155，人工序列

Seq 12

HA-G15-gustducin蛋白氨基酸序列，序列长度：384，人工序列

Seq 13

HA-G15-gustducin正向引物，序列长度：59，人工序列

Seq 14

HA-G15-gustducin反向引物，序列长度：32，人工序列

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

颜克亮 陈微 陈兴 苏莉 翁俊 秦曦

<120> 一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白的真核细胞系及其制备方法

<130> RIE180080

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2550

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggcatc atcatcatca tcatggatcc atggggccca gggcaaagac catctcctcc 60

ctgttcttcc tcctatgggt cctggctgag ccggctgaga actcggactt ctacctgcct 120

ggggattacc tcctgggtgg cctcttctcc ctccatgcca acatgaaggg cattgttcac 180

cttaacttcc tgcaggtgcc catgtgcaag gagtatgaag tgaaggtgat aggctacaac 240

ctcatgcagg ccatgcgctt tgcggtggag gagatcaaca atgacagcag cctgctgcct 300

ggtgtgctgc tgggctatga gatcgtggat gtgtgctaca tctccaacaa tgtccagccg 360

gtgctctact tcctggcaca cgaggacaac ctccttccca tccaagagga ctacagtaac 420

tacatttccc gtgtggtggc tgtcattggc cctgacaact ccgagtctgt catgactgtg 480

gccaacttcc tctccctatt tctccttcca cagatcacct acagcgccat cagcgatgag 540

ctgcgagaca aggtgcgctt cccggctttg ctgcgtacca cacccagcgc cgaccaccac 600

atcgaggcca tggtgcagct gatgctgcac ttccgctgga actggatcat tgtgctggtg 660

agcagcgaca cctatggccg cgacaatggc cagctgcttg gcgagcgcgt ggcccggcgc 720

gacatctgca tcgccttcca ggagacgctg cccacactgc agcccaacca gaacatgacg 780

tcagaggagc gccagcgcct ggtgaccatt gtggacaagc tgcagcagag cacagcgcgc 840

gtcgtggtcg tgttctcgcc cgacctgacc ctgtaccact tcttcaatga ggtgctgcgc 900

cagaacttca ctggcgccgt gtggatcgcc tccgagtcct gggccatcga cccggtcctg 960

cacaacctca cggagctgcg ccacttgggc accttcctgg gcatcaccat ccagagcgtg 1020

cccatcccgg gcttcagtga gttccgcgag tggggcccac aggctgggcc gccacccctc 1080

agcaggacca gccagagcta tacctgcaac caggagtgcg acaactgcct gaacgccacc 1140

ttgtccttca acaccattct caggctctct ggggagcgtg tcgtctacag cgtgtactct 1200

gcggtctatg ctgtggccca tgccctgcac agcctcctcg gctgtgacaa aagcacctgc 1260

accaagaggg tggtctaccc ctggcagctg cttgaggaga tctggaaggt caacttcact 1320

ctcctggacc accaaatctt cttcgacccg caaggggacg tggctctgca cttggagatt 1380

gtccagtggc aatgggaccg gagccagaat cccttccaga gcgtcgcctc ctactacccc 1440

ctgcagcgac agctgaagaa catccaagac atctcctggc acaccatcaa caacacgatc 1500

cctatgtcca tgtgttccaa gaggtgccag tcagggcaaa agaagaagcc tgtgggcatc 1560

cacgtctgct gcttcgagtg catcgactgc cttcccggca ccttcctcaa ccacactgaa 1620

gatgaatatg aatgccaggc ctgcccgaat aacgagtggt cctaccagag tgagacctcc 1680

tgcttcaagc ggcagctggt cttcctggaa tggcatgagg cacccaccat cgctgtggcc 1740

ctgctggccg ccctgggctt cctcagcacc ctggccatcc tggtgatatt ctggaggcac 1800

ttccagacac ccatagttcg ctcggctggg ggccccatgt gcttcctgat gctgacactg 1860

ctgctggtgg catacatggt ggtcccggtg tacgtggggc cgcccaaggt ctccacctgc 1920

ctctgccgcc aggccctctt tcccctctgc ttcacaatct gcatctcctg tatcgccgtg 1980

cgttctttcc agatcgtctg cgccttcaag atggccagcc gcttcccacg cgcctacagc 2040

tactgggtcc gctaccaggg gccctacgtc tctatggcat ttatcacggt actcaaaatg 2100

gtcattgtgg taattggcat gctggccacg ggcctcagtc ccaccacccg tactgacccc 2160

gatgacccca agatcacaat tgtctcctgt aaccccaact accgcaacag cctgctgttc 2220

aacaccagcc tggacctgct gctctcagtg gtgggtttca gcttcgccta catgggcaaa 2280

gagctgccca ccaactacaa cgaggccaag ttcatcaccc tcagcatgac cttctatttc 2340

acctcatccg tctccctctg caccttcatg tctgcctaca gcggggtgct ggtcaccatc 2400

gtggacctct tggtcactgt gctcaacctc ctggccatca gcctgggcta cttcggcccc 2460

aagtgctaca tgatcctctt ctacccggag cgcaacacgc ccgcctactt caacagcatg 2520

atccagggct acaccatgag gagggactag 2550

<210> 2

<211> 849

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly His His His His His His Gly Ser Met Gly Pro Arg Ala Lys

1 5 10 15

Thr Ile Ser Ser Leu Phe Phe Leu Leu Trp Val Leu Ala Glu Pro Ala

20 25 30

Glu Asn Ser Asp Phe Tyr Leu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Gly Gly Leu

35 40 45

Phe Ser Leu His Ala Asn Met Lys Gly Ile Val His Leu Asn Phe Leu

50 55 60

Gln Val Pro Met Cys Lys Glu Tyr Glu Val Lys Val Ile Gly Tyr Asn

65 70 75 80

Leu Met Gln Ala Met Arg Phe Ala Val Glu Glu Ile Asn Asn Asp Ser

85 90 95

Ser Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Gly Tyr Glu Ile Val Asp Val Cys

100 105 110

Tyr Ile Ser Asn Asn Val Gln Pro Val Leu Tyr Phe Leu Ala His Glu

115 120 125

Asp Asn Leu Leu Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Ser Asn Tyr Ile Ser Arg

130 135 140

Val Val Ala Val Ile Gly Pro Asp Asn Ser Glu Ser Val Met Thr Val

145 150 155 160

Ala Asn Phe Leu Ser Leu Phe Leu Leu Pro Gln Ile Thr Tyr Ser Ala

165 170 175

Ile Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Arg Phe Pro Ala Leu Leu Arg

180 185 190

Thr Thr Pro Ser Ala Asp His His Ile Glu Ala Met Val Gln Leu Met

195 200 205

Leu His Phe Arg Trp Asn Trp Ile Ile Val Leu Val Ser Ser Asp Thr

210 215 220

Tyr Gly Arg Asp Asn Gly Gln Leu Leu Gly Glu Arg Val Ala Arg Arg

225 230 235 240

Asp Ile Cys Ile Ala Phe Gln Glu Thr Leu Pro Thr Leu Gln Pro Asn

245 250 255

Gln Asn Met Thr Ser Glu Glu Arg Gln Arg Leu Val Thr Ile Val Asp

260 265 270

Lys Leu Gln Gln Ser Thr Ala Arg Val Val Val Val Phe Ser Pro Asp

275 280 285

Leu Thr Leu Tyr His Phe Phe Asn Glu Val Leu Arg Gln Asn Phe Thr

290 295 300

Gly Ala Val Trp Ile Ala Ser Glu Ser Trp Ala Ile Asp Pro Val Leu

305 310 315 320

His Asn Leu Thr Glu Leu Arg His Leu Gly Thr Phe Leu Gly Ile Thr

325 330 335

Ile Gln Ser Val Pro Ile Pro Gly Phe Ser Glu Phe Arg Glu Trp Gly

340 345 350

Pro Gln Ala Gly Pro Pro Pro Leu Ser Arg Thr Ser Gln Ser Tyr Thr

355 360 365

Cys Asn Gln Glu Cys Asp Asn Cys Leu Asn Ala Thr Leu Ser Phe Asn

370 375 380

Thr Ile Leu Arg Leu Ser Gly Glu Arg Val Val Tyr Ser Val Tyr Ser

385 390 395 400

Ala Val Tyr Ala Val Ala His Ala Leu His Ser Leu Leu Gly Cys Asp

405 410 415

Lys Ser Thr Cys Thr Lys Arg Val Val Tyr Pro Trp Gln Leu Leu Glu

420 425 430

Glu Ile Trp Lys Val Asn Phe Thr Leu Leu Asp His Gln Ile Phe Phe

435 440 445

Asp Pro Gln Gly Asp Val Ala Leu His Leu Glu Ile Val Gln Trp Gln

450 455 460

Trp Asp Arg Ser Gln Asn Pro Phe Gln Ser Val Ala Ser Tyr Tyr Pro

465 470 475 480

Leu Gln Arg Gln Leu Lys Asn Ile Gln Asp Ile Ser Trp His Thr Ile

485 490 495

Asn Asn Thr Ile Pro Met Ser Met Cys Ser Lys Arg Cys Gln Ser Gly

500 505 510

Gln Lys Lys Lys Pro Val Gly Ile His Val Cys Cys Phe Glu Cys Ile

515 520 525

Asp Cys Leu Pro Gly Thr Phe Leu Asn His Thr Glu Asp Glu Tyr Glu

530 535 540

Cys Gln Ala Cys Pro Asn Asn Glu Trp Ser Tyr Gln Ser Glu Thr Ser

545 550 555 560

Cys Phe Lys Arg Gln Leu Val Phe Leu Glu Trp His Glu Ala Pro Thr

565 570 575

Ile Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Leu Ser Thr Leu Ala

580 585 590

Ile Leu Val Ile Phe Trp Arg His Phe Gln Thr Pro Ile Val Arg Ser

595 600 605

Ala Gly Gly Pro Met Cys Phe Leu Met Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala

610 615 620

Tyr Met Val Val Pro Val Tyr Val Gly Pro Pro Lys Val Ser Thr Cys

625 630 635 640

Leu Cys Arg Gln Ala Leu Phe Pro Leu Cys Phe Thr Ile Cys Ile Ser

645 650 655

Cys Ile Ala Val Arg Ser Phe Gln Ile Val Cys Ala Phe Lys Met Ala

660 665 670

Ser Arg Phe Pro Arg Ala Tyr Ser Tyr Trp Val Arg Tyr Gln Gly Pro

675 680 685

Tyr Val Ser Met Ala Phe Ile Thr Val Leu Lys Met Val Ile Val Val

690 695 700

Ile Gly Met Leu Ala Thr Gly Leu Ser Pro Thr Thr Arg Thr Asp Pro

705 710 715 720

Asp Asp Pro Lys Ile Thr Ile Val Ser Cys Asn Pro Asn Tyr Arg Asn

725 730 735

Ser Leu Leu Phe Asn Thr Ser Leu Asp Leu Leu Leu Ser Val Val Gly

740 745 750

Phe Ser Phe Ala Tyr Met Gly Lys Glu Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Glu

755 760 765

Ala Lys Phe Ile Thr Leu Ser Met Thr Phe Tyr Phe Thr Ser Ser Val

770 775 780

Ser Leu Cys Thr Phe Met Ser Ala Tyr Ser Gly Val Leu Val Thr Ile

785 790 795 800

Val Asp Leu Leu Val Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Ile Ser Leu Gly

805 810 815

Tyr Phe Gly Pro Lys Cys Tyr Met Ile Leu Phe Tyr Pro Glu Arg Asn

820 825 830

Thr Pro Ala Tyr Phe Asn Ser Met Ile Gln Gly Tyr Thr Met Arg Arg

835 840 845

Asp

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccaagcttg ccaccatggg gcatcatcat catcatcatg gatccatggg gcccagggca 60

aagacc 66

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagc tagtccctcc tcatggtgta gc 32

<210> 5

<211> 2592

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggactaca aggacgacga tgacaaggga tccatgctgg gccctgctgt cctgggcctc 60

agcctctggg ctctcctgca ccctgggacg ggggccccat tgtgcctgtc acagcaactt 120

aggatgaagg gggactacgt gctggggggg ctgttccccc tgggcgaggc cgaggaggct 180

ggcctccgca gccggacacg gcccagcagc cctgtgtgca ccaggttctc ctcaaacggc 240

ctgctctggg cactggccat gaaaatggcc gtggaggaga tcaacaacaa gtcggatctg 300

ctgcccgggc tgcgcctggg ctacgacctc tttgatacgt gctcggagcc tgtggtggcc 360

atgaagccca gcctcatgtt cctggccaag gcaggcagcc gcgacatcgc cgcctactgc 420

aactacacgc agtaccagcc ccgtgtgctg gctgtcatcg ggccccactc gtcagagctc 480

gccatggtca ccggcaagtt cttcagcttc ttcctcatgc cccaggtcag ctacggtgct 540

agcatggagc tgctgagcgc ccgggagacc ttcccctcct tcttccgcac cgtgcccagc 600

gaccgtgtgc agctgacggc cgccgcggag ctgctgcagg agttcggctg gaactgggtg 660

gccgccctgg gcagcgacga cgagtacggc cggcagggcc tgagcatctt ctcggccctg 720

gccgcggcac gcggcatctg catcgcgcac gagggcctgg tgccgctgcc ccgtgccgat 780

gactcgcggc tggggaaggt gcaggacgtc ctgcaccagg tgaaccagag cagcgtgcag 840

gtggtgctgc tgttcgcctc cgtgcacgcc gcccacgccc tcttcaacta cagcatcagc 900

agcaggctct cgcccaaggt gtgggtggcc agcgaggcct ggctgacctc tgacctggtc 960

atggggctgc ccggcatggc ccagatgggc acggtgcttg gcttcctcca gaggggtgcc 1020

cagctgcacg agttccccca gtacgtgaag acgcacctgg ccctggccac cgacccggcc 1080

ttctgctctg ccctgggcga gagggagcag ggtctggagg aggacgtggt gggccagcgc 1140

tgcccgcagt gtgactgcat cacgctgcag aacgtgagcg cagggctaaa tcaccaccag 1200

acgttctctg tctacgcagc tgtgtatagc gtggcccagg ccctgcacaa cactcttcag 1260

tgcaacgcct caggctgccc cgcgcaggac cccgtgaagc cctggcagct cctggagaac 1320

atgtacaacc tgaccttcca cgtgggcggg ctgccgctgc ggttcgacag cagcggaaac 1380

gtggacatgg agtacgacct gaagctgtgg gtgtggcagg gctcagtgcc caggctccac 1440

gacgtgggca ggttcaacgg cagcctcagg acagagcgcc tgaagatccg ctggcacacg 1500

tctgacaacc agaagcccgt gtcccggtgc tcgcggcagt gccaggaggg ccaggtgcgc 1560

cgggtcaagg ggttccactc ctgctgctac gactgtgtgg actgcgaggc gggcagctac 1620

cggcaaaacc cagacgacat cgcctgcacc ttttgtggcc aggatgagtg gtccccggag 1680

cgaagcacac gctgcttccg ccgcaggtct cggttcctgg catggggcga gccggctgtg 1740

ctgctgctgc tcctgctgct gagcctggcg ctgggccttg tgctggctgc tttggggctg 1800

ttcgttcacc atcgggacag cccactggtt caggcctcgg gggggcccct ggcctgcttt 1860

ggcctggtgt gcctgggcct ggtctgcctc agcgtcctcc tgttccctgg ccagcccagc 1920

cctgcccgat gcctggccca gcagcccttg tcccacctcc cgctcacggg ctgcctgagc 1980

acactcttcc tgcaggcggc cgagatcttc gtggagtcag aactgcctct gagctgggca 2040

gaccggctga gtggctgcct gcgggggccc tgggcctggc tggtggtgct gctggccatg 2100

ctggtggagg tcgcactgtg cacctggtac ctggtggcct tcccgccgga ggtggtgacg 2160

gactggcaca tgctgcccac ggaggcgctg gtgcactgcc gcacacgctc ctgggtcagc 2220

ttcggcctag cgcacgccac caatgccacg ctggcctttc tctgcttcct gggcactttc 2280

ctggtgcgga gccagccggg ctgctacaac cgtgcccgtg gcctcacctt tgccatgctg 2340

gcctacttca tcacctgggt ctcctttgtg cccctcctgg ccaatgtgca ggtggtcctc 2400

aggcccgccg tgcagatggg cgccctcctg ctctgtgtcc tgggcatcct ggctgccttc 2460

cacctgccca ggtgttacct gctcatgcgg cagccagggc tcaacacccc cgagttcttc 2520

ctgggagggg gccctgggga tgcccaaggc cagaatgacg ggaacacagg aaatcagggg 2580

aaacatgagt ga 2592

<210> 6

<211> 863

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Met Leu Gly Pro Ala

1 5 10 15

Val Leu Gly Leu Ser Leu Trp Ala Leu Leu His Pro Gly Thr Gly Ala

20 25 30

Pro Leu Cys Leu Ser Gln Gln Leu Arg Met Lys Gly Asp Tyr Val Leu

35 40 45

Gly Gly Leu Phe Pro Leu Gly Glu Ala Glu Glu Ala Gly Leu Arg Ser

50 55 60

Arg Thr Arg Pro Ser Ser Pro Val Cys Thr Arg Phe Ser Ser Asn Gly

65 70 75 80

Leu Leu Trp Ala Leu Ala Met Lys Met Ala Val Glu Glu Ile Asn Asn

85 90 95

Lys Ser Asp Leu Leu Pro Gly Leu Arg Leu Gly Tyr Asp Leu Phe Asp

100 105 110

Thr Cys Ser Glu Pro Val Val Ala Met Lys Pro Ser Leu Met Phe Leu

115 120 125

Ala Lys Ala Gly Ser Arg Asp Ile Ala Ala Tyr Cys Asn Tyr Thr Gln

130 135 140

Tyr Gln Pro Arg Val Leu Ala Val Ile Gly Pro His Ser Ser Glu Leu

145 150 155 160

Ala Met Val Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Phe Leu Met Pro Gln Val

165 170 175

Ser Tyr Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu Ser Ala Arg Glu Thr Phe Pro

180 185 190

Ser Phe Phe Arg Thr Val Pro Ser Asp Arg Val Gln Leu Thr Ala Ala

195 200 205

Ala Glu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Trp Asn Trp Val Ala Ala Leu Gly

210 215 220

Ser Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Gln Gly Leu Ser Ile Phe Ser Ala Leu

225 230 235 240

Ala Ala Ala Arg Gly Ile Cys Ile Ala His Glu Gly Leu Val Pro Leu

245 250 255

Pro Arg Ala Asp Asp Ser Arg Leu Gly Lys Val Gln Asp Val Leu His

260 265 270

Gln Val Asn Gln Ser Ser Val Gln Val Val Leu Leu Phe Ala Ser Val

275 280 285

His Ala Ala His Ala Leu Phe Asn Tyr Ser Ile Ser Ser Arg Leu Ser

290 295 300

Pro Lys Val Trp Val Ala Ser Glu Ala Trp Leu Thr Ser Asp Leu Val

305 310 315 320

Met Gly Leu Pro Gly Met Ala Gln Met Gly Thr Val Leu Gly Phe Leu

325 330 335

Gln Arg Gly Ala Gln Leu His Glu Phe Pro Gln Tyr Val Lys Thr His

340 345 350

Leu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Ala Phe Cys Ser Ala Leu Gly Glu Arg

355 360 365

Glu Gln Gly Leu Glu Glu Asp Val Val Gly Gln Arg Cys Pro Gln Cys

370 375 380

Asp Cys Ile Thr Leu Gln Asn Val Ser Ala Gly Leu Asn His His Gln

385 390 395 400

Thr Phe Ser Val Tyr Ala Ala Val Tyr Ser Val Ala Gln Ala Leu His

405 410 415

Asn Thr Leu Gln Cys Asn Ala Ser Gly Cys Pro Ala Gln Asp Pro Val

420 425 430

Lys Pro Trp Gln Leu Leu Glu Asn Met Tyr Asn Leu Thr Phe His Val

435 440 445

Gly Gly Leu Pro Leu Arg Phe Asp Ser Ser Gly Asn Val Asp Met Glu

450 455 460

Tyr Asp Leu Lys Leu Trp Val Trp Gln Gly Ser Val Pro Arg Leu His

465 470 475 480

Asp Val Gly Arg Phe Asn Gly Ser Leu Arg Thr Glu Arg Leu Lys Ile

485 490 495

Arg Trp His Thr Ser Asp Asn Gln Lys Pro Val Ser Arg Cys Ser Arg

500 505 510

Gln Cys Gln Glu Gly Gln Val Arg Arg Val Lys Gly Phe His Ser Cys

515 520 525

Cys Tyr Asp Cys Val Asp Cys Glu Ala Gly Ser Tyr Arg Gln Asn Pro

530 535 540

Asp Asp Ile Ala Cys Thr Phe Cys Gly Gln Asp Glu Trp Ser Pro Glu

545 550 555 560

Arg Ser Thr Arg Cys Phe Arg Arg Arg Ser Arg Phe Leu Ala Trp Gly

565 570 575

Glu Pro Ala Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly

580 585 590

Leu Val Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Val His His Arg Asp Ser Pro

595 600 605

Leu Val Gln Ala Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Phe Gly Leu Val Cys

610 615 620

Leu Gly Leu Val Cys Leu Ser Val Leu Leu Phe Pro Gly Gln Pro Ser

625 630 635 640

Pro Ala Arg Cys Leu Ala Gln Gln Pro Leu Ser His Leu Pro Leu Thr

645 650 655

Gly Cys Leu Ser Thr Leu Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ile Phe Val Glu

660 665 670

Ser Glu Leu Pro Leu Ser Trp Ala Asp Arg Leu Ser Gly Cys Leu Arg

675 680 685

Gly Pro Trp Ala Trp Leu Val Val Leu Leu Ala Met Leu Val Glu Val

690 695 700

Ala Leu Cys Thr Trp Tyr Leu Val Ala Phe Pro Pro Glu Val Val Thr

705 710 715 720

Asp Trp His Met Leu Pro Thr Glu Ala Leu Val His Cys Arg Thr Arg

725 730 735

Ser Trp Val Ser Phe Gly Leu Ala His Ala Thr Asn Ala Thr Leu Ala

740 745 750

Phe Leu Cys Phe Leu Gly Thr Phe Leu Val Arg Ser Gln Pro Gly Cys

755 760 765

Tyr Asn Arg Ala Arg Gly Leu Thr Phe Ala Met Leu Ala Tyr Phe Ile

770 775 780

Thr Trp Val Ser Phe Val Pro Leu Leu Ala Asn Val Gln Val Val Leu

785 790 795 800

Arg Pro Ala Val Gln Met Gly Ala Leu Leu Leu Cys Val Leu Gly Ile

805 810 815

Leu Ala Ala Phe His Leu Pro Arg Cys Tyr Leu Leu Met Arg Gln Pro

820 825 830

Gly Leu Asn Thr Pro Glu Phe Phe Leu Gly Gly Gly Pro Gly Asp Ala

835 840 845

Gln Gly Gln Asn Asp Gly Asn Thr Gly Asn Gln Gly Lys His Glu

850 855 860

<210> 7

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccaagcttg gtaccgacat ggactacaag gacgacgatg acaagggatc catgctgggc 60

cctgctgt 68

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccgctcgagt cactcatgtt tcccctgat 29

<210> 9

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人体(Homo sapiens)

<400> 9

atggcccgct cgctgacctg gcgctgctgc ccctggtgcc tgacggagga tgagaaggcc 60

gccgcccggg tggaccagga gatcaacagg atcctcttgg agcagaagaa gcaggaccgc 120

ggggagctga agctgctgct tttgggccca ggcgagagcg ggaagagcac cttcatcaag 180

cagatgcgga tcatccacgg cgccggctac tcggaggagg agcgcaaggg cttccggccc 240

ctggtctacc agaacatctt cgtgtccatg cgggccatga tcgaggccat ggagcggctg 300

cagattccat tcagcaggcc cgagagcaag caccacgcta gcctggtcat gagccaggac 360

ccctataaag tgaccacgtt tgagaagcgc tacgctgcgg ccatgcagtg gctgtggagg 420

gatgccggca tccgggcctg ctatgagcgt cggcgggaat tccacctgct cgattcagcc 480

gtgtactacc tgtcccacct ggagcgcatc accgaggagg gctacgtccc cacagctcag 540

gacgtgctcc gcagccgcat gcccaccact ggcatcaacg agtactgctt ctccgtgcag 600

aaaaccaacc tgcggatcgt ggacgtcggg ggccagaagt cagagcgtaa gaaatggatc 660

cattgtttcg agaacgtgat cgccctcatc tacctggcct cactgagtga atacgaccag 720

tgcctggagg agaacaacca ggagaaccgc atgaaggaga gcctcgcatt gtttgggact 780

atcctggaac taccctggtt caaaagcaca tccgtcatcc tctttctcaa caaaaccgac 840

atcctggagg agaaaatccc cacctcccac ctggctacct atttccccag tttccagggc 900

cctaagcagg atgctgaggc agccaagagg ttcatcctgg acatgtacac gaggatgtac 960

accgggtgcg tggacggccc cgagggcagc aagaagggcg cacgatcccg acgcctcttc 1020

agccactaca catgtgccac agacacacag aacatccgca aggtcttcaa ggacgtgcgg 1080

gactcggtgc tcgcccgcta cctggacgag atcaacctgc tgtga 1125

<210> 10

<211> 1065

<212> DNA

<213> 人体(Homo sapiens)

<400> 10

atgggaagtg gaattagttc agagagcaag gagtcagcca aaagatcaaa agaactggag 60

aaaaagcttc aggaggatgc tgagcgagat gcaagaaccg taaagctgct actattagga 120

gcaggagaat ctgggaaaag tactattgtt aaacaaatga agatcatcca taagaatggt 180

tacagtgagc aagaatgcat ggagttcaaa gcagtaattt acagtaatac attgcaatcc 240

atcctagcta ttgtgaaagc catgactacc cttggaattg attatgtaaa tcccagaagt 300

gcagaggacc aacgacaact ttatgcaatg gcaaataccc tggaagatgg tggcatgaca 360

cctcaactgg ctgaggtaat aaaacggctg tggagagatc caggaattca ggcctgcttt 420

gaaagggcat ctgaatatca gctcaatgac tcagcagctt actaccttaa tgatttagat 480

agaataacag catctgggta tgtgccaaat gaacaagatg ttctccattc tcgagtgaaa 540

acgactggaa tcattgaaac tcaattctcc tttaaagact tgcacttcag gatgtttgat 600

gtaggtggac agagatctga gagaaagaag tggattcact gctttgaagg agttacatgc 660

attatatttt gtgctgcact tagtgcctat gacatggtcc tcgtggaaga cgaagaagtg 720

aatagaatgc atgaaagcct tcacctgttc aacagtatct gtaatcacaa gtatttttca 780

acaacctcca ttgtcctgtt cctcaacaaa aaagatatct ttcaagaaaa ggtaaccaag 840

gtgcatctta gtatctgctt tccagaatac actgggccaa atacatttga agatgcagga 900

aactacatca agaaccagtt tctagacctg aatttaaaaa aagaagataa ggaaatttat 960

tcccacatga cctgtgctac tgacacccaa aatgtcaagt ttgtgtttga cgcagttaca 1020

gatataataa tcaaagagaa tctaaaagac tgtgggcttt tctaa 1065

<210> 11

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtacccat acgatgttcc agattacgct atggcccgct cgctgacctg gcgctgctgc 60

ccctggtgcc tgacggagga tgagaaggcc gccgcccggg tggaccagga gatcaacagg 120

atcctcttgg agcagaagaa gcaggaccgc ggggagctga agctgctgct tttgggccca 180

ggcgagagcg ggaagagcac cttcatcaag cagatgcgga tcatccacgg cgccggctac 240

tcggaggagg agcgcaaggg cttccggccc ctggtctacc agaacatctt cgtgtccatg 300

cgggccatga tcgaggccat ggagcggctg cagattccat tcagcaggcc cgagagcaag 360

caccacgcta gcctggtcat gagccaggac ccctataaag tgaccacgtt tgagaagcgc 420

tacgctgcgg ccatgcagtg gctgtggagg gatgccggca tccgggcctg ctatgagcgt 480

cggcgggaat tccacctgct cgattcagcc gtgtactacc tgtcccacct ggagcgcatc 540

accgaggagg gctacgtccc cacagctcag gacgtgctcc gcagccgcat gcccaccact 600

ggcatcaacg agtactgctt ctccgtgcag aaaaccaacc tgcggatcgt ggacgtcggg 660

ggccagaagt cagagcgtaa gaaatggatc cattgtttcg agaacgtgat cgccctcatc 720

tacctggcct cactgagtga atacgaccag tgcctggagg agaacaacca ggagaaccgc 780

atgaaggaga gcctcgcatt gtttgggact atcctggaac taccctggtt caaaagcaca 840

tccgtcatcc tctttctcaa caaaaccgac atcctggagg agaaaatccc cacctcccac 900

ctggctacct atttccccag tttccagggc cctaagcagg atgctgaggc agccaagagg 960

ttcatcctgg acatgtacac gaggatgtac accgggtgcg tggacggccc cgagggcagc 1020

aatttaaaaa aagaagataa ggaaatttat tcccacatga cctgtgctac tgacacccaa 1080

aatgtcaagt ttgtgtttga cgcagttaca gatataataa tcaaagagaa tctaaaagac 1140

tgtgggcttt tctaa 1155

<210> 12

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Met Ala Arg Ser Leu Thr

1 5 10 15

Trp Arg Cys Cys Pro Trp Cys Leu Thr Glu Asp Glu Lys Ala Ala Ala

20 25 30

Arg Val Asp Gln Glu Ile Asn Arg Ile Leu Leu Glu Gln Lys Lys Gln

35 40 45

Asp Arg Gly Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Glu Ser Gly

50 55 60

Lys Ser Thr Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile Ile His Gly Ala Gly Tyr

65 70 75 80

Ser Glu Glu Glu Arg Lys Gly Phe Arg Pro Leu Val Tyr Gln Asn Ile

85 90 95

Phe Val Ser Met Arg Ala Met Ile Glu Ala Met Glu Arg Leu Gln Ile

100 105 110

Pro Phe Ser Arg Pro Glu Ser Lys His His Ala Ser Leu Val Met Ser

115 120 125

Gln Asp Pro Tyr Lys Val Thr Thr Phe Glu Lys Arg Tyr Ala Ala Ala

130 135 140

Met Gln Trp Leu Trp Arg Asp Ala Gly Ile Arg Ala Cys Tyr Glu Arg

145 150 155 160

Arg Arg Glu Phe His Leu Leu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Leu Ser His

165 170 175

Leu Glu Arg Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Val Pro Thr Ala Gln Asp Val

180 185 190

Leu Arg Ser Arg Met Pro Thr Thr Gly Ile Asn Glu Tyr Cys Phe Ser

195 200 205

Val Gln Lys Thr Asn Leu Arg Ile Val Asp Val Gly Gly Gln Lys Ser

210 215 220

Glu Arg Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu Asn Val Ile Ala Leu Ile

225 230 235 240

Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Glu Tyr Asp Gln Cys Leu Glu Glu Asn Asn

245 250 255

Gln Glu Asn Arg Met Lys Glu Ser Leu Ala Leu Phe Gly Thr Ile Leu

260 265 270

Glu Leu Pro Trp Phe Lys Ser Thr Ser Val Ile Leu Phe Leu Asn Lys

275 280 285

Thr Asp Ile Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr Ser His Leu Ala Thr Tyr

290 295 300

Phe Pro Ser Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp Ala Glu Ala Ala Lys Arg

305 310 315 320

Phe Ile Leu Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr Thr Gly Cys Val Asp Gly

325 330 335

Pro Glu Gly Ser Asn Leu Lys Lys Glu Asp Lys Glu Ile Tyr Ser His

340 345 350

Met Thr Cys Ala Thr Asp Thr Gln Asn Val Lys Phe Val Phe Asp Ala

355 360 365

Val Thr Asp Ile Ile Ile Lys Glu Asn Leu Lys Asp Cys Gly Leu Phe

370 375 380

<210> 13

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgcttcgaaa tgtacccata cgatgttcca gattacgcta tggcccgctc gctgacctg 59

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gctctagatt agaaaagccc acagtctttt ag 32

Claims (10)

1.一种稳定共表达重组人源甜味受体蛋白His-T1R2和FLAG-T1R3的真核细胞系，其特征在于：

(1)该真核细胞系稳定携带编码带有His标签的人源甜味受体蛋白T1R2(简称为His-T1R2)的核酸序列和编码带有FLAG标签的人源甜味受体蛋白T1R3(简称为FLAG-T1R3)的核酸序列；

(2)该真核细胞系由人胚胎肾细胞HEK293制备得到。

2.如权利要求1所述的真核细胞系的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)构建表达His-T1R2的重组质粒；构建表达FLAG-T1R3的重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的两种重组质粒共同转染进入真核细胞中，并通过药物抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆体，再通过蛋白质免疫印迹技术检测，优选出能够同时表达His-T1R2和FLAG-T1R3的细胞克隆体；

(3)将步骤(2)中得到的能够同时表达His-T1R2和FLAG-T1R3的细胞克隆体扩增培养，即得到稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3的真核细胞系。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的两种重组质粒能够在真核细胞中分别表达His-T1R2和FLAG-T1R3；

步骤(2)中所述的转染方法为电穿孔转染法，所述真核细胞为人胚胎肾细胞HEK293，所述抗性筛选所用的药物为G418，所述G418为遗传霉素，是一种氨基糖苷类抗生素。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达His-T1R2的重组质粒的制备方法包括以下步骤：

(1)将编码人源甜味受体蛋白T1R2的编码区核酸序列与编码His标签的核酸序列连接，得到表达His-T1R2的核酸序列；

(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达His-T1R2的重组质粒。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达FLAG-T1R3重组质粒的制备方法包括以下步骤：

(1)将编码人源甜味受体蛋白T1R3的编码区核酸序列与编码FLAG标签的核酸序列连接，得到表达FLAG-T1R3的核酸序列；

(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达FLAG-T1R3的重组质粒。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的真核表达载体为pcDNA3.1(+)。

8.一种在真核细胞中同时表达His-T1R2、FLAG-T1R3和带有HA标签的重组人源嵌合体蛋白G15-gustducin44的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)构建表达带有HA标签的重组人源嵌合体蛋白G15-gustducin44(简称为HA-G15-gustducin44)的重组质粒；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染进入稳定共表达His-T1R2和FLAG-T1R3的真核细胞系中，在真核细胞中同时表达三种重组人源蛋白，即His-T1R2、FLAG-T1R3和HA-G15-gustducin44。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的重组质粒能够在真核细胞中表达HA-G15-gustducin44；

步骤(2)中所述的转染方法为电穿孔转染法，所述的真核细胞系为权利要求1所述的真核细胞系。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述表达HA-G15-gustducin44重组质粒的制备方法的步骤为：

(1)将编码人源嵌合体蛋白G15-gustducin44的核酸序列与编码HA标签的核酸序列连接，得到表达HA-G15-gustducin44的核酸序列；

(2)将步骤(1)得到的核酸序列插入到真核表达载体的多克隆酶切位点处，即得到所述表达HA-G15-gustducin44的重组质粒；所述的真核表达载体为pLVX-Puro。